Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Karen M. Qiang foi o destinatário de 2016 do George J. Schroepfer Research Award na Rice University. Fanli Zhou é o destinatário de uma bolsa de ensino da Universidade Rice. Os serviços do centro de estoque Drosophila Bloomington, instalação de viagem de Harvard, o centro de recursos de Drosophila Viena com gratidão são reconhecidos.

1. preparação de larvas
<ol><li>Dois ou mais dias antes do início do ensaio, configurar cruzes do desejado experimental e controlar as combinações (mínimas 20 fêmeas e 10 machos cada) em pratos do ovo a postura como descrito por Wieschaus e Nusslein-Volhard 13 mas usando polipropileno 50ml copos e pratos de Petri descartáveis 6,0 cm contendo ágar uva e manchado com fermento Cole imediatamente antes da utilização. Espantar moscas em pratos do ovo a postura na escuridão, à temperatura ambiente até que seja necessário.</li>
	<li>Receita de agar uva – combinar 100ml congelado 100% uva suco concentrado, 350 mL de água de deioinized, 5ml glacial acético e 13 g d. melanogaster ágar num copo de vidro de 1 L. Microondas em rajadas de 1-2 min, mexendo entre rajadas, até agar tudo é dissolvido. Esfriar a solução por alguns minutos, em seguida, adicionar 10 mL de 10% (p/v) de Nipagen (metil-p-hidroxibenzoato) em etanol a 95%. Mistura e, em seguida, pipeta 7 mL por placa em placas de Petri descartáveis 6,0 cm, permite ao gel e secar em temperatura ambiente por 3-4 h. loja a 4 0C em sacos plásticos.</li>
	<li>Colar de fermento receita – 7 g secas fermento, 10 mL de água desionizada, misture com uma espátula até consistência uniforme.</li>
	<li>Coleções de ovo cronometrado para gerar experimental e controlar as larvas. Usando novas, placas fermento-manchada, uvas, recolha os ovos à temperatura ambiente durante 4 h na escuridão durante horas da manhã. Remover estas placas de coleção de 4h e substituir com pratos frescos. Incubar as placas de coleção de 4h a noite no 25 0C, até a tarde do dia seguinte, quando a maioria das larvas será eclodiram. Coletar essas larvas de primeiro ínstar e usá-los para configurar o experimento.</li>
</ol>2. criação de placas de ensaio
<ol><li>Preparação de placas de ensaio. Para uma única execução do ensaio, prepare cinco placas ensaio cada de 10 larvas experimentais e cinco placas de 10 larvas de controle. Use uma broca de cortiça de 1,5 cm para remover um núcleo central de ágar de cada placa, criando um buraco para a comida. Coloque a pasta de fermento (0,8 - 0,9 g) no buraco e pat delicadamente com uma espátula para fazer um monte de encher o buraco.</li>
	<li>Preparação de placa de ágar – combinar 700 mL de água desionizada com ágar de d. melanogaster 16G num copo de vidro de 2 L e microondas por 5 min. Retire do microondas e agitar com uma vareta de vidro para trazer o ágar não dissolvido na solução. Adicione 17,5 mL de 10% (p/v) Nipagen em etanol a 95%, mistura, em seguida, continuar o aquecimento de microondas em 30 s rajadas seguido de agitação, até que todos os ágar é completamente dissolvido. Legal por um minuto ou dois, depois Pipete alíquotas de 15 mL para pratos de Petri plástico 10 cm. Permitir que agar para gel, cobrir as placas com as tampas e deixe-os secar à temperatura ambiente por algumas horas ou durante a noite. Placas de loja em sacos plásticos fechados a 18 ° C. Nota 1: Para evitar a formação de cristais de Nipagen na superfície das placas devido a dessiccation em excesso, use placas dentro de alguns dias de preparação. Se necessário, cristais podem ser re-dissolvidos pela queda de alguns microlitros de 95% de álcool para eles. Nota 2: lotes de ágar-ágar podem ter diferentes propriedades de coagulação. As placas de gel seco devem ser suficientemente resistente que um círculo limpo e intacto de ágar-ágar pode ser removido quando a broca de cortiça para criar o buraco de comida (veja acima) e firme ao toque.</li>
	<li>Criação de larvas em placas de ensaio. Use pressão mecânica para curvar a ponta de um microspatula de plástico e mergulhe a ponta no colar de levedura para fornecer "adesivo" para pegar as larvas. Pegar o primeiro ínstar larvas individualmente e colocá-los na placa de ágar-ágar, perto do monte de comida. Prepare pelo menos cinco placas replicar de 10 larvas para ambos experimental e genótipos de controle. Depois de concluído, cap e rotular cada placa e definir as placas (tampa para cima) em um espaço escuro e à temperatura ambiente (em nosso laboratório é de 22 ° C).</li>
</ol>3. monitoramento de placas de ensaio
<ol><li>Examinar placas diariamente sob um microscópio de dissecação e registrar o número de larvas sobre o alimento ou na superfície do agar. Observe qualquer visíveis larvas mortas ou moribundos. Observação quando e se, de encapsulamento para o substrato de ágar-ágar é visto como larvas mover em terceiro instar. Datas de observação no qual pupas começam a se formar e observe qualquer anormalidade pupal. Continue as observações diárias até que todas as larvas morreram ou puparam.</li>
