Nós gostaríamos de reconhecer Bettine Gibbs para sua ajuda técnica.

Vestir um jaleco, luvas e óculos de segurança em todos os momentos durante a execução de todos os procedimentos no presente protocolo. Certifique-se que recipientes/tubos contendo o reagente de isotiocianato de fenol e guanidina só são abertos em um capuz certificada e descarte de resíduos de fenol em um recipiente designado. Use os reagentes, dicas e tubos estéreis DNAse/RNAse-livre.
1. cultura de pilha
<ol><li>Crescer a linhagem de células HeLa e dois suspensão manto linfoma célula linhas celulares, Granta-519 e Jeko-1, em DMEM contendo 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 ° C. Diluir as células 01:10... e contar usando um contador de partículas14.</li>
	<li>Para a extração de RNA, placa 500.000 células/poço em um prato bem 6 (mídia de 2 mL por alvéolo). Após incubação de 24h, colete o RNA das células.</li>
</ol>2. extração do RNA
<ol><li>Colheita de células Nota: Com exceção da etapa de centrifugação, execute todas as etapas listadas em um capuz de cultura de tecidos para manter a esterilidade.<ol>
<li>Para células de suspensão (Jeko-1 e Granta-519):<ol>
<li>Transfira as células (juntamente com 2 mL de mídia) para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.725 x g, durante 5 min. Aspire a mídia e deixar o centrifugado no fundo do tubo.</li>
			<li>Ressuspender as células em 50 µ l de 1 x salino de tampão fosfato (PBS). Adicione 500 µ l de reagente de isotiocianato de fenol e guanidina monofásico para cada amostra no tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Misture bem e deixe em temperatura ambiente (RT) por 5 min enquanto inversão do tubo microcentrifuga cada 1 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para células aderentes (HeLa):<ol>
<li>Aspire o meio de cultura celular de cada poço. Adicione 1 mL de PBS a cada poço para lavar fora os detritos.</li>
			<li>Remova a PBS e adicione 500 µ l de reagente de isotiocianato de fenol e guanidina monofásico para cada poço.</li>
			<li>Incube a RT por 5 min com balanço suave. Transfira para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lise celular<ol>
<li>Congele a mistura de célula isotiocianato fenol e guanidina a-20 º C por 1h. Nota: A mistura pode ser deixada a-20 ° C durante a noite ou até que seja necessário.</li>
		<li>Descongele o fenol e guanidina isotiocianato mistura de células no gelo. Adicione 100 µ l de clorofórmio para o tubo de microcentrifugadora em uma capa PCR. Vórtice a amostra para 10-15 s até que a mistura é opaco e cor de rosa. Incube a amostra no gelo (a 4 ° C) por 15 min.</li>
		<li>Centrifugar a amostra por 15 min a 20.800 x g e 4 ° C. Remova cuidadosamente a fase aquosa incolor superior (~ 200 µ l) e a transferência para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Precipitação do RNA<ol>
<li>Adicione um volume igual de isopropanol para cada amostra. Adicione 1 µ l de coprecipitant (consulte a Tabela de materiais) para cada amostra para agir como um portador para o RNA e ajudar a visualizar o RNA em etapas subsequentes. Incube a amostra a-80 ° C durante pelo menos 4 h. Para melhores resultados, incubar durante uma noite a-80 ° C.</li>
		<li>Transferi a amostra para uma centrífuga de refrigeração. Centrífuga para 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; o RNA aparecerá como uma mancha azul na parte inferior do tubo. Remova cuidadosamente o isopropanol da amostra. Adicionar 500 µ l de etanol 80% e resuspenda o pellet vortexing brevemente por 3 s.</li>
		<li>Centrifugue a amostra a 20.800 x g em RT 5 min. Retire todo o etanol da amostra. Deixe a amostra secar ao ar por cerca de 10 min. Ressuspender a amostra em 35 µ l de água livre de RNAse. Coloque em um bloco de calor (65 ° C) por 5 min garantir que o RNA é totalmente em solução e imediatamente colocar o tubo no gelo.</li>
		<li>Determine a concentração de RNA total usando um spectrophotometer conforme descrito anteriormente, exceto o uso de 1,5 µ l da amostra do RNA em vez de 1 µ l15. Opcionalmente, execute 1 µ g de RNA total em um gel de agarose a 1% para determinar a integridade do RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase tratamento
<ol><li>Após a quantificação do RNA, realizar o tratamento de DNAse sobre o RNA total de degradar qualquer DNA genômico. Para cada amostra, adicione os seguintes reagentes do kit de DNAse RNAse-livre para fazer uma reação de total de 20 µ l misture em um tubo de microcentrifugadora separada:<ol>
