Utilizando os ensaios aqui apresentados, a diferença no fenótipo entre as cepas de rotavírus pode ser avaliada, onde cepas únicas são isoladas. Especificamente, a alteração fenotípica de cepas resistentes a desinfetantes de rotavírus é investigada. Para obter saídas quantitativas claras usando o ensaio da placa, é fundamental selecionar uma combinação apropriada de cepa de rotavírus e soro, na qual o rotavírus está bem adaptado ao soro.
Demonstrando o procedimento será Syun-suke Kadoya, um estudante de doutorado do meu laboratório. Remova um CrioTube contendo linhas celulares MA104 do recipiente de nitrogênio líquido. Coloque o CrioTube em um banho de água a 37 graus Celsius para descongelar as células.
Adicione um mililitro da suspensão celular a 20 mililitros do meio contendo soro em um frasco T75. Incubar o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por dois a três dias. Uma vez que o monocamado de célula atinja 80% de confluência, remova o supernatante e lave as células duas vezes com cinco mililitros de PBS de 1X Dulbecco.
Adicione quatro mililitros de 0,05% trypsin-EDTA ao frasco, e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos para separar as células do frasco. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 190 g por cinco minutos. Descarte o supernasce e resuspenque as células pelotas em um mililitro de meio contendo soro.
Em seguida, diluir as células resuspended 100 vezes com o meio. Adicione três mililitros da suspensão da célula diluída a cada poço de uma placa de seis poços para o ensaio da placa. Adicione um mililitro da suspensão celular diluída a cada poço de uma placa de 24 poços para o ensaio de ligação celular.
Incubar as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 vapor subsaturado por dois ou três dias. Transfira um tubo contendo um mililitro da suspensão do vírus em meio livre de soro do armazenamento a menos 80 graus Celsius para um banho de água de 37 graus Celsius para descongelar. Adicione um micrograma por microfeitor de trippsina do pâncreas suíno a um mililitro da suspensão do vírus e, em seguida, vórtice.
Incubar a suspensão do vírus a 37 graus Celsius e 5% de CO2 subsaturado vapor por 30 minutos. Diluir a suspensão ativada do vírus com meio livre de soro para ajustar a multiplicidade de infecção, ou MOI, para 0,1 pfu por célula. Adicione um mililitro da suspensão do vírus diluído às células MA104 em um frasco T75 três dias após o revestimento celular.
Incubar as células com vírus a 37 graus Celsius por uma hora, agitando suavemente o frasco a cada 15 minutos. Em seguida, adicione 30 mililitros de um meio livre de soro contendo quatro microgramas por mililitro de trippsina do pâncreas suíno ao frasco. Incubar o frasco a 37 graus Celsius e 5% de CO2 subsaturado vapor.
Colete um mililitro do supernacido no frasco a zero, seis, 12, 18, 24 e 36 horas após infecção, e substitua o supernacido nos tipos de 1,5 mililitro usando uma pipeta. Conduza um ciclo de congelamento dentro de 15 minutos a menos 80 graus Celsius seguido de um derretimento de 15 minutos em um banho de água a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugar os tubos a 12.600 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Pegue o supernatante. Filtre o supernascer com um filtro destilado de 0,2 mícnico para remover a fração celular. Armazene o supernaspeio a menos 80 graus Celsius até aplicá-lo no ensaio da placa para medir o titulador do vírus.
Quando estiver pronto para realizar o ensaio da placa, coloque os tubos contendo o supernanato coletado em um banho de água a 37 graus Celsius. Adicione trippsina a um mililitro de amostra diluída de 10 vezes e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante esta incubação de 30 minutos, lave cuidadosamente as células MA104 em uma placa de seis poços com dois mililitros de PBS 1X depois de remover o meio contendo soro.
Diluir em série as amostras incubadas com meio livre de soro e inocular um mililitro da amostra diluída em cada poço. Incubar a placa por 90 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 vapor subsaturado, agitando suavemente a placa a cada 15 minutos. Após a incubação, remova o inóculo da placa de seis poços.
Adicione quatro microgramas por mililitro de trippsina ao meio preparado. Suavemente, mas imediatamente adicione três mililitros do meio misturado com gel de agarose a cada poço. Deixe o gel de agarose solidificar à temperatura ambiente por mais de 10 minutos.