	<li>Remova pupas cuidadosamente a placa com um dobrados provocando a agulha e transferir para um prato de uvas. Se desejar, continue a acompanhar pupas para determinar quantos eclose como adultos.</li>
</ol>4. preparação do ensaio as placas para a imagem latente
<ol><li>Retire cuidadosamente e descartar todos os alimentos de levedura no poço central de cada placa.</li>
	<li>Delicadamente, inundar cada placa com água da torneira e usar escova de pintura do artista macio cuidadosamente pulverize os restos que seguiu para a superfície do ágar. Substitua a água várias vezes e continuar uma escovadela suave, até que cada placa é completamente limpeza. Dar as placas um enxágue final com água desionizada, cap-los e deixar à temperatura ambiente durante a noite para secar. Nota: Encapsulamento sobre o agar é mais intenso em torno do monte de alimentos (ver Figura 2). Como resultado, a borda do furo comida geralmente é expandida para além da inicial 1,5 cm de diâmetro. Além disso, a fragilidade do ágar trabalhou nesta região pode causar pequenos pedaços de agar em túnel para ser perdidos desde a circunferência do buraco durante a limpeza. Aumentando a concentração de ágar gel poderia ajudar com esses problemas, mas as correções são possíveis durante as etapas de quantificação de imagem J (veja abaixo).</li>
</ol>5. quantificação de tunelamento
<ol><li>As placas da imagem. Prepare uma imagem de cada placa tomada contra um fundo preto, a fim de mostrar os túneis em agar como linhas brancas brilhantes. Nota: Nós usamos um sistema comumente usado para géis de DNA para esta etapa de imagem (consulte a tabela de materiais e reagentes). Alternativa sistemas capazes de gerar arquivos tiff, como câmeras digitais ou câmeras de telefone celular de imagens poderia ser ajustada para produzir imagens adequadas.</li>
	<li>Use o programa de domínio público NIH Image J para dosar larval de encapsulamento. Baixe o programa do http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Para obter mais informações sobre o programa acesse http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Nota: Outros sistemas de imagem poderiam ser usados para dosar o encapsulamento. As seguintes instruções se aplicam a NIH Image J.</li>
	<li>Depois de abrir um arquivo de imagem tiff de uma placa de encapsulamento, use a ferramenta Oval para definir uma área para quantificação que representa a superfície do agar inteira mas culturas fora a borda plástica da placa.</li>
	<li>Aplica o limiar automático para produzir uma imagem reversa da placa, com os túneis mostrando como linhas pretas. Use o seletor de cores e ferramentas de pincel para branco qualquer áreas pretas que representam danos para o ágar-ágar, ao invés de túneis.</li>
	<li>Sob o menu pull-down Analyze , selecione escala de conjunto | Clique para remover o tártaro e em seguida na janela definir medidas (também em Analyze), verifique a área e limite ao limiar.</li>
	<li>Pressione a tecla CTRL + tecla M para mostrar a área preta (túneis) em pixels.</li>
	<li>Copie e cole o valor de pixel para cada placa é em um programa de planilha (como o Excel) que permitirá a análise quantitativa.</li>
	<li>O furo central geralmente é ampliado devido ao tunelamento intensa nesta região. Para dosar o tunelamento faltando, desmarque a opção "Limitar ao limiar" e usar a ferramenta varinha para definir o furo central. Pressione a tecla CTRL + tecla M para obter o valor de pixel desta área. Subtrair esse valor, o valor de pixel de um buraco de 1,5 cm e adicione a diferença para o encapsulamento valor obtido na etapa 5.6.</li>
	<li>Para algumas placas, o furo central pode estar faltando um pedaço de ágar encapsulado que inclui uma região de ágar untunneled adjacente para o buraco. Quando dosar o furo central para o uso dessas placas o seletor de cores e pintura escovam ferramentas para adicionar uma barra preta em toda a região falta definir região encapsulada e excluir a área de não-tunelizado de quantificação. Nota 1: Se as larvas experimentais realizar qualquer encapsulamento, esta quantificação permite o cálculo da média de valores para conjuntos de placas e comparação estatística de controle e experimental de encapsulamento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Apresentamos aqui um ensaio simples, desenvolvido para detectar hipoxia do tecido em larvas de d. melanogaster . Diagnóstico baseia-se na diminuição da burrowing montes de comida no início da vida larval e a ausência de substratos de encapsulamento mais tarde na vida larval. Apinhamento larval pode causar migração prematura longe de uma fonte de alimento e, portanto, um aspecto crítico do ensaio é que um pequeno número de larvas é doseado na presença de um grande excesso de comida. Inclusão de benzoato de hidroxila de metil-p o fungicida (Nipagen) para as placas de ágar também é essencial para evitar o crescimento de fungos durante o ensaio.
