Generalitat Valenciana, PROMETEOII / 2014/063; Ministério da saúde, serviços sociais e igualdade. Delegação do governo para o plano nacional sobre drogas, projetos de pesquisa sobre drogas dependências, 2014I007; Ministério da economia e competitividade (MINECO), Instituto de saúde Carlos III, rede de viciante transtornos (RTA) RD12 / 0028/0005 e RD16 / 17/07/00 e da União Europeia, FEDER fundos "una manera de hacer Europa" e PSI2014-51847-R.

Todos os procedimentos envolvendo ratos e seus cuidados cumprido com as leis nacionais, regionais e locais e regulamentos, que estão em conformidade com a Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos. O Comité conta da Universidade de Valência e uso Animal aprovaram o presente protocolo.
1. materiais e set-up para a preferência de lugar condicionado:
<ol><li>Lidar com ratos 3 dias antes do teste de 1-2 min cada. A base da cauda deve ser aproveitada. O corpo deve ser apoiado, se possível. Isso é feito para minimizar a dor e a angústia ao lidar com um animal e para evitar variáveis interferentes, tais como o stress. Nota: De camundongos machos 1 60 dias de idade (jovens adultos) pesando 35-40 g foram empregados nas experiências de presente. Reintegração induzida por drogas pode ser realizada em camundongos de ambos os sexos. No entanto, sobre reintegração induzida por estresse, o paradigma social derrota projetado somente para roedores do sexo masculinos, como fazem as fêmeas não induzir uma resposta agressiva nos ratos residentes.</li>
	<li>Para o condicionamento de lugar, use caixas iguais, feitas com dois compartimentos idênticos (30,7 cm comprimento 31,5 cm largura × × 34,5 cm de altura), separados por uma zona cinzenta central menor (13,8 longo 31,5 cm largura × × alta de 34,5). Nota: Compartimentos têm piso diferentes texturas e cores de parede (um piso liso no compartimento preto e um chão áspero em branco). Cada compartimento da caixa CPP contém quatro feixes de luz infravermelhas e seis no compartimento central. Isto permite a gravação das travessias entre compartimentos e a posição do animal.</li>
	<li>Definir se as luzes da sala (desligadas ou abaixadas) cada dia. Use luzes vermelhas (recomendadas), como os animais não percebê-lo e ele é atenuado para o experimentador (aproximadamente 40 lux medido a 1 m acima do nível do piso).</li>
	<li>Configurar o programa para registrar 15 min para o condicionamento de pré e pós-teste (veja a Tabela de materiais para software) (Figura 2)</li>
	<li>Prepare a solução de cocaína necessária para todo o experimento. Dissolver o hidrocloreto de cocaína em 0,9% NaCl (soro fisiológico) em um volume de 0,1 mL/10 g de massa corporal. Mistura de vórtice e loja a 4 ° C, no final do dia. Nota: Concentrações de cocaína podem variar dependendo da finalidade do estudo. Se o objetivo é avaliar as doses abaixo do limite de cocaína, uma concentração de 1 mg/kg pode ser usada, que é ineficaz em animais de controle, como visto em anteriores estudos24,35. Se uma dose eficaz é o objectivo, uma concentração de 6 mg/kg pode ser escolhido, que é eficaz, mas não induz a reintegração24, ou por uma concentração de 25 mg/kg, que é eficaz e induz a reintegração da preferência19.</li>
	<li>Teste os animais durante a fase escura e usar a mesma caixa para cada animal em dias.</li>
	<li>Trazer animais todos os dias para a sala de testes nas jaulas em casa e deixá-los sem ser perturbado por 15 min como um período de habituação para todos os barulhos relacionados ao teste.</li>
</ol>2. teste
<ol><li>Aquisição Nota: O procedimento de condicionamento de lugar, imparcial em termos de preferência espontânea inicial, consiste em três fases: pré-condicionamento, condicionamento e pós-condicionado (Figura 1).<ol>
<li>
Pré-condicionamento (Pre-C) (3 dias) (Figura 2, Figura 3, Figura 4) Nota: Aqui, o valor neutro dos compartimentos na caixa CPP é avaliado. Medida que o tempo gasto em cada compartimento e depois compará-lo com o que gastou no mesmo compartimento no teste pós-condicionado.<ol>
<li>Trazer os animais para a sala de teste e deixá-los habituados por 15 min.</li>
			<li>Verifique guilhotinas são removidos da gaiola.</li>
			<li>Configure o computador e o programa. Insira o animal IDs e pressione o comando "Experimental" e "Start" (Figura 2).</li>
			<li>Coloque o mouse suavemente na câmara média (compartimento cinza) e deixar a sala de testes com o mínimo de ruído.</li>
			<li>Trazer todos os animais em jaulas em casa e salvar os dados, quando o julgamento for concluído.</li>
			<li>Permitir que os ratos acessar ambos os compartimentos do aparelho por 15 min (900 s) por dia em 3 dias consecutivos.</li>
			<li>No dia 3, anote o tempo gasto em cada compartimento durante um período de s 900 e guarde-o para a atribuição dos compartimentos na fase seguinte (Figura 3).</li>
			<li>Atribua a metade dos animais em cada grupo para receber a droga ou o veículo em um compartimento (por exemplo, preto) e a outra metade no outro compartimento (por exemplo, branco) (Figura 4). Nota: A distribuição final dos animais deve garantir que metade dos animais são atribuídos para o compartimento inicialmente preferencial e a outra metade para o compartimento não-preferenciais. Além disso, metade dos animais recebeu a droga em um compartimento (por exemplo, aquele preto) e a outra metade no outro (no caso, o branquinho).</li>
			<li>Golo de equilíbrio no grupo dentro ambos os compartimentos, bem como em grupos (diferenças de grupo de teste com análise de variância (ANOVA)). Como orientação aproximada, os valores devem ser em torno de 360-370 s no teste de pré-C (Figura 4). Nota: não houve diferença significativa deve ser detectada entre o tempo gasto em compartimentos do droga-emparelhado e veículo-emparelhado durante o teste de pré-C.</li>
			<li>Exclua os animais que apresentem uma forte aversão ou preferência para qualquer compartimento. Considere aversão como gastando menos tempo do que 33% no compartimento e considerar a preferência quando o animal passou mais de 67% do tempo total naquele compartimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
(4 dias) de condicionamento (Figura 5)
		<ol>
<li>Pesar os animais e usar estes pesos para doses de cocaína durante o condicionamento.</li>
			<li>Prepare as seringas com cocaína ou soro fisiológico com base no peso corporal.</li>
			<li>Injetar um rato em um momento intraperitonealmente (ip) e imediatamente, coloque-a suavemente no compartimento preto ou branco atribuído de sua caixa.</li>
			<li>Após um intervalo de 4h, injete a dose da droga, imediatamente antes que o mouse está confinado ao compartimento da droga-emparelhado por 30 min (Figura 5).</li>
			<li>Este procedimento alternativo cada dia, começando com cocaína nos dias 1 e 3 e salinos nos dias 2 e 4.</li>
			<li>Verifique que o confinamento é realizado em ambos os casos, fechando a porta de guilhotina que separa os dois compartimentos, tornando a área central inacessíveis. Nota: Nesta fase, não há nenhuma necessidade de configurar o programa do PC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Pós-condicionado (Post-C) (1 dia)
		<ol>
<li>Trazer os animais para a sala de teste e deixá-los habituados por 15 min.</li>
			<li>Remova a porta de guilhotina, separando os dois compartimentos.</li>
			<li>Configure o computador e o programa. Insira o animal IDs e pressione o comando "start".</li>
			<li>Registrar o tempo gasto pelos ratos não tratados em cada compartimento durante um período de observação de s 900.</li>
			<li>Quando o julgamento for concluído, trazer todos os animais em jaulas em casa e salvar os dados.</li>
