Este trabalho foi apoiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J. e uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para S.R.W. e J.H.

O uso de ratos foi aprovado pelo cuidado institucional do Animal e usar o Comitê da Universidade Johns Hopkins. Experimentos foram realizados no juvenil (20-26 dias pós-parto, dpp) camundongos C57BL/6J, aproveitando-se da primeira onda semisíncrona de espermatogênese. No entanto, esta técnica também pode ser realizada usando ratos adultos.
1. dissecção e o isolamento dos túbulos seminíferos do mouse
<ol><li>Prepare o reparo/solução e anticorpo diluição do lysis (ADB) descrito na tabela 1 e tabela 2.</li>
	<li>Prepare um prato de Petri 35mm com 3 mL de 1x tampão fosfato solução salina (1X PBS, pH 7,4) e um outro prato de 35 mm com 2 mL da solução de correção/lise por rato.</li>
	<li>Sacrificar o mouse através de deslocamento cervical ou CO2 asfixia e pulverizar o abdômen ventral com etanol a 70%. Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Então remova os testículos puxando a epidídimo almofada gorda usando fórceps e evitar perturbar a túnica albugínea. Coloque os testículos em um prato de Petri 35mm contendo 1X PBS. Nota: Utilize a primeira onda de espermatogênese para observar uma população celular enriquecido de interesse14. Estágios específicos da espermatogênese são enriquecidos em idades diferentes do rato (tabela 3).</li>
	<li>Remova o testicular túnica albugínea , perfurando o tecido com pinças com pontas afiadas e coletar túbulos seminíferos soltos. Transferi os túbulos para um novo 35mm placa de Petri contendo 2 mL de solução de Lise/fix.</li>
	<li>Incube os túbulos na solução fix/lise durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparação dos túbulos seminíferos
<ol><li>Prepare um slide de vidro revestido de poli-L-lisina, delineando as bordas da lâmina com uma caneta de bloqueador de líquido.</li>
	<li>Aplicam-se 100 µ l de solução de Lise/fix para o centro da lâmina de vidro.</li>
	<li>Usando Pinças esterilizadas e tesoura suavemente arreliar distante dos túbulos seminíferos. Corte de tempo individual túbulo segmentos aproximadamente 20 mm de comprimento. Nota: Para visualizar estruturas que são sensíveis à exposição prolongada de fixador, tais como as centrossomas, primeiro, separar os túbulos na PBS 1x e, em seguida, picar diretamente os túbulos na superfície dos slides de poli-lisina revestido em 100 µ l de solução de Lise-fix.</li>
	<li>Transferência de cinco segmentos de tubo seminífero longo de 20mm para o slide de vidro revestido de poli-L-lysine preparados contendo solução fix/Lise.</li>
	<li>Usando a tesoura estéril carne moída tubules seminiferous em segmentos de 1,5 a 3,0 mm.</li>
	<li>Usando Pinças esterilizadas organizar os segmentos do túbulo sobre a lâmina de vidro para que o tecido não se sobrepõe, e os túbulos são distribuídos uniformemente. Nota: O número ideal de segmentos do túbulo sobre uma lâmina de vidro é entre 20 e 40 anos.</li>
</ol>3. esmagamento dos túbulos seminíferos
<ol><li>Transferi a lâmina de vidro que contém segmentos de tubo seminífero dispersos em uma bancada. Remova o excesso de líquido utilizando um laboratório para evitar a perda de tecido durante a etapa de abóbora.</li>
	<li>Uma lamela (22 x 60-1,5 mm) na parte superior da lâmina de vidro e aplicar pressão com o calcanhar da palma por 10 a 20 segundos. É importante aplicar força suficiente para dispersar espermatócitos de túbulos seminíferos. Nota: Observe os túbulos usando um microscópio de dissecação, a fim de otimizar a etapa de caça aos bugs, para que todos os segmentos do túbulo são rompidos.</li>
	<li>Usando o slide fórceps, imediatamente flash congelar a lâmina de vidro em um pequeno dewar de líquido N2 por 15 segundos, ou até o líquido deixa de bolha. Se immunolabeling imediatamente, remova a lamela com uma lâmina de barbear borda reta, ótimo dica fórceps ou agulha de 21. Nota: Para obter melhores resultados, immunolabel os slides imediatamente (ver passo 4). No entanto, neste ponto slides podem ser preservados a-80 ° C por até duas semanas. Para maximizar a vida útil de proteínas e estruturas celulares, imediatamente armazena os slides em gelo seco ou transferência para um freezer-80 ° C e mantém a lamela no slide. Quando immunolabeling armazenados slides, remova a lamela imergindo os slides no líquido N2 por 15 segundos, conforme descrito na etapa 3.3.</li>
</ol>4. Immunolabeling de túbulos seminíferos montados
<ol><li>Mergulhe o slide em 1X PBS e lavar três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS. Nota: Nunca permita que os slides completamente seco durante immunolabeling.</li>
	<li>Aplica 1 mL de tampão de diluição de anticorpo a lâmina de vidro para bloquear por 1-2 h em uma câmara umidificada.</li>
	<li>Retire o tampão de diluição de anticorpo e aplicar 100 µ l de anticorpo primário, diluído em tampão de diluição de anticorpo em uma câmara umidificada. Nota: Para melhores resultados, incubar os anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm. Validar e otimizar os anticorpos primários15.</li>
	<li>Enxague slides três vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS. Nota: Para aprimorar a lavagens, agitar frascos de Coplin usando uma barra de agitação magnética pequena e coloque em um prato de agitação magnética em baixa velocidade ou coloque a jarra de Coplin em um misturador de mesa a baixa velocidade.</li>