Em seguida, incubar a placa por dois dias a 37 graus Celsius e 5% de CO2 vapor subsaturado. Em seguida, adicione um mililitro de solução vermelha neutra de 0,015% diluída com PBS 1X para cada poço, e incubar com as mesmas condições. Retire o corante após três horas e continue incubando por um dia.
No dia seguinte, conte o número de placas em cada poço e calcule o pfu por mililitro. Verifique cuidadosamente a confluência celular antes do ensaio da placa para garantir os números da placa. Para o ensaio de ligação celular, adicione um micrograma por microfeitor de trippsina de um pâncreas suíno a um mililitro da suspensão do vírus e, em seguida, vórtice.
Diluir a suspensão do vírus com meio livre de soro para ajustar o MOI a um pfu por célula. Lave as células MA104 duas vezes em uma placa de 24 poços com um mililitro de soro fisiológico tris-tamponado. Agora inocular as células com 100 microliters de suspensão do vírus diluído em cada poço da placa de 24 poços.
Incubar a placa a quatro graus Celsius por 90 minutos com agitação suave a cada 15 minutos. Remova o inóculo do vírus e lave as células duas vezes com um mililitro de soro fisiológico com três tampões. Para extrair o RNA de dupla renda do rotavírus, adicione 140 microliters de 1X PBS e 560 microliters do tampão de extração de RNA a cada poço.
Misture adequadamente com uma pipeta até que a neblina das células no buffer não seja vista. Depois de recuperar o RNA de duplar encalhada, de acordo com o protocolo do fabricante, coloque os tubos de 1,5 mililitro, contendo o extrato de RNA de duplar, em um bloco de calor a 95 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar o RNA. Em seguida, coloque imediatamente os tubos no gelo e incubar por mais de dois minutos.
Sintetize o cDNA usando um kit de transcrição reversa. Adicione quatro microliters de solução deRNA viral desnaturada a um tubo PCR contendo 16 microliters de mistura de reação, e misture-o cuidadosamente com uma pipeta para não gerar bolhas. Depois de girar os tubos, realize a transcrição reversa com um termociclador.
Para PCR quantitativo, use uma sonda de inserção de saciador visando a região 963 a 1.049 do segmento de genoma NSP3 de rotavírus. Diluir o plasmídeo padrão com água de grau PCR, e proceder a fazer a mistura mestre para PCR quantitativo. Adicione 20 microliters da mistura mestre aos poços de uma placa PCR de 96 poços.
Em seguida, misture cinco microliters de amostras de cDNA ou cinco microliters do plasmídeo padrão por pipetação 10 vezes. Realizar PCR quantitativo de acordo com as condições do protocolo de texto. Finalmente, calcule o genoma rotavírus ligado à superfície celular MA104, conforme descrito no protocolo de texto.
Mostrado aqui é uma curva de crescimento do rotavírus. Aplicando o método menos quadrado a um modelo Gompertz modificado, estima-se que a taxa de crescimento específica seja de 0,197, e o período de defasagem é estimado em 6,61 horas. O titulador relativo do vírus na fase estacionária do título inicial é 3.15.
Dos seis clones de rotavírus testados, os valores estimados da taxa de crescimento específica variaram de 0,19 a 0,27. Esses valores estimados são confiáveis porque o coeficiente de valores de determinação no encaixe do modelo é superior a 0,98. O resultado do ensaio de ligação celular é exibido como eficiência de ligação, que é a razão de partículas virais ligadas às presentes no inóculo.
Nossos virions RV ligando-se a superfícies celulares são cerca de 10.000 cópias por mililitro com uma eficiência de ligação de cerca de 1% ao usar uma placa de 24 poços para o ensaio de ligação celular. Uma vez que as células cultivadas são sensíveis a estresses físicos, tome cuidado para derramar o tampão e ágar suavemente, mas rapidamente. Essencialmente, um novo sistema para os vírus foi introduzido.
Usando este sistema, podemos avaliar a capacidade real de ligação celular e taxa de crescimento específica com instrumentos. Nosso protocolo é vantajoso em medir o traço fenotípico. Ao verificar diferentes cepas recém-emergentes, você pode ajudar a avaliar suas novas vacinas para os vírus.
Os vírus são designados como patógenos BSL-2, então você precisará preparar salas experimentais BSL-2 para realizar este procedimento.