			<li>Considere que a droga tem induzido preferência de lugar se o tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado durante o Post-C é significativamente maior do que no teste de pré-C. Se ocorre o contrário, considere uma aversão para o compartimento de droga-emparelhado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Extinção
	<ol>
<li>Realizar uma sessão semanal de extinção em todos os grupos/animais que desenvolveu uma preferência para o compartimento de droga-emparelhado.</li>
		<li>Coloque o animal no aparelho (sem guilhotinas) por 15 min (mesmo que os testes pré e Post-C) (Figura 1). Nota: Se a dose empregada no CPP é alto (25 mg/kg), executar 1 sessão de extinção por semana. Se uma dose abaixo do limite é usado (1 mg/kg), em seguida, execute 2 extinção sessões por semana (por exemplo, segunda-feira e quinta-feira).</li>
		<li>Considere a preferência extinguida quando dados de teste a extinção não mostram diferenças em relação ao teste pré-C, mas eles mostram diferenças em relação ao teste Post-C.</li>
		<li>Repita o teste 24h mais tarde para confirmar a extinção.</li>
	</ol></li>
	<li>Restabelecimento do CPP
	<ol>
<li>
Reintegração de escorva-induzido
		<ol>
<li>Avalie os efeitos de uma dose de escorva de cocaína 24h após extinção tenha sido confirmada. Nota: Doses de Priming são metade da dose anterior que o animal tenha recebido durante o condicionamento. O teste de reintegração sofre o mesmo protocolo como Pre-C e testes Post-C, exceto que os animais recebem a dose de cocaína em um contingente de não colocar 15 min antes do teste. A eficácia de escorva de drogas na indução de reintegração pode ser reforçada após extinção/reintegração repetida experiências23, embora a ordem das doses não parece desempenhar um papel nos resultados obtidos36.</li>
			<li>Trazer os animais para um quarto diferente da sala de testes (não-contingentes lugar) (Figura 6).</li>
			<li>Injetá-las com metade da dose anterior de cocaína (por exemplo, se os animais foram condicionados com 25 mg/kg de cocaína, uma dose de escorva seria 12,5 mg/kg).</li>
			<li>Trazê-los de volta para seu viveiro durante 15 min.</li>
			<li>Levá-los para a sala de testes e colocar os animais no aparelho imediatamente (sem as portas de guilhotina separando os compartimentos) por 15 min (mesmo que o pré e Post-C testes).</li>
			<li>Considere a diferença em segundos entre o tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado durante a última sessão de extinção e o teste de reintegração como uma medida do grau de restabelecimento da preferência induzida pela droga.</li>
			<li>Repita o procedimento de extinção-reintegração cada vez com a diminuição de doses até que ele é confirmado para ser ineficaz. Nota: Um controle de injeção de solução salina pode ser usado para controlar a capacidade de escorva de cocaína (e não de injeção em si) para induzir a reintegração.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Reintegração induzida por estresse
		<ol>
<li>Avaliar os efeitos de uma reintegração de estresse induzido por 24 h após extinção foi confirmada Nota: Testes de reintegração são os mesmos que os realizados em Post-C (livre deambulação por 15 min), exceto que os animais são testados 15 min após a derrota social em uma agonística encontro (Figura 6)</li>
			<li>Leve os animais para um quarto diferente da sala de CPP.</li>
			<li>Coloque o mouse experimental com um sexo agressivo oponente correspondido de igual idade e peso corporal na gaiola plástica (Figura 6). Nota: O encontro agonístico consiste em um teste de 10 min em uma gaiola plástica transparente (23x13.5x13cm) neutro com um resultado de derrota para o mouse experimental. Para preparar o adversário agressivo, primeiro Isole animais diferentes que correspondem na idade e peso corporal, como os ratos experimentais por 3 semanas. Treiná-los para adquirir experiência de combate e testá-los para ter altos níveis de agressividade territorial. Para obter coespecíficos agressivos, ratos devem ser isolados pelo menos 3 semanas e em seguida, treinou em agressivo e comportamentos de ataque. Os animais são treinados em um ambiente neutro, enfrentando-os em pares. Deixamo-los morder as vezes adversário 2 ou 3 e tirar-lhes a gaiola, sempre terminando o treinamento antes de um dos dois ratos mostra submissão, para que a experiência do encontro reforça o comportamento agressivo. Após sofrer agressão (ameaça e ataque do conspecific agressivo), ratos experimentais devem apresentar evasão/fugir e comportamento defensivo/submisso. O critério é adotar uma postura específica da derrota, caracterizada por uma posição ereta e submissa, mancar dianteiras, cabeça angular ascendente e retraído orelhas (Figura 6). De acordo com Burke et al, 2016, consideramos que o encontro social é encerrado antes, se o intruso exibe uma postura submissa supina para > 8 s ou se 13 mordidas de ataque ocorreram. Outra opção para animais de tela sem risco de lesão significativa poderia ser ao ritmo do animal em um gabinete de malha com um buraco, não é grande o suficiente para qualquer animal passar.  Agressão pode ser detectado sem submeter animais para direcionar o comportamento agressivo.  Se um animal sustenta uma lesão com um ferimento de 1cm de diâmetro e/ou exposição direta do músculo, ele é excluído do estudo e deve ser sacrificado.</li>
			<li>Após 10 min de encontro agonístico, levar os ratos em sala de testes e colocar os animais no aparato de CPP imediatamente (sem as portas de guilhotina separando os compartimentos) por 15 min (mesmo que o pré e Post-C testes).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. análise estatística
Nota: O tamanho de amostra Ideal deve ser um mínimo de 15 animais por grupo.
<ol><li>Analisar o tempo médio gasto no compartimento do droga-emparelhado do grupo através de uma ANOVA mista com um entre variável, tratamento, com dois níveis (grupo controle, Grupo Experimental, a exemplo dos dois grupos está na Figura 7C) e um dentro variável – dias, com 2 níveis (Pre-C e Post-C). Nota: No grupo controle, animais recebem a droga mas tem sem manipulações ambientais. Por outro lado, no grupo experimental, os animais estão expostos a diferentes condições ambientais. Compare o tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado no dia Post-C com respeito a Pre-C teste para ver se existem diferenças significativas de sensibilidade à droga.</li>
	<li>Além disso, realize análises post-hoc de Bonferroni para verificar qualquer um dos escores significativos.</li>
	<li>Analisar dados relacionados a valores de extinção e reintegração dos grupos que preferência desenvolvida por meio de testes t Student´s para continuar com o processo de extinção-reintegração no decorrer do experimento, mas no momento final, analisá-los com uma ANOVA com um dentro variável (dias) com o número de níveis, dependendo de cada grupo. Nota: Quando o número de comparações é aumentado, o número daqueles que será significativo por acaso também aumentou. Como tal, para evitar falsos positivos (erros de tipo 1) nós 'corrigir' o p-valor, tornando o teste mais conservadores com a correção de Bonferroni para vários t-testes. No entanto, para o teste de reintegração, a comparação deve ser feita entre o teste de reintegração e o último teste de extinção. Portanto, não há nenhuma necessidade de correção.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ponto-chave de pesquisa de dependência de drogas é o desenvolvimento de tratamentos que diminuem o desejo e, consequentemente, reduzir a vulnerabilidade para uma recaída. Graças ao modelo de reintegração do paradigma CPP, é possível estudar a influência de diferentes fatores ambientais e processuais que modulam a recaída, o que constitui uma prioridade de pesquisa futura. Existem alguns pontos importantes a considerar, como o paradigma do CPP é um teste altamente sensível a fatores ambientais.
<p class=...