	<li>Aplicam-se 100 µ l de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição de anticorpo para 1 a 1,5 h em uma câmara humidificada à temperatura ambiente. Incube os slides em uma caixa escura para evitar foto branqueamento de anticorpos fluoróforo conjugado. Nota: Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm.</li>
	<li>Enxague slides duas vezes por 5 min em uma jarra de Coplin 50 mL contendo 1X PBS.</li>
	<li>Montar as lâminas no meio de montagem contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e aplique as lamelas (22 x 60-1,5 mm).</li>
	<li>Sele as lamelas para os slides com esmaltes claros para preservar os slides e evitar as lamelas de mover-se.</li>
</ol>5. análise e preparações de abóbora túbulo de imagem
<ol><li>Use um microscópio de epifluorescência com palco automatizado que permite o movimento preciso do eixo z e uma câmera de alta resolução para captura de imagem. Como alternativa, use um microscópio confocal a laser. Nota: Use qualquer software e hardware disponíveis para esta etapa. Por exemplo, imagens exibidas na Figura 1 e Figura 2 foram capturadas usando uma célula de Zeiss observador Z1 ligado a uma câmera CMOS de ORCA-Flash 4.0 e analisados com o software de imagem de edição de Zeiss ZEN 2012 azul.</li>
	<li>Avalie os slides usando um objectivo X 20 para determinar a qualidade da preparação da polpa. Slides de boa qualidade tem uma monocamada de núcleos que são uniformemente distribuídos. Nota: Algumas seções do slide podem ser melhores do que outros, é útil observar as coordenadas de onde as melhores regiões do slide podem ser encontradas para posterior análise utilizando a maior ampliação.</li>
	<li>Usando a maior ampliação objectivo (por exemplo, 63 X ou 100 X), regiões de captura do slide que têm um monolayer consistente dos núcleos. Uma vez que uma região está selecionada, definir a parte superior e menor Z-pilhas para garantir que toda a luz em foco é capturada. Nota: O número ideal de Z-pilhas capturado entre o limite superior e inferior é geralmente designado pelo software de aquisição de imagem e é diferente para cada objetivo.</li>
	<li>Use a software de processamento de imagem para compilar uma imagem de foco estendido de profundidade. O software combina a luz em foco de cada pilha-Z e é essencial para a imagem ideal de preparações de abóbora do túbulo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+aneuploidy:+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem.">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li><li>Morelli, M. A., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+germ+cells+are+created+equal:+Aspects+of+sexual+dimorphism+in+mammalian+meiosis.">Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis.</a> Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).</li><li>Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+meiotic+prophase+I+to+metaphase+I+transition+in+mouse+spermatocytes.">Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes.</a> Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).</li><li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slide+preparation+method+to+preserve+three-dimensional+chromatin+architecture+of+testicular+germ+cells.">Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells.</a> J Vis Exp. (83), e50819 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+spermatogenesis:+how+far+from+clinical+application?.">In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?.</a> Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).</li><li>Staub, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+research+on+mammalian+male+germ+cell+meiotic+differentiation+in+vitro.">A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro.</a> J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).</li><li>Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Squash+procedure+for+protein+immunolocalization+in+meiotic+cells.">Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells.</a> Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Xu, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cryosection+method+for+mouse+testis+tissue.">A modified cryosection method for mouse testis tissue.</a> Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).</li><li>Hess, R., Moore, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+methods+for+evaluation+of+the+testis.">Histological methods for evaluation of the testis.</a> Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).</li><li>Bellv&#233;, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+culture,+and+fractionation+of+spermatogenic+cells.">Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).</li><li>Bellv&#233;, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+mouse+testis+and+characterization+of+isolated+spermatogenic+cells.">Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells.</a> J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination,+pairing,+and+synapsis+of+homologs+during+meiosis.">Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+recombination:+the+essence+of+heredity.">Meiotic recombination: the essence of heredity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).