Achamos que as placas de ágar-ágar podem ser uma fonte de variabilidade no ensaio. Normalmente, as larvas do mesmo genótipo, de lotes diferentes dos pais, ou de diferentes coleções de larvas, mostram variação relativamente limitada em seu comportamento no ensaio. Em contraste, placas de ágar feitas em dias diferentes ou com diferentes lotes de ágar-ágar podem produzir diferenças no encapsulamento. Uma condição é, portanto, que o controle e larvas experimentais devem todos ser testadas usando placas de ágar da mesma preparação de lote. Agar de fabricantes diferentes ou mesmo transferências da mesma fabricação podem variar em sua força de gelificação, e então pode ser necessário o ajuste da concentração de ágar para cima dos 2.2% usada aqui para alcançar um gel ideal. Nós achamos que as larvas do tipo selvagem podem prontamente esburacam géis de ágar de 3%.
Para demonstrar o valor deste teste, nós usamos isso para investigar potenciais hipóxia do tecido em larvas com função suprimida de uninflatable nos tracheae. Nossas descobertas fornecem forte apoio para a hipótese de que a perda de expressão traqueal deste gene pode produzir hipóxia: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas mostraram falta de burrow na comida e ausência completa de substratos de encapsulamento durante o terceiro ínstar. Em nossos estudos anteriores de outros genótipos, observamos que perda induzida por hipóxia de escoar-se comida não é tão completa quanto a perda de substrato de encapsulamento e a btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas estudaram aqui se comportou da mesma forma. O componente de encapsulamento falhado deste teste, portanto, fornece a mais forte indicação de hipóxia.
Embora o btl-Gal4 > uif RNAi larvas mostraram características comportamentais diagnóstico de hipóxia, a corte(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi não apresentam essas anormalidades. A btl e cortar(ue), Gal4 motoristas são expressos em diferentes fases e em padrões diferentes, dentro os tracheae larval. A btl-Gal4 motorista é expressa por todo o sistema traqueal, a partir de seu desenvolvimento na embriogênese e continuar com vida larval. Em contraste, Gal4 expressão das cortar(ue)-Gal4 driver só começa no final da vida embrionária, depois da morfogênese dos tracheae e limita-se às seções de extrema posteriores dos troncos dorsais, os principais vasos longitudinais de o sistema traqueal. UIF nocaute com esta linha de Gal4 não pode, portanto, reduzir a expressão uif suficientemente cedo ou amplamente suficiente para produzir algum nível de limiar de hipoxemia necessária para acionar os comportamentos medidos neste ensaio.
Um estudo prévio encontrado que terceiro ínstar larvas expostas a baixos níveis de oxigênio (10%) mostram diminuição do crescimento e atrasou o início da pupariation 14. A btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas estudadas aqui apuraram-se para o terceiro instar, mas os efeitos sobre suas taxas de crescimento e pupa foram mais pronunciados: eram consideravelmente menores do que controles com muito pouco tecido adiposo, sob a a tentativa de epiderme (Figura 3) e apenas uma pequena fração (~ 10%) pupariation. Estas diferenças sugerem a btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas experimentaram um maior grau de hipóxia, uif nocaute nos tracheae esteve presente ao longo de toda a sua vida larval, ou porque produzia mais grave falta de oxigenação no terceiro ínstar. Como perda da função uif nos tracheae pode impedir o transporte de oxigênio é clara neste ponto. Os tracheae da btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas foram prontamente visíveis através da cutícula (Figura 3), uma indicação de que eles continham ar e não foram danificados ao ponto de que a entrada de fluido comprometido função. É formalmente possível, portanto, que o dano traqueal criado por perda da função uif não provocar hipóxia mas prefiro algum outro defeito que inibe o encapsulamento. Para os genótipos estudados anteriormente, determinamos que falha ao túnel está associada a níveis elevados de LDH mRNA7, o indicador canônico da glicólise e hipoxia em tarde terceiro ínstar larvas 15. Assim, a confirmação final de hipóxia para o btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas (e em larvas examinadas no futuro usar deste teste) envolveria a RT-PCR para avaliar os níveis do mRNA LDH ou a utilização de um indicador disponível comercialmente para medir níveis de oxigênio intracelular (por exemplo ver 16).