O paradigma de preferência de lugar condicionado (CPP) oferece uma maneira simples de avaliar a recompensa condicionada induzida por estímulos diversos1,2e tem sido usado amplamente para estudar os efeitos condicionados gratificantes de drogas que viciam3 . É baseado no condicionamento pavloviano, avaliando o valor motivacional de pistas ambientais associadas a drogas para manter comportamento viciante4. Neste modelo, pistas ambientais adquirem Propriedades repetido secundário (acondicionados recompensadores efeitos) quando emparelhado com um reforçador primário3. Por exemplo, um lugar inicialmente neutro (como a cor de um compartimento na gaiola CPP) é combinado com os efeitos específicos de uma droga de abuso durante algumas sessões5, enquanto outro compartimento está associado com a injeção de um veículo de condicionamento. Após o condicionamento, se o animal passa mais tempo no compartimento anteriormente associado com a droga, presume-se que o CPP desenvolveu3. O estabelecimento da preferência é alcançado quando o animal dá um valor positivo para as pistas ambientais ligadas à droga, que é o reforçador primário. Consequentemente, animais irão executar respostas comportamentais de remédios em resposta a essas pistas contextuais6. O modelo do CPP permite a avaliação das propriedades gratificantes de doses abaixo do limite da droga, mostrando-se os animais em uma condição específica (por exemplo, tendo sofrido de derrota social anteriormente) são mais vulneráveis e sensíveis às doses que são Não é eficaz em ingênuo animais7.
O modelo CPP também tem sido usado para avaliar extinção/reintegração como um modelo animal para estudar a recaída3, qual é o objectivo do presente protocolo. Existem três diferentes fases: aquisição, extinção e reintegração (Figura 1). No modelo de reintegração de CPP, animais primeiro adquirem o CPP para um compartimento de droga-emparelhado, e então eles executam várias sessões de extinção. Definimos a extinção como o momento em que o animal reduz suas respostas comportamentais de aproximação a um estímulo gratificante condicionado que tenha sido removido (por exemplo, a droga)8. Durante as sessões de extinção, animais explorar os compartimentos na ausência da droga, para que a preferência adquirida é gradualmente atenuada9. Uma questão importante a considerar é que a mudança de comportamento que o animal apresenta durante a extinção (a diminuição progressiva do tempo gasto no compartimento do droga-emparelhado) pode ser devido a novos processos de aprendizagem que competir com a anterior resposta aprendida, ou devido a uma diminuição no estado motivacional interno do sujeito3. Finalmente, o restabelecimento da preferência local através do contexto ou drogas sinais seria o nosso modelo de reintegração1.
Administrar uma injecção de escorva da droga associada pode restabelecer a preferência, que é considerada um restabelecimento da aproximação para as pistas contextuais. Reintegração de drogas escorva ocorre devido à memória persistente dos efeitos prazerosos da droga, que induziu o desejo e motiva os animais a procurar as pistas ambientais relacionadas à recompensa.
Algumas vantagens do modelo de reintegração de CPP são de que o procedimento não-invasivo (em contraste com a automedicação, que requer cirurgia), barato e simples. Além disso, este modelo tem uma validade de critério de bom, como ele imita bem o que ocorre em seres humanos10,11, induzindo a reintegração com estímulos que induzem a recaída, tais como re-exposição à droga12,13 ou estresse14.
Existem outras técnicas, como a extinção – modelo de reintegração de auto-administração intravenosa. Aqui, os animais pressionar uma alavanca para auto-administrar a droga, o que permite a avaliação da resposta operante do animal, compulsivity e motivação14,15,16. A principal vantagem do CPP sobre procedimentos de auto-administração é que a reintegração do CPP é considerada para refletir a reativação do valor incentivo motivacional dos estímulos contexto emparelhado com a droga, consistindo o reaparecimento da abordagem comportamento para o contexto de17. Além disso, estímulos não-farmacológicos, tais como estresse, também podem induzir a reintegração18,19. Por exemplo, um estudo de auto-administração descrito sem efeitos na reintegração do consumo de heroína em ratos depois de um choque de pé ou retenção stress20. Autores discutiram que era mal sucedida porque esses estressores foram testadas fora da câmara de auto-administração em um contexto diferente. Em contraste, quando usando o modelo CPP de reintegração, havia um claro re-establishment da CPP induzida pela morfina depois de usar as mesmas estressores e aplicado em um contexto diferente do CPP e em momentos diferentes (0 e 15 min depois da exposição de estresse)18 .
Vários estudos na literatura têm demonstrado maneiras diferentes de drogas e reintegração induzida por estresse. Por um lado, a reintegração induzida por drogas tem sido relatada em ratos e camundongos usando morfina5,21,22,23, cocaína24,25, anfetamina26, 27, etanol28,29e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA)30. Por outro lado, a exposição ao estresse pode ser um factor determinante na vulnerabilidade ao abuso de drogas. Stress é conhecida por aumentar os efeitos gratificantes de drogas7,31,32 e seu papel na recaída é bem estabelecida33,34. Por exemplo, a derrota em interações sociais com um conspecific reabilita morfina e cocaína CPP18,19. Além disso, animais expostos a repetida derrota social são mais vulneráveis aos efeitos condicionados gratificantes de doses abaixo do limite de cocaína e restabelecer a preferência com muito baixas doses de cocaína,7.
Aplicação do modelo de reintegração de CPP é uma maneira útil e sensível para avaliar a vulnerabilidade para a recaída em animais e permite a avaliação de diferentes manipulações ambientais sutis, que são os principais gatilhos que ameaçam recaída humana, tais como reintegração ou estresse-induzido.