</li><li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere+and+telomere+movements+during+early+meiotic+prophase+of+mouse+and+man+are+associated+with+the+onset+of+pairing.">Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing.</a> J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).</li><li>Zickler, D., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leptotene-zygotene+transition+of+meiosis.">The leptotene-zygotene transition of meiosis.</a> Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).</li><li>Scherthan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bouquet+makes+ends+meet.">A bouquet makes ends meet.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).</li><li>Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiotic+sex+chromosome+inactivation.">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li><li>Royo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+acts+stage+specifically+to+regulate+multiple+aspects+of+mammalian+meiotic+silencing.">ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing.</a> Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).</li><li>Turner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+unsynapsed+meiotic+chromosomes+in+the+mouse.">Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse.</a> Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).</li><li>Marjanovi&#263;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEP63+deficiency+promotes+p53-dependent+microcephaly+and+reveals+a+role+for+the+centrosome+in+meiotic+recombination.">CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination.</a> Nat Commun. 6, 7676 (2016).</li><li>Inan&#231;, B., Dodson, H., Morrison, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Centrosome-autonomous+signal+that+involves+centriole+disengagement+permits+centrosome+duplication+in+G2+phase+after+DNA+damage.">A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage.</a> Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+mammalian+sperm+cells+identifies+new+components+of+the+centrosome.">Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).</li><li>Fukuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transacting+factor+CBF-A/Hnrnpab+binds+to+the+A2RE/RTS+element+of+protamine+2+mRNA+and+contributes+to+its+translational+regulation+during+mouse+spermatogenesis.">The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).</li><li>Lahn, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Previously+uncharacterized+histone+acetyltransferases+implicated+in+mammalian+spermatogenesis.">Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).</li><li>Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosomal+association+of+histone+macroH2A1.2+in+embryonic+stem+cells+and+somatic+cells.">Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells.</a> Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).</li><li>Shanmugam, M., Hernandez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+for+SNAP45,+a+subunit+of+the+small+nuclear+RNA-activating+protein+complex+SNAPc.">Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).</li><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability.">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Amory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+spermatogenesis+by+bisdichloroacetyldiamines+is+mediated+by+inhibition+of+testicular+retinoic+acid+biosynthesis.">Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis.</a> J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).</li><li>Hogarth, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+spermatogenic+wave+into+a+tsunami:+synchronizing+murine+spermatogenesis+using+WIN+18,446.">Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446.</a> Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+early+and+massive+wave+of+germinal+cell+apoptosis+is+required+for+the+development+of+functional+spermatogenesis.">An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis.</a> EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).</li><li>Kangasniemi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+basal+and+FSH+dependent+cyclic+AMP+production+in+rat+seminiferous+tubules+staged+by+an+improved+transillumination+technique.">Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique.</a> Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+arrest+of+spermiogenesis+and+germ+cell+apoptosis+in+mice+lacking+the+TBP-like+TLF/TRF2+gene.">Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene.</a> Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).</li><li>Henriks&#233;n, K., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+apoptosis+of+male+germ+cells+in+the+rat:+Mechanisms+of+cell+death+studied+by+supravital+squash+preparations.">Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations.</a> Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os ratos têm provado para ser um organismo modelo útil para estudar os eventos celulares que regulam a progressão meiótica durante a espermatogénese. Além disso, é necessário desenvolver ferramentas servidas para o estudo da espermatogênese porque muitos eventos, como sair da prófase meiótica, são sexualmente dimórfico. Este protocolo descreve um método de abóbora tubo seminífero para visualização e estudo de diferentes estágios da espermatogênese de rato. Este método preserva a integridade celular e...