<li>Misture 2 µ l de DNase 10 X amortecedor da reação com 4,4 µ g de RNA total. Trazer para um total de 14 µ l com água.</li>
		<li>Adicione 2 µ l de RNase-livres DNAse. Incube a 37 ° C por 30 min na presença de 2 µ l de inibidor de RNase (do Kit de transcrição reversa).</li>
		<li>Adicione 2 µ l da solução de paragem e calor em um bloco de calor por 10 min a 70 ° C para inativar a enzima DNAse. Nota: O tratamento de DNAse é opcional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. síntese de cDNA
Para um volume final de reação de 50 µ l:
<ol><li>Para um volume final de reação de 50 µ l: transferência 22 µ l do DNase tratados RNA para um novo tubo ou transferência 4 µ g de RNA total com água adicionada a um volume total de 22 µ l para um novo tubo. Adicione 2 µ l da T7 oligo dT25 primeira demão da solução de primer 10 µM. A sequência para o primer de25 T7 oligo dT é 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.</li>
	<li>O kit de transcrição reversa adicione 2 µ l do inibidor de RNase (20 U / µ l), 8 µ l de tampão de reação a 5x, 4 µ l de dNTPs 10 mM e 2 µ l da transcriptase reversa (200 U / µ l). Nota: Configure uma reação sem transcriptase reversa para atuar como um controle negativo.</li>
	<li>Incube a 42 ° C por 1 h. transferência diretamente para o gelo. Aqueça o tubo a 75 ° C por 5 min e colocar o tubo no gelo.</li>
</ol>5. primer busca de transcrição do Gene de fusão
<ol><li>
Projeto da primeira demão
	<ol>
<li>Baixar a sequência do cDNA do navegador genoma Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar uma região dentro a ORF da transcrição alvo (ANKHD1) montante do códon de parada. Copie e cole a toda a região (até 700 nucleotídeos) que contêm sequências montante do códon de parada para a região de entrada de sequência de software do projeto da primeira demão (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).</li>
		<li>Selecione a opção de design personalizado exibir e selecionar 10 para o número de primers que o sistema deve gerar (resultados retorno) e deixar todos os outros parâmetros definidos como padrão.</li>
		<li>Escolha cinco primers para a frente e duas primeiras demão reversos que não se sobreponham. Ordenar as primeiras demão e reconstituir com água RNAse/DNAse-livre para uma concentração final de 10 µM. Mais detalhes sobre o projeto da primeira demão geral para PCR são cobertos em outro lugar16.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR para identificar potenciais primers para uso em subsequentes 3' corrida Nota: Para determinar os finais frente primers para usar na reação, teste os primers projetados pela criação de combinações diferentes de primers para diante e reversos para o PCR regular em uma capa PCR.<ol>
<li>Transferi o cDNA (2 µ l) para um tubo PCR de 0,5 mL. Adicione 1 µ l do primer para a frente e 1 µ l do primer reverso (a partir de uma solução de primeira demão de 10 mM). Fazer até 12,5 µ l adicionando 8,5 µ l de água livre de nuclease. Adicione 12,5 µ l do 2 x Gel-para-PCR Master Mix.</li>
		<li>Use as seguintes condições ciclagem térmicas de PCR: 95 ° C por 2 min, seguido por 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min. definir o ciclo final a 68 ° C por 7 min.</li>
		<li>Após a PCR, execute os produtos em um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Detalhes de eletroforese são como descritos anteriormente com algumas modificações17.<ol>
<li>Dissolva 1 g de agarose em 100 mL de tampão Tris-Acetato (TAE) em um balão de 250 mL. Ferver no microondas.</li>
			<li>Deixar arrefecer durante 1 min e adicionar 7,5 µ l de solução de brometo de etídio (estoque de 10 mg/mL) em uma coifa. Misturar bem, agitando o frasco e despeje em um aparelho de gel horizontal. Deixe às RT a coifa pelo menos 30 min permitir que o gel solidificar.</li>
			<li>Cubra o gel com 1 x TAE de buffer e carregar 10 µ l do produto do PCR para o gel de agarose juntamente com 3 a 5 µ l de escada do peso molecular de ADN. Em 175 V por 10 min. Visualizar os produtos usando um gerador de imagens ou se ainda mais a separação de produtos for necessária, execute o gel para um adicional 5-10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Seleção de primers aninhados para 3' corrida
	<ol>
<li>Analise os resultados do gel do agarose PCR para selecionar primários que têm uma banda única, distinta e forte do PCR. Usar o primer mais 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') juntamente com a primeira demão25 oligodT T7 em PCR primeiro executar.</li>