<table><tbody><tr><td>MONPRE 2Z software</td><td>CIBERTEC S.A., Spain</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Identical Plexiglas boxes with two equal sized compartments separated by a grey central area.</td><td>CIBERTEC S.A., Spain</td><td>N/A</td><td>The compartments have different colored walls (black vs white) and distinct floor textures (fine grid in the black compartment and wide grid in the white one). All boxes are equipped with four infrared light beams in each compartment of the box and six in the central area which allow the recording of the position of the animal and its crossings from one compartment to the other.</td></tr><tr><td>Cocaine hydrochloride</td><td>Laboratorios Alcaliber S.A., Madrid, Spain</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Animals: mice of the OF1 outbred strain</td><td>Charles River, Barcelona Spain</td><td>N/A</td><td>Male mice who arrive to the laboratory on PND 42 and on PND 60 perform the CPP test. These animals are specially indicated for social defeat and aggression models.</td></tr><tr><td>Standard Diet- Teklad Global Diet 2014</td><td>Supplied by Harlan Laboratories Models, S. L. (Barcelona, Spain)</td><td></td><td>13 kcal % fat, 67 kcal % carbohydrates and 20% kcal protein; 2.9 kcal/g</td></tr><tr><td>High fat diet TD.06415</td><td></td><td></td><td>45 kcal % fat, 36 kcal % carbohydrates and 19% kcal protein; 4.6 kcal/g</td></tr></tbody></table>