A sofisticada matriz de ferramentas de genéticas moleculares disponíveis no d. melanogaster torná-lo um organismo valioso para o estudo de processos biológicos evolutivamente conservados. Chaves moleculares respostas a disponibilidade de oxigênio provaram ser conservadas através de evolução e estudos prévios no d. melanogaster geraram insights sobre os componentes universais destas vias 1,2, a sinalização 3,4,5,6.
Como parte de um estudo visto dissecando a função do neurônio sensorial em larvas de d. melanogaster , identificamos duas respostas comportamentais que provou ser ativado por hipóxia do tecido em níveis de oxigênio normal 7. Uma destas, incapacidade de burrow na comida, é altamente relacionada com a resposta a baixos níveis de oxigênio relatado por Wingrove e O'Farrell 8. O segundo comportamento, falha para cavar um túnel em um substrato macio durante a tarde ínstar terceiro vagando fase, tinha não foi anteriormente identificado como hipóxia-relacionados. Determinamos que expondo tipo selvagem errante larvas para baixos níveis de oxigênio também inibe a substratos de encapsulamento 7, estabelecendo assim que ambos esses comportamentos se originam de hipóxia - ou induzida por dano tecidual ou níveis de consumo de oxigênio baixa. Aqui descrevemos um ensaio que desenvolvemos para dosar estes dois comportamentos induzida por hipóxia, que se inicia com observações imediatamente após a eclosão de larvas.
Hipóxicos respostas nos estágios larvais iniciais não foram examinadas anteriormente e, portanto, realizar uma análise ao longo da vida larval é um componente valioso de nosso ensaio. A maioria das manifestações óbvias da hipóxia – desenvolvimento lento crescimento pobre e lentidão do aparelho locomotor – se sobrepõem com fenótipos larvas produzidos por muitas mutações. Mas achamos que só terceiro ínstar larvas com hipoxia mostram um completo fracasso para cavar um túnel 7. Assim, determinamos que larvas ainda mais comprometida em termos de crescimento e de locomoção do que nossas larvas hipóxicos, ainda realizado um encapsulamento, Considerando que larvas hipóxicos nunca fez um túnel 7. Outro elemento valioso neste ensaio é, assim, que fornece uma maneira de estabelecer quando hipóxia é a fonte de um determinado conjunto de fenótipos pleiotrópicos, ao contrário de alguns outros stress ou mau funcionamento metabólico. Como uma demonstração do ensaio, aqui descrevemos seu uso em caracterizar as respostas de larvas com reduzida expressão traqueal de uninflatable, um gene que funciona na vias aéreas larval 9.
Prevemos que este ensaio será de valor para os pesquisadores envolvidos em caracterizando larvas fenótipos que incluem comportamento lento e crescimento pobre. Como resultado, novos genes que influenciam a distribuição, uso ou respostas, oxigênio por todo o corpo pode ser identificado. Além disso, incorporando este ensaio em um protocolo de triagem de mutante forneceria uma rota direta para identificar as mutações que produzem hipóxia. Este ensaio também será valioso na análise dos circuitos que provoca os comportamentos inatos induzida por hipóxia, descritos aqui. Análise de rede neural deste tipo é um foco de muita pesquisa atual e o sistema nervoso simples da larva d. melanogaster é um sistema valioso para comportamentos automatizados de dissecação. Neurônios sensoriais envolvidos na percepção de oxigênio larval já foram identificados, proporcionando um primeiro passo para definir o circuito completo para respostas induzida por hipóxia 10,11. Usando nosso ensaio em combinação com nocaute neural seletiva através do sistema de GAL4-UAS12 é uma rota clara para delinear ainda mais componentes da rede neural.