Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos de pesquisa de neurociência e medicina oral tradicional sobre a triagem de compostos naturais neuroprotetores relevantes para o Modelo. A principal vantagem dessa técnica é que a maior produtibilidade do volume de infecção está de acordo com a dose isquêmica de tempo. A demonstração visual deste método é fundamental, pois é típico inserir um implemento muito fino na artéria cerebelar média usando um microscópio estéril.
Demonstrando o procedimento será Se-Eun Lee, uma aluna estudando no meu laboratório. Para preparar o extrato de Glycyrrhizae Radix et Rhizome, ou GRex, adicione primeiro 200 gramas de Glycyrrhizae Radix et Rhizome, ou GR, a dois litros de metanol para uma incubação de cinco dias à temperatura ambiente. No final da incubação, coe a solução através de papel filtro de 0,26 milímetros de espessura com um tamanho de poros de cinco milímetros.
Adicione o resíduo GR a um litro de metanol fresco e filtre a solução novamente. Combine os dois filtros e coe-os através de um novo pedaço de papel filtro. Em seguida, concentre o extrato sob vácuo antes de secar congelante para produzir GRex.
Para preparar o GRex para administração, dissolva o produto liofilizado em dimetilsulfoxida e dilua a mistura com soro fisiológico de 0,9%. Em seguida, filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,45 micrômetros, e ajustar a concentração final de DMSO para menos de 5%Para configurar um modelo de oclusão da artéria cerebral média do rato, ou MCAO, confirmar a falta de resposta ao estímulo da cauda em um anesthetizado de seis semanas de idade de 22 a 25 gramas macho C57BL/6 mouse, e colocar o mouse em um cobertor de 36,5 graus Celsius de temperatura corporal Celsius, conectado a um termômetro. Depois de remover todo o cabelo do peito e pescoço do rato, raspando e depilatory creme, coloque o rato sob um estereóscópio e faça uma incisão de pele de dois centímetros no centro do pescoço.
Isole cuidadosamente a artéria carótida comum esquerda, a artéria carótida externa e o ramo da artéria carótida interna dos tecidos conjuntivos circundantes, e use uma sutura de seda 4.0 para ligar a artéria carótida externa e a artéria carótida comum com um nó meio-hitch para bloquear temporariamente o fluxo sanguíneo na artéria carótida interna. Insira uma sutura de 0,1 a 0,12 milímetros de espessura de 11 milímetros de silicone revestido de silicone 8,0-monofilament 4.0-seda através da artéria carótida interna até a origem da artéria cerebral média esquerda, e use um medidor de fluxo Doppler laser para medir a diminuição da artéria relativa do fluxo sanguíneo cerebral. Fixar o filamento inserido no vaso sanguíneo por duas horas enquanto a artéria cerebral é ocluída.
No final do período de oclusão, retire cuidadosamente o filamento para restaurar o fluxo sanguíneo durante 22 horas de reperfusão. E use suturas de 3,0 de seda para suturar a pele em cinco lugares com dois nós meio engate. Em seguida, devolva o rato à sua gaiola para recuperação anestésico.
Uma hora após o término da reperfusão, administre 300 miligramas por quilograma de peso corporal GRex aos animais experimentais, apenas por gavage oral. 24 Horas após o início da MCAO, faça uma incisão na pele média da cabeça de cada animal experimental, e quebre os ossos parietal com fórceps angulares, enquanto descasca a dura-mãe. Isole cuidadosamente o cérebro do crânio, e use uma matriz cerebral de camundongos para cortar o tecido excisado em seções de um milímetro de espessura.
Manche as seções por 17 minutos em solução 2%TTC, de acordo com os protocolos padrão. E corrigir as seções em 10% de formalina por pelo menos 2 horas antes de imaginar as amostras com uma câmera digital. Em seguida, analise e quantifique a área de infarto cerebral de cada seção usando ImageJ.
No ponto de tempo experimental apropriado pós-MCAO, perfume cada animal experimental eutanizado transcardialmente com 10 mililitros de PBS, seguido por 10 mililitros de 4%paraformaldeído. Depois de isolar os cérebros como apenas demonstrado, mergulhe os órgãos colhidos em 10 mililitros de 30% de sacarose durante a noite. Na manhã seguinte, incorporou as amostras de tecido cerebral no composto de temperatura de corte ideal.
E corte os tecidos coronalmente em seções de 15 micrômetros de espessura em um cirostat. Monte as seções em lâminas de vidro e submerse as seções em 80% de etanol por 1 minuto. Para coloração de H&E, rotule as amostras com solução de Hematoxilina por 5 minutos, seguidas por dois mergulhos em álcool 1%ácido.
Em seguida, mergulhe os slides na solução de carbonato de lítio saturado por 30 segundos, seguido de uma lavagem de 30 segundos na água da torneira, e 30 segundos de contra-coloração com solução Eosin. Remova o excesso de solução de Eosin com uma lavagem de água da torneira e desidrate os slides com imersões ascendentes de um minuto em 95 e depois 100% etanol. Em seguida, dobre os slides, limpe-os em xileno por pelo menos 10 minutos e monte as tampas com meio de montagem.
Para coloração violeta cresyl, coloque os slides tratados com 80% de etanol em um aquecedor de slides por pelo menos uma hora, seguido de imersão em 50% de etanol diluído com clorofórmio durante a noite. Na manhã seguinte, colori os slides com 0,1%de cresyl violeta por 10 minutos em um forno seco de 40 graus Celsius, seguido de uma desidratação em 95% de etanol por 30 minutos, e duas imersões de 100% de etanol de cinco minutos. Em seguida, limpe os slides duas imersões de xileno de cinco minutos, seguidas de secagem de ar.
Em seguida, monte os slides com meio de montagem para visualização por microscopia leve. Em grupos normais operados por farsa, não é observado nenhum infarto cerebral;enquanto no controle, animais MCAO não tratados, uma gama relativamente ampla de áreas danificadas é observada. Em camundongos modelos tratados com 300 miligramas por quilograma, observa-se uma redução estatisticamente significativa no tecido danificado.
A análise histológica das seções de H&E e tecido manchado de cresílico fornece um índice de sobrevivência celular. De fato, as intensidades de coloração de H&E e cresyl violeta diminuem significativamente no controle, grupo MCAO não tratado em relação ao grupo normal operado por farsa. Os animais tratados com GRex, por outro lado, apresentam uma maior integridade histológica, implicando menos morte celular neuronal do que ambos os grupos controlados, não tratados e operados por farsas, sugerindo um potente efeito neuroprotetor do extrato contra lesão cerebral induzida pela isquemia.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar o fluxo sanguíneo relativo cerebelar durante este período. E condutores de processos com muito cuidado para minimizar danos às camadas endoteliais do