reinstatement of drug-seeking in mice using the conditioned place preference paradigm

O presente protocolo descreve a preferência de lugar condicionado (CPP) como um modelo de recaída no vício em drogas. Neste modelo, animais primeiro são treinados para adquirir uma preferência de lugar condicionados em um compartimento de droga-emparelhado, e após o teste post-condicionado, eles realizam várias sessões para extinguir a preferência estabelecida. O CPP permite a avaliação dos efeitos condicionados gratificantes de pistas relacionadas ao meio ambiente de drogas. Em seguida, o CPP extinto pode ser robustamente restabelecido pela administração de uma dose de escorva da droga não-contingentes e pela exposição aos estímulos estressantes. Ambos os métodos serão explicados aqui. Quando o animal reinicia a resposta comportamental, é considerado um restabelecimento da recompensa condicionado tiveram lugar.
As principais vantagens do presente protocolo são que é não-invasivo, barato e simples, com critérios de validade boa. Além disso, permite o estudo de diferentes manipulações ambientais, tais como o stress ou a dieta, que pode modular a recaída em comportamentos de busca de drogas. No entanto, uma limitação é que, se o pesquisador pretende explorar a motivação e os efeitos de reforçados primários da droga, deve ser complementado com procedimentos de auto-administração, envolvem respostas operante de animais.

Em primeiro lugar, resultados representativos da reintegração de escorva - e induzida por estresse são mostrados na Figura 7 usando ratos machos adultos de OF1.
Os dados na Figura 7a-b , que representa o tempo gasto no compartimento de droga-emparelhado no pré e Post-C teste foram analisados com um medidas repetidas ANOVA com um dias variável dentr...

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Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm

Este protocolo descreve a preferência de lugar condicionado (CPP) como um modelo de recaída. Este procedimento permite a medição de recaída em animais de laboratório, considerando o impacto das drogas associadas Dicas ambientais como desejo e recaída em viciados em ausência é, atualmente, o foco dos programas de tratamento do abuso de drogas.