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dehydrated yeast&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen grape juice concentrate</td><td>Welch&#039;s</td><td></td><td>&amp;nbsp;Available at most large supermarkets</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila agar</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-para-hydroxybenzoate</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene beakers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6.0 cm disposable Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 cm disposable plastic Petri dishes</td><td>E+K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>Plastic microspatulas</td><td>Corning Incorporated</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>Bent teasing needle</td><td>Nasco</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td></td><td></td><td>Any microscope with 10-30X magnification</td></tr></tbody></table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Privação de oxigênio em animais pode resultar da exposição a níveis baixos de oxigênio atmosférico ou de danos nos tecidos internos que interfere com a distribuição de oxigénio. Também é possível que comportamento aberrante de neurônios de sensor de oxigênio poderia induzir o comportamento de hipoxia na presença de níveis de oxigênio normal. No d. melanogaster, desenvolvimento em baixos níveis de oxigênio resulta em inibição de crescimento e comportamento lento durante as fases larvais. No entanto, essas manifestações estabelecidas de déficit de oxigênio se sobrepõem consideravelmente com os fenótipos de muitas mutações que regulam o crescimento, respostas de stress ou de locomoção. Como resultado, não há atualmente nenhum ensaio disponível para identificar hipóxia i) celular induzida por uma mutação ou ii) hipóxia comportamento quando induzida pelo comportamento neuronal anormal.
Recentemente, nós identificamos dois comportamentos distintos em larvas de d. melanogaster que ocorrem em níveis normais de oxigênio em resposta à detecção interna de hipóxia. Em primeiro lugar, em todas as fases, tais larvas evitar burrowing comida, muitas vezes se afastar muito longe de uma fonte de alimento. Em segundo lugar, encapsulamento em um substrato macio, que normalmente ocorre durante a terceira fase de ínstar errante é completamente abolido se as larvas são hipóxicos. O ensaio descrito aqui é projetado para detectar e quantificar esses comportamentos e, portanto, fornecer uma maneira para detectar hipoxia induzida por danos internos ao invés de baixo oxigênio externo. Placas de ensaio com um substrato de ágar e um plug central de massa de levedura são utilizadas para apoiar os animais através de vida larval. As posições e estado das larvas são controlados diariamente como proceder do primeiro ao terceiro ínstar. A extensão do túnel para o substrato de ágar durante fase errante é quantificada após a pupação usando NIH ImageJ. O ensaio será de valor na determinação de quando a hipóxia é um componente de um fenótipo mutante e, portanto, fornecer informações sobre possíveis locais de ação do gene em questão.