		<li>Selecione o primer aninhado que está localizado a jusante do primeiro primer (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') e usá-lo com o primer T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') no segundo conjunto de reações de PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. otimização 3' corrida para mapear o 3' UTR usando duas enzimas diferentes
Nota: Tem havido um aumento na diversidade de polimerases de DNA usado para PCR; Portanto, nós queríamos determinar condições padrão que podem ser aplicadas mesmo quando usando enzimas diferentes para reações de PCR de corrida de 3'. Primers para qualquer transcrição reversos são mantidos constantes; as únicas mudanças são nos primers frente aninhados que são específicos para a transcrição do alvo.
<ol><li>
Protocolo 1:3 ' corrida usando uma polimerase de DNA modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu)
	<ol>
<li>Primeiro PCR<ol>
<li>Transferir 1 μL de cDNA para um tubo PCR e adicionar 5 µ l de buffer de reação 10 x Pfu . Adicione 1 µ l da primeira cartilha frente aninhada, 1 µ l do primer T7 oligodT25 e 1 µ l de dNTPs (a partir de uma solução de 10 mM).</li>
			<li>Fazer o volume total de até 49 µ l adicionando 40 µ l de água. Adicione 1 µ l de Pfu DNA polimerase e misture bem. Execute o PCR usando o perfil PCR na tabela 1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segundo PCR<ol>
<li>Transferir 2 µ l dos produtos de PCR primeiro para um novo tubo PCR e misturar com 5 µ l de buffer de reação Ultra II de Pfu10 x. Adicione 1 µ l do segundo primer PCR aninhado, 1 µ l do T7 primer e 1 µ l de dNTPs (solução de 10 mM).</li>
			<li>Fazer até 49 µ l total reaccional adicionando 39 µ l de água. Adicione 1 µ l de Pfu DNA polimerase. Execute o PCR usando o mesmo perfil PCR como a primeira instalação PCR (tabela 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo 2:3 ' corrida usando uma DNA polimerase quimérico, consistindo de um domínio de ligação do DNA fundido a um Pyrococcus-como revisão mistura de mestre polimerase PCR
	<ol>
<li>Primeiro PCR<ol>
<li>Transferi 1 μL de cDNA para um tubo PCR. Adicione 1 µ l do primeiro primer aninhado para a frente e 1 µ l do primer T7 oligodT25 . Fazer até 25 µ l adicionando 22 µ l de água.</li>
			<li>Adicione 25 µ l de 2 x PCR Master Mix e misture bem. Use as condições PCR ciclismo descritas na tabela 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Segundo PCR<ol>
<li>Transferi 2 µ l dos produtos de PCR primeiro para um novo tubo de PCR. Adicione 1 µ l do segundo primer PCR aninhado junto com 1 µ l do T7 primer reverso.</li>
			<li>Fazer até 25 µ l adicionando 22 µ l de água. Adicione 25 µ l de 2 X PCR Master Mix. Execute o PCR usando o mesmo perfil PCR como a primeira instalação PCR (tabela 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Verifique se o segundo produto PCR de 3' corrida.
<ol><li>Tome 5 a 10 µ l do segundo produto da PCR (bem como produto da primeira rodada de PCRs se a transcrição é abundantemente expressa) e executar em um gel de agarose. Configurar o gel e executar a eletroforese como descrito anteriormente (passos 5.2.3.1 para 5.2.3.3). Visualize resultados em uma imagem.</li>
</ol>8. sequenciamento e purificação do produto
<ol><li>Purifica os produtos PCR gel de segunda PCR usando o Gel e sistema de Clean-Up do PCR fragmento de DNA, conforme o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Executar Sanger sequenciamento (em alternativa, enviar o gel purificada primers de sequenciamento adequado para um laboratório de sequenciamento e amostras de produtos PCR). Analisar os dados de sequenciamento Sanger após o sequenciamento.</li>
	<li>Download de software de análise de sequência (ver Tabela de materiais) e importar os arquivos de rastreamento para o software. Uso o individual pura Base QVs (qualidade valores) para obter a Base chamar informações18. Baixe o cromatograma com traços de alta qualidade para visualização. Opcional: O produto purificado de gel pode ser clonado usando um kit de clonagem apropriado e os clones isolados enviados para Sanger sequenciamento.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Apesar do advento das tecnologias de sequenciação paralelo maciço, numa base de gene-gene-por, 3' corrida continua a ser o método mais fácil e mais econômico para identificar o PAS e nucleotídeos adjacentes à cauda poli (a). A adaptação descrita aqui expande usando 3' corrida para amplificar e mapear sequências que incluem uma parte da ORF, o códon de parada e o inteiro 3' UTR a transcrição do mRNA de ANKHD1 . Uma grande vantagem do 3' corrida é que, com algumas adaptações menores, produtos de 3...