Reintegração de busca de drogas em ratos utilizando o paradigma de preferência lugar condicionado

The present protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse in drug addiction. In this model, animals are first trained to ...

reinstatement-drug-seeking-mice-using-conditioned-place-preference

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Behavior

Unit 1

Pharmacotherapy of Depression and Anxiety Disorders

SCIENTISTS IN ACTION

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Vídeo: Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Comportamento

A Procedure to Study the Effect of Prolonged Food Restriction on Heroin Seeking in Abstinent Rats

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during abstinence. Moreover, various environmental challenges can exacerbate this effect, as well as increase ongoing drug intake.
The procedure we describe here highlights the impact of a common environmental challenge, food restriction, on drug craving that is expressed as an augmentation of drug seeking in abstinent rats.
Rats are implanted with chronic intravenous i.v. catheters, and then trained to press a lever for i.v. heroin over a period of 10-12 days. Following the heroin self-administration phase the rats are removed from the operant conditioning chambers and housed in the animal care facility for a period of at least 14 days. While one group is maintained under unrestricted access to food (sated group), a second group (FDR group) is exposed to a mild food restriction regimen that results in their body weights maintained at 90% of their nonrestricted body weight. On day 14 of food restriction the rats are transferred back to the drug-training environment, and a drug-seeking test is run under extinction conditions (i.e.&#160;lever presses do not result in heroin delivery).
The procedure presented here results in a highly robust augmentation of heroin seeking on test day in the food restricted rats. In addition, compared to the acute food deprivation manipulations we have used before, the current procedure is a more clinically relevant model for the impact of caloric restriction on drug seeking. Moreover, it might be closer to the human condition as the rats are not required to go through an extinction-training phase before the drug-seeking test, which is an integral component of the popular reinstatement procedure.

A procedure that allows a demonstration of robust augmentation of drug seeking in food-restricted rats is described. Following heroin self-administration training, rats go through an abstinence period, in a drug-free environment, during which they are mildly food restricted. Drug seeking is then tested in the drug-associated environment.

Um procedimento para estudar o efeito da restrição alimentar prolongada em heroína Buscando em ratos abstinentes

In human drug addicts, exposure to drug-associated cues or environments that were previously associated with drug taking can trigger relapse during ...

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats 

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Neurociência

Operant Sensation Seeking in the Mouse

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior. These 'self-administration' methods have been used extensively in drug addiction research due to their high construct validity. Operant studies provide researchers a tool for preclinical investigation of several aspects of the addiction process. For example, mechanisms of acute reinforcement (both drug and non-drug) can be tested using pharmacological or genetic tools to determine the ability of a molecular target to influence self-administration behavior1-6. Additionally, drug or food seeking behaviors can be studied in the absence of the primary reinforcer, and the ability of pharmacological compounds to disrupt this process is a preclinical model for discovery of molecular targets and compounds that may be useful for the treatment of addiction3,7-9. One problem with performing intravenous drug self-administration studies in the mouse is the technical difficulty of maintaining catheter patency. Attrition rates in these experiments are high and can reach 40% or higher10-15. Another general problem with drug self-administration is discerning which pharmacologically-induced effects of the reinforcer produce specific behaviors. For example, measurement of the reinforcing and neurological effects of psychostimulants can be confounded by their psychomotor effects. Operant methods using food reinforcement can avoid these pitfalls, although their utility in studying drug addiction is limited by the fact that some manipulations that alter drug self-administration have a minimal impact on food self-administration. For example, mesolimbic dopamine lesion or knockout of the D1 dopamine receptor reduce cocaine self-administration without having a significant impact on food self-administration 12,16. 
Sensory stimuli have been described for their ability to support operant responding as primary reinforcers (i.e. not conditioned reinforcers)17-22. Auditory and visual stimuli are self-administered by several species18,21,23, although surprisingly little is known about the neural mechanisms underlying this reinforcement. The operant sensation seeking (OSS) model is a robust model for obtaining sensory self-administration in the mouse, allowing the study of neural mechanisms important in sensory reinforcement24. An additional advantage of OSS is the ability to screen mutant mice for differences in operant behavior that may be relevant to addiction. We have reported that dopamine D1 receptor knockout mice, previously shown to be deficient in psychostimulant self-administration, also fail to acquire OSS24. This is a unique finding in that these mice are capable of learning an operant task when food is used as a reinforcer. While operant studies using food reinforcement can be useful in the study of general motivated behavior and the mechanisms underlying food reinforcement, as mentioned above, these studies are limited in their application to studying molecular mechanisms of drug addiction. Thus, there may be similar neural substrates mediating sensory and psychostimulant reinforcement that are distinct from food reinforcement, which would make OSS a particularly attractive model for the study of drug addiction processes. The degree of overlap between other molecular targets of OSS and drug reinforcers is unclear, but is a topic that we are currently pursuing. While some aspects of addiction such as resistance to extinction may be observed with OSS, we have found that escalation 25 is not observed in this model24. Interestingly, escalation of intake and some other aspects of addiction are observed with self-administration of sucrose26. Thus, when non-drug operant procedures are desired to study addiction-related processes, food or sensory reinforcers can be chosen to best fit the particular question being asked. 
In conclusion, both food self-administration and OSS in the mouse have the advantage of not requiring an intravenous catheter, which allows a higher throughput means to study the effects of pharmacological or genetic manipulation of neural targets involved in motivation. While operant testing using food as a reinforcer is particularly useful in the study of the regulation of food intake, OSS is particularly apt for studying reinforcement mechanisms of sensory stimuli and may have broad applicability to novelty seeking and addiction.