Como uma demonstração do valor deste teste que utilizámos para investigar potencial hipóxia em larvas com compromisso da função do gene uninflatable (uif) nos tracheae. UIF codifica uma proteína transmembrana grande que fortemente se expressa na superfície apical das células traqueais larvas. Mutantes de uif anteriormente foram anotados para expor o comportamento aberrante que possa indicar hipóxia do tecido devido a mau funcionamento traqueal 9. Nós especificamente suprimida expressão uif na traqueia larval usando o sistema de Gal4-UAS. Gal4 duas linhas foram utilizadas: i) sem fôlego (btl)-Gal4, que se expressa fortemente nos tracheae desde o início do seu desenvolvimento embrionário e ii) corte(ue)-Gal4, que começa a expressão em uma pequena região posterior de os tracheae tronco dorsal principal no final da embriogênese e continua forte expressão nesta região ao longo da vida larval 7. Um UAS -uif RNAi linha foi obtido a partir do centro de pesquisas de drosófila de Viena (VDRC ID #1050).
Conforme descrito no protocolo acima, cinco replicar placas de recém-eclodidos primeiro ínstar larvas foram criadas para cada um dos quatro cruzes como segue.
Experimento 1 1) controle 1 - corte(ue)-Gal4 x Cantão-S (+) 2) Experimental 1 - corte(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Experimento 2 3) controle 2 - btl-Gal4 x Cantão-S (+) 4) Experimental 2 - btl-x UAS-Gal4uif RNAi
O comportamento de corte(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas do experimento 1 foi comparável de controle corte(ue)-Gal4 > + animais em termos de burrowing, encapsulamento e sobrevivência de pupa, (Figura 1 e Figura 2). Em contraste, para baixo-regulação uif expressão em todo o sistema traqueal no início do desenvolvimento (experimento 2) produziu respostas marcadamente diferentes. A btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larvas exibidos ambas as manifestações comportamentais de hipóxia do tecido – reduzida comida burrowing e uma total ausência de substratos de encapsulamento mais tarde na vida larval (Figura 1 e Figura 2 de ). As larvas experimentais foram também visivelmente menor, mais fino e mais lento do que controles (Figura 3) e mostraram uma alta taxa de mortalidade no decorrer do ensaio. Como discutido acima, redução do crescimento, a lentidão e a morte são conhecidos sintomas de hipóxia larval. Além disso, a maioria das larvas experimentais falhou a tentativa de pupa e permaneceu como terceiro estádio larvas longas depois de larvas controle tinham puparam. Algumas larvas sobreviveram mais de 15 dias antes de eventualmente morrer sem pupating (figura 1A). Algumas das larvas experimentais tentaram empupar, mas em todos os casos anormais pupas foram formadas que não gerou adultos viáveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figura 1. Quantificação de desenvolvimento larval e burrowing de comida. (A) percentagem de larva viva fora dos montes de comida para os quatro genótipos estudados aqui. As médias para as placas de cinco ensaio utilizadas para cada genótipo são mostradas. De dia 3, após a eclosão, ~ 70% do btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif estavam fora a comida, Considerando que não há larvas foram detectadas fora a comida ou à superfície do agar para os outros três genótipos. A btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif morrem lentamente entre os dias 4-20, com ~ 15% deles ainda vivos 15 dias após a eclosão. A seta preta ao longo do eixo x aqui e em (B) indica o dia pelo qual todas as larvas de outros três genótipos tinham puparam. (B) porcentagem de larvas mortas visíveis fora o alimento para os quatro genótipos. As médias para as placas de ensaio de cinco para cada genótipo são mostradas. Morto btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif acumulam com o tempo, com a maioria morrendo lá fora a comida. Os outros genótipos que todos sobreviver a pupa (C) porcentagem de sobrevivência de pupa para os quatro genótipos estudados. As médias para as placas de ensaio de cinco para cada genótipo são mostradas. Não normais pupas da btl-Gal4 > genótipo de RNAi UAS uif foram produzidos. Barras de erro em toda a figura representam SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figura 2. Quantificação de tunelamento larval. (A) exemplos das placas de ensaio para todos os quatro genótipos estudaram após preparação para quantificação de encapsulamento. Observe a ausência completa de tunelamento para a btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif . Placas de ensaio são as placas de Petri de 10 cm. (B) a quantificação de encapsulamento derivado Image J para os quatro genótipos. Pixel valores médios para as placas de ensaio de cinco para cada genótipo. Sem encapsulamento foi observado para o btl-Gal4 > larvas de RNAi UAS uif . Barras de erro = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figura 3. Comparação de btl-Gal4 > UAS uif RNAi e btl-Gal4 > + larvas Larvas de idade semelhante (6º dia após a eclosão) para o btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) e btl-Gal4 > + b genótipos. Setas vermelhas apontam para os tracheae dorsal do tronco. Ambas as larvas fotografadas na mesma ampliação. Barra de escala = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

7.8K visualizações.  Rice University. O protocolo descreve um ensaio simples para identificar larvas de Drosophila melanogaster que estão enfrentando a hipóxia sob os níveis de oxigénio atmosférico normal. Este protocolo permite hipóxicos larvas ser distinguido de outros mutantes que mostram fenótipos sobrepostos como lentidão ou crescimento lento.

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Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Biologia do Desenvolvimento

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurociência

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval</

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Biologia

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Ensaio Light Spot-Based para análise de Drosophila larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Um ensaio de buraqueira/Tunneling para deteção de hipóxia em larvas de Drosophila melanogaster

Resumo

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Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Medição da Actividade larval no

Ensaio Light Spot-Based para análise de Drosophila larval Phototaxis