A formação da extremidade 3' é um passo crítico na maturação do mRNA que compreende a clivagem do pre-mRNA a jusante de um PAS, seguido pela adição de 250 ~ untemplated adenines, que formam a cauda de poli1,2. Proteína de ligação a poli (PABP) vincula-se à cauda poli (a), e isso protege a transcrição do mRNA de degradação e facilita a tradução1.
As estimativas atuais sugerem que 70% dos genes humanos têm Passe múltiplo e, portanto, submeter-se poliadenilação alternativa, resultando em múltiplos 3' extremidades3. Assim, é importante identificar onde a cauda poli (a) atribui ao resto do 3' UTR, bem como identificar o PAS usado por qualquer transcrição determinada. O advento da próxima geração de sequenciamento resultou na identificação simultânea de 3' UTRs e a passagem de milhares de genes. Este aumento na capacidade de sequenciamento exigiu o desenvolvimento de algoritmos de bioinformatic para analisar os dados envolvendo poliadenilação alternativa da extremidade 3'. Para a detecção de novo ou validação do PAS e, portanto, mapeamento da extremidade 3' de genes individuais de dados de sequenciamento em larga escala, 3' corrida continua a ser o método de escolha4,5. As sequências incluídas em produtos de cDNA de 3' corrida normalmente incluem apenas uma parte do 3' UTR que contém a cauda poli (a), o local de clivagem, o PAS, sequências e o montante do PAS. Ao contrário do PCR, que requer a concepção e utilização do gene específico para diante e reverso primeiras demão, 3' corrida requer apenas duas gene específico aninhado frente primeiras demão. Daí, a PCR requer um conhecimento mais detalhado da sequência de nucleotídeos de uma grande região do gene sendo amplificado4,6. Desde 3' corrida usa o mesmo inverter a primeira demão que metas a poli (a) cauda para todos polyadenylated RNA transcritos, somente os primers para a frente devem ser gene específico, assim, exigindo apenas conhecimento de uma região significativamente menor do mRNA. Isso permite que a amplificação das regiões cujas sequências não são inteiramente caracterizado4,7. Isto permitiu 3' corrida para ser usado não somente para determinar a extremidade 3' de um gene, mas para também determinar e caracterizar regiões grandes montante do PAS que formam uma parcela significativa de 3' UTR. Combinando 5' corrida com o modificado 3' corrida que inclui porções maiores de 3' UTR e flanqueiam regiões, é possível totalmente sequenciar ou clonar uma transcrição de mRNA inteira da extremidade 5' para seus 3' final8.
Um exemplo desta aplicação de modificado 3' corrida é a identificação recente de um romance CCND1-MRCK transcrição de gene de fusão de linhas de células do linfoma de células do manto e pacientes com câncer. O 3' UTR consistia de sequências de genes de ambos os CCND1 e MRCK e foi recalcitrantes a miRNA Regulamento9. Os dois aninhados CCND1 específicos frente primers foram complementares à região imediatamente adjacente e a jusante do CCND1 códon de parada. Embora toda transcriptoma sequenciamento juntamente com ferramentas de bioinformatic específico pode ser usado para detectar fusões gene dentro do 3' UTR10, muitos laboratórios podem não ter os recursos financeiros ou bioinformatic perícia para fazer uso desta tecnologia. Portanto, 3' corrida é uma alternativa para novo de identificação e validação de genes de fusão novela envolvendo a 3' UTR. Considerando o drástico aumento no número de genes de fusão relatados, bem como ler as transcrições, 3' corrida tornou-se uma poderosa ferramenta na caracterização de gene sequências11,12. Além disso, estudos recentes demonstraram que diferentes sequências dentro a 3' UTR, bem como o comprimento de 3' UTR pode afetar a estabilidade de transcrição do mRNA, localização, Traduzibilidade próprios e função13. Devido em parte ao crescente interesse no mapeamento da transcriptoma, tem havido um aumento no número de diferentes polimerases de DNA, sendo desenvolvido para uso em laboratório. É importante determinar que tipos de modificações podem ser feitos para o 3' protocolo de corrida em a fim de utilizar o repertório disponível de polimerases de DNA.
Este trabalho de adaptação 3' corrida para mapear o inteiro 3' UTR de relatórios, o PAS e 3' final local de clivagem da transcrição de ANKHD1 usando aninhados cartilhas dentro da seção de ANKHD1 de transcrição e dois diferentes polimerases de DNA.