In this protocol we describe a method of operant learning using sensory stimuli as a reinforcer in the mouse. It requires no prior training or food restriction, and it allows the study of motivated behavior without the use of a pharmacological or natural reinforcer such as food.

Sensation operante que procura no mouse

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior.  These 'self-administration' methods have been used extensively in drug ...

Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to drugs of abuse make lasting alterations in the brain function of vulnerable individuals, and these persistent alterations likely serve to maintain the maladaptive drug seeking and taking behaviors characteristic of addiction/dependence2. In rodents, reward experience and contextual associations are frequently measured using the conditioned place preference assay, or CPP, wherein preference for a previously drug-paired context is measured. Behavioral sensitization, on the other hand, is an increase in a drug-induced behavior that develops progressively over repeated exposures. Since sensitized behaviors can often be measured after several months of drug abstinence, depending on the dose and length of initial exposure, they are considered observable correlates of lasting drug-induced plasticity. Researchers have found these assays useful in determining the neurobiological substrates mediating aspects of addiction as well as assessing the potential of different interventions in disrupting these behaviors. This manuscript describes basic, effective protocols for mouse CPP and locomotor behavioral sensitization to cocaine.

This protocol is intended to enable researchers to conduct experiments designed to test these aspects of addiction using the conditioned place preference and locomotor behavioral sensitization assays.

Avaliação da sensibilização comportamental induzida por cocaína e preferência por lugar condicionado em Ratos

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and relapse to food taking 1. Food craving conceptualized in this way is akin to drug craving in response to drug-paired cues. A rich literature has been developed around understanding the behavioral and neurobiological determinants of drug craving; we and others have been focusing recently on translating techniques from basic addiction research to better understand addiction-like behaviors related to food 2-4.
As done in previous studies of drug craving, we examine sucrose craving behavior by utilizing a rat model of relapse. In this model, rats self-administer either drug or food in sessions over several days. In a session, lever responding delivers the reward along with a tone+light stimulus. Craving behavior is then operationally defined as responding in a subsequent session where the reward is not available. Rats will reliably respond for the tone+light stimulus, likely due to its acquired conditioned reinforcing properties 5. This behavior is sometimes referred to as sucrose seeking or cue reactivity. In the present discussion we will use the term "sucrose craving" to subsume both of these constructs.
In the past decade, we have focused on how the length of time following reward self-administration influences reward craving. Interestingly, rats increase responding for the reward-paired cue over the course of several weeks of a period of forced-abstinence. This "incubation of craving" is observed in rats that have self-administered either food or drugs of abuse 4,6. This time-dependent increase in craving we have identified in the animal model may have great potential relevance to human drug and food addiction behaviors.
Here we present a protocol for assessing incubation of sucrose craving in rats. Variants of the procedure will be indicated where craving is assessed as responding for a discrete sucrose-paired cue following extinction of lever pressing within the sucrose self-administration context (Extinction without cues) or as responding for sucrose-paired cues in a general extinction context (Extinction with cues).

Responding for food or drug-paired cues increases over the course of a period of abstinence and this may relate to an increased susceptibility to relapse behaviors. Here we detail a procedure for evaluating this "incubation of craving" in rats that have self-administered sucrose.

Um método geral para a avaliação de Incubação de Craving Sacarose em Ratos

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed incubation of drug craving. Here, we describe a morphine conditioned place preference (CPP) protocol for measuring the incubation of craving in rats. In this protocol, a CPP paradigm mainly employing somatosensory cues is used to establish a long-term reward memory of morphine. A three-chamber CPP box that differs in the texture of the chamber floor is constructed. First, the animals are tested for their baseline preference to the two side chambers for three consecutive days. Then, they are injected intraperitoneally with morphine/saline and put into their non-preferred/preferred chamber for 45 min. After 6 days of conditioning, their preference to the side chambers is tested for 15 min at different time points after the last conditioning session. With this paradigm, the reward memory of morphine could last for at least 18 days. To test whether the above-mentioned protocol can model increased craving, the number of entrances into the two side chambers are counted during the abstinence period. The results show that the entrances increased, suggesting that the CPP paradigm could mimic the incubation of craving. Future studies can employ this model to study neural mechanisms underlying long-term memory and incubation of craving.

Here, a morphine conditioned place preference (CPP) protocol is described to measure incubation of craving in rats.

Um protocolo de preferência condicionada lugar para medir a incubação do desejo em ratos

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...

