Este protocolo é significativo porque a otimização do desenvolvimento e transferência de protocolos de imunofluorescência multiplex é complexa e desafiadora. Para muitos laboratórios, o dedo do dedo do dedo de um protocolo otimizado é inestimável. A imunofluorescência multiespectral nos permite avaliar tanto a localização quanto a identidade de vários tipos celulares dentro e ao redor do tumor.
Esta é uma poderosa combinação de informações em estudos de oncologia imunológica. O uso mais atraente para imunofluorescência multiplex é a oncologia imunológica. Mas a capacidade de examinar vários tipos de células imunes no setu pode ser aproveitada em todas as terapias autoimunes e inflamatórias.
Conhecer a localização e o fenótipo das células imunolíngues dentro e ao redor de células solidítures é uma resposta prognóstica e previsível à imunoterapia específica do tumor. A otimização e validação do protocolo são etapas-chave que não devem ser apressadas. Novos desenvolvedores devem se familiarizar com os novos tipos de artefatos associados à imagem multiespectral.
Para localizar o protocolo base multi-plex, pré-o precarregue-o no stainer automatizado. Filtrar para todos'em vez de preferir na tela do protocolo. Antes de fazer alterações, salve o protocolo original e clique na guia protocolos e clique com o botão direito do mouse em Opal 6 Multiplex para selecionar cópia.
Altere o nome para 7 Multiplex Protocol 1'in the new window e selecione a guia associada ao dispositivo correto. Combine o protocolo na tabela suplementar S1'e clique em adicionar reagente para adicionar uma etapa de inibição de paroxidies de dez minutos, selecionando o inibidor de peroxidase como o reagente. Confirme que as etapas de bloqueio utilizam um tampão de bloqueio do inibidor de quinase proteica, que cada anti-corpo primário refere-se ao reagente apropriado, que os passos anti-corpo secundários utilizam um polímero peroxidase de rabanete e que o dapi espectral fornecido com o kit de automação multiespectral é utilizado.
Certifique-se de que o protocolo contém o inibidor de peroxidase, seguido por seis colorações sequenciais que executam cada uma contendo uma etapa de bloqueio de proteínas, um anti-corpo primário, um anti-corpo secundário, um piso de tyramida e, em seguida, recuperação de antígeno para remover os anticorpos. Para adicionar os controles de queda, copie o nome 7 Multiplex Protocol 1'name e altere-o para 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Altere o reagente anti-corpo CD68 para Mouse IgG e salve o protocolo.
Em seguida, crie mais seis novos protocolos, um para cada controle de queda e outro para o controle iso-tipo completo da mesma maneira. Faça um protocolo de controle de queda para cada alvo da mesma forma que eu mostrei aqui. Para preparar um kit de detecção de pesquisa, preencha o recipiente aberto de 30 mililitros marcado para solução salina tamponada com 1X tris tamponado e coloque o recipiente na posição mais distante da alça no Multiplex Research Kit 1.
Rotule dois recipientes abertos de 30 mililitros muli-spectral block'e multi-espectral secundário, e encha o recipiente de bloco espectral mutli com 30 mililitros de diluente de anticorpos tampão de bloqueio do Kit de Coloração Multi-Espectral. Encha o recipiente secundário multiespectral com 30 mililitros de polímero de anticorpos anti-rabíferos anti-rato do Kit de Coloração Multiespectral e adicione 600 microliters de diluente de anticorpos a cada um dos dez recipientes abertos de 7 mililitros. Em seguida, adicione o anticorpo primário concentrado aos tubos apropriados nos volumes indicados na tabela e misture por tubulação suave.
Adicione 3 mililitros de água dupla destilada, além de 12 gotas de dapi espectral em um recipiente aberto de 7 mililitros, e 3 mililitros de bloco peroxidase em um segundo recipiente aberto de 7 mililitros. Suspenda-se cada piso liathalizado com 75 microlitadores de sulfóxido de dimetil e misture por pipetação. Em seguida, armazene os estoques do piso de amplificação do sinal Tyramide a 4 graus Celsius até ficar pronto.
Enquanto prepara as diluições individuais do piso TSA. Registre todos os reagentes no sutista automático e coloque cada recipiente em um rack de reagente e carregue todos os reagentes no colorador automatizado. O stainer detectará a presença e confirmará o volume de cada reagente.