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

Maturação dos mRNAs eucarióticos envolve 3' formação de ponta, que envolve a adição de uma cauda poli (a). A fim de mapear a extremidade 3' de um gene, o tradicional método de escolha é 3' amplificação rápida das extremidades do cDNA (3' corrida). Protocolos para 3' corrida requerem o design cuidadoso e seleção de primers aninhadas dentro da região 3' untranslated (3' UTR) do gene alvo de interesse. No entanto, com algumas modificações, o protocolo pode ser usado para incluir o inteiro 3' UTR e sequências dentro do quadro de leitura aberta (ORF), fornecendo uma imagem mais abrangente da relação entre a ORF e a 3' UTR. Isto está além da identificação do sinal de poliadenilação (PAS), assim como o decote e poliadenilação site fornecido pelo convencional 3' corrida. Expandida de 3' corrida pode detectar incomum 3' UTRs, incluindo fusões gene dentro a 3' UTR, e as informações de sequência podem ser usadas para prever potenciais locais obrigatórios de miRNA, bem como AU rico desestabilizando a elementos que possam afectar a estabilidade da transcrição.

Pesquisa de Primer frente aninhados:
O gel de agarose de A Figura 1 mostra dois produtos distintos de gel PCR (faixas 1 e 2) que uso o mesmo encaminhar a cartilha mas diferentes cartilhas reversos. 3 Lane tem um produto PCR distinto e tem uma distinta cartilha frente e verso. Os primers ideais para usar para a reação de PCR com base são aqueles que dão um produto PCR distinto (faix...

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Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

12.2K visualizações.  Butler University. A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

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Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Pesquisa do câncer

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

Análise do transcriptoma de uma única célula

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Neurociência

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medicina

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

Amplificação rápida das extremidades de cDNA

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
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