Meiose é um evento complexo celular em que uma única rodada de replicação do DNA é seguida por duas rondas sucessivas de divisão celular. Vários eventos de meiose específicos devem ser coordenados durante os estágios iniciais da meiose para garantir a segregação do cromossomo precisos. Estes eventos incluem a conclusão de recombinação homóloga, co a orientação da irmã cinetócoros durante a primeira divisão meiótica e a perda gradual de cohesin complexos para resolver chiasmata entre homologs. Regulamento preciso destes processos é necessário para manter a fertilidade e evitam que podem levar a disfunções no desenvolvimento genéticas e aborto espontâneo1cromossoma missegregation eventos.
Enquanto os principais eventos da meiose ocorrem em machos e fêmeas, existem diferenças significativas de temporais e mecanicistas entre espermatogênese e a ovogênese2. Por exemplo, durante a meiose feminina, prófase I ocorre durante o desenvolvimento embrionário e prende no estágio de Dictióteno até a puberdade. Em contraste, a espermatogênese começa na puberdade e progride em ondas por toda a vida adulta, sem prisão. As diferenças entre masculino e feminino meiose enfatiza a necessidade de desenvolver métodos que são servidos especificamente para avaliar estes processos em espermatócitos e oócitos. Atualmente, avaliar progressão meiótica em grande parte se baseia na utilização de cromatina se espalha3,4,5. Enquanto cromatina spreads são úteis para o estudo de cromossomos meióticos, eles falham preservar a integridade celular, impedindo a avaliação de estruturas celulares como os microtúbulos do fuso, centrossomas, o envelope nuclear e anexos dos telômeros. Ao vivo de imagens e técnicas de cultivo a longo prazo avançaram muito nossa compreensão da meiose feminina; abordagens semelhantes para visualizar toda a célula intacta, no entanto, são menos frequentemente implementadas para o estudo da espermatogênese6,7. A fim de Visualizar eventos dinâmicos durante a meiose masculina, adaptaram-se técnicas de abóbora túbulo estabelecido para avaliar rapidamente as características citológicas de desenvolver rato espermatócitos8,9. O método descrito aqui mantém a integridade da célula, permitindo o estudo de várias estruturas celulares durante diferentes estágios da espermatogênese.
Esta técnica de abóbora do túbulo é uma abordagem de célula inteira, o que permite a avaliação de estruturas celulares através de microscopia de imunofluorescência. Abordagens histológicas comuns Visualizar meiótica progressão em ratos masculinos como hematoxilina e eosina mancha de parafina incorporado testículos e rotulação de imunofluorescência de cryosections permitem uma visão ampla da progressão meiótica. No entanto, essas técnicas não conseguem resolver células únicas na medida do necessário para uma análise detalhada dos eventos ocorridos durante a meiose10,11. Técnicas alternativas para visualizar processos meióticos dependem quimiosmótica significativa perturbação para a maturação para isolar e corrigir materiais nucleares3,4,5. Estes tratamentos químicos dificultam a observação dos tipos de célula diferentes espermatócitos primários. Um método recentemente descrito por Namekawa permitiu que a comunidade de pesquisa preservar a arquitetura nuclear de espermatócitos isolados, mas requer o uso de um cytospin e acessórios que podem não estar prontamente disponíveis para alguns laboratórios4. Em contraste, a técnica de abóbora túbulo requer apenas o equipamento que é geralmente padrão na maioria dos laboratórios de biologia celular.
O método de abóbora túbulo descrito aqui pode ser usado para visualizar os tipos de célula diversos encontrados dentro do túbulo seminífero, incluindo células de sertoli, espermatogónias, espermatócitos primários e secundários, espermátides e. Por esta técnica de engate com a primeira onda perto-síncrono de espermatogênese em camundongos juvenis, é possível obter populações enriquecidas de células espermatogênico medida que progridem através de de meiose12. Este processo permite a análise detalhada dos processos em toda a espermatogênese, como primeiros eventos da prófase, metáfase, a anáfase transições e acridina e G