Uma vez que todos os reagentes tenham sido carregados, ative o protocolo para funcionar durante a noite. No final do procedimento de coloração, monte as amostras com deslizamentos de cobertura e carregue as amostras no Scanner de Plataforma de Imagem Multi-Espectral para digitalização. Quando todas as amostras tiverem sido digitalizadas, as imagens serão formatadas como arquivos qptiff.
Abra um programa de software de análise qptiff apropriado e clique em deslizar de carga para abrir uma varredura de slides de cinco filtros inteiros do slide de interesse. Faça login e use a ferramenta de selo para selecionar cinco regiões para imagens multiespectrais. Em Select para:selecione Aquisição'under Size in Fields:selecione 1x1 e em Resolução de campo'select 0.5 micrômetros 20x.
Com base nesta coloração de citokeratina, selecione várias regiões com tecido tumoral positivo de citokeratina, e tecido estromal negativo de citokeratina a ser imageado a partir do exame geral. Quando todas as imagens multiespectrais tiverem sido selecionadas, mude para o software Vectra e altere a tarefa de digitalizar para imagens multiespectrais para cada slide. Em seguida, clique em digitalizar para realizar a coleta de imagens multiespectrais.
Quando a aquisição de imagens multiespectrais estiver concluída, use o software espectral de não-mistura para abrir arquivos dentro da pasta de imagem multiespectral. Em formato de imagem'selecione multi-espectral'Em formato de amostra'selecione fluorescência'e em Spectral Library Source'select inForm'Para selecionar os andares, selecione e carregue todos os seis andares e dapi dos slides da biblioteca de amostras e clique em preparar todos. O software de não-mistura espectral executará a descomprturação espectral em todas as imagens abertas usando os perfis espectrais fornecidos.
Identifique e anote o perfil espectral auto-fluorescente. Certifique-se de verificar o recurso auto-fluorescente para garantir que ele seja completamente capturado no canal auto-fluorescente após a não mistura e teste diferentes amostras até que seja removido de forma aceitável. Em seguida, avalie o padrão de coloração contra as manchas únicas cromogênicas do mesmo alvo em lâminas sequenciais do mesmo tecido com um patologista.
Para avaliar a intensidade da fluorescência de cada canal, utilize a ferramenta de contagem para levantamento das imagens abertas. Em seguida, retorne ao protocolo de coloração e ajuste a concentração tsa para atender a quaisquer contagens normalizadas que excedam ou não atinjam o intervalo aceitável. Nesta análise representativa, o tecido das amígdalas demonstrou uma coloração de citoquetatina claramente definida dentro da superfície das amígdalas, epitélio escânico sem fundo no tecido linfoide com cytokeratina e mancha PDL-1 aparente no epítélio reticulado das criptadas.
Os centros germinais foliculares eram facilmente reconhecíveis e ricos em linfócitos positivos ki-67. Os macrófagos presentes nos centros germinos foram identificados por sua expressão CD-68 com alguns macrófagos também observados fora do centro germinal. Linfócitos manchados de CD-8 com distribuição de células T e expressão PD-1 fortemente manchados pequenos linfócitos agrupados na periferia do centro germinal, bem como espalhados por toda a região interfollicular.
Depois que o padrão de coloração esperado foi confirmado no controle do tecido das amígdalas, a mesma coloração poderia então ser avaliada em uma amostra de câncer de pulmão. Controles negativos de isótipo e controles de queda também devem ser avaliados;não apenas para a detecção de fundo e auto-fluorescência, mas também para efeitos guarda-chuva e sangramento espectral. Os controles de queda são importantes para avaliar artefatos potenciais na coloração devido ao método de imunofluorescência multi-plex durante a otimização de um novo painel multi-plex.
Cada controle de queda deve mostrar o mesmo padrão de coloração que o painel multi-plex completo, exceto para o único anticorpo primário que deve ser removido em cada controle específico. O perfil imunográfico com imunofluorescência multiespectral permite a estratificação de tumores e regiões por critérios imunológicos que podem então ser investigados por estudos genômicos, transcriômicos e proteômicos massivamente multiplex. Usei imunofluorescência multi-plex para investigar mecanismos de ação em oncologia e doenças autoimunes que permitem a identificação e caracterização de células imunes e patogênicas em uma única seção no setu.
Precauções gerais devem ser tomadas ao trabalhar com anticorpos contra proteínas humanas, Tyramide e dapi, mas nenhum reagente ou material neste protocolo é conhecido por ser particularmente perigoso.