A Procedure to Study Stress-Induced Relapse of Heroin Seeking after Punishment-Imposed Abstinence

The punishment-imposed abstinence procedure models the self-imposed abstinence that humans initiate due to the adverse consequences associated with drug-taking. This model has been implemented in experiments using different types of substances of abuse such as methamphetamine, cocaine, and alcohol. However, punishment-induced abstinence in heroin-trained animals has not been demonstrated. Furthermore, acute stress is a key trigger for relapse in humans and animal models. It was previously demonstrated that acute food deprivation robustly induced reinstatement of extinguished cocaine and heroin seeking. The procedure described here can be used to assess the effects of acute stress exposure on heroin seeking after punishment-imposed abstinence. A total of 8 rats were implanted with chronic intravenous (i.v.) catheters and trained to self-administer heroin (0.1 mg/kg/infusion) for 18 days under a seek-take chained schedule. Completing the seek link gave access to the take lever, which was paired with a heroin infusion. The seek lever was programmed with a variable interval 60 schedule of reinforcement (VI60), and the take lever was programmed with a fixed-ratio 1 reinforcement schedule (FR1). Following self-administration training, a mild foot shock was delivered on 30% of the completed seek links instead of the extension of the take lever. Footshock intensity was increased by 0.1 mA per daily session from 0.2 mA to 1.0 mA. Heroin-seeking tests were performed after 24 h of food deprivation (FD) or sated conditions. Rats under acute food deprivation condition robustly increased heroin seeking after punishment-imposed abstinence.

A procedure that demonstrates a robust acute food deprivation-induced relapse to heroin seeking after punishment-imposed abstinence is described. A punishment-imposed abstinence model was successfully implemented using the seek and take chain schedule for heroin self-administration. Heroin-seeking tests are then performed following 24 h of food-deprivation stress.

Um procedimento para estudar a recaída induzida pelo estresse da busca de heroína após a abstinência imposta pela punição

The punishment-imposed abstinence procedure models the self-imposed abstinence that humans initiate due to the adverse consequences associated with ...

A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue reactivity, the sensitivity to cues previously linked with the drug-taking experience, plays a prominent role in human craving during abstinence. Cue reactivity can be assessed as the attentional orientation toward drug-associated cues that is measurable as appetitive approach behavior in both preclinical and human studies. Herein describes an assessment of cue reactivity in rats trained to self-administer cocaine. Cocaine self-administration is paired with the presentation of discrete cues that act as conditioned reinforcers (i.e., house light, stimulus light, infusion pump sounds). Following a period of abstinence, lever presses in the cocaine self-administration context accompanied by the discrete cues previously paired with cocaine infusion are measured as cue reactivity. This model is useful to explore neurobiological mechanisms underlying cue reactivity processes as well as to assess pharmacotherapies to suppress cue reactivity and therefore, modify relapse vulnerability. Advantages of the model include its translational relevance, and its face and predictive validities.&#160;The primary limitation of the model is that the cue reactivity task can only be performed infrequently and must only be used in short duration (e.g., 1 hour), otherwise rats will begin to extinguish the pairing of the discrete cues with the cocaine stimulus. The model is extendable to any positively reinforcing stimulus paired with discrete cues; though particularly applicable to drugs of abuse, this model may hold future applications in fields such as obesity, where palatable food rewards can act as positively reinforcing stimuli.

Cue reactivity is conceptualized as sensitivity to cues linked with drug-taking experiences that contribute to craving and relapse in abstinent humans. Cue reactivity is modeled in rats by measuring attentional orientation toward drug-associated cues that results in appetitive approach behavior in a cue reactivity test following self-administration and forced abstinence.

Um protocolo para medição de reatividade de Cue em um modelo do rato do transtorno de uso de cocaína

Cocaine use disorder (CUD) follows a trajectory of repetitive self-administration during which previously neutral stimuli gain incentive value. Cue ...

Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats

This protocol demonstrates the steps needed to use optogenetic tools to reverse cocaine-induced plasticity at thalamo-amygdala circuits to reduce subsequent cocaine seeking behaviors in the rat. In our research, we had found that when rats self-administer intravenous cocaine paired with an audiovisual cue, synapses formed at inputs from the medial geniculate nucleus of the thalamus (MGN) onto principal neurons of the lateral amygdala (LA) become stronger as the cue-cocaine association is learned. We hypothesized that reversal of the cocaine-induced plasticity at these synapses would reduce cue-motivated cocaine seeking behavior. In order to accomplish this type of neuromodulation in vivo, we wanted to induce synaptic long-term depression (LTD), which decreases the strength of MGN-LA synapses. To this end, we used optogenetics, which allows neuromodulation of brain circuits using light. The excitatory opsin oChiEF was expressed on presynaptic MGN terminals in the LA by infusing an AAV containing oChiEF into the MGN. Optical fibers were then implanted in the LA and 473 nm laser light was pulsed at a frequency of 1 Hz for 15 minutes to induce LTD and reverse cocaine induced plasticity. This manipulation produces a long-lasting reduction in the ability of cues associated with cocaine to induce drug seeking actions.

The methods described here outline a procedure used to optogenetically reverse cocaine-induced plasticity in a behaviorally-relevant circuit in rats. Sustained low-frequency optical stimulation of thalamo-amygdala synapses induces long-term depression (LTD). In vivo optogenetically-induced LTD in cocaine-experienced rats resulted in the subsequent attenuation of cue-motivated drug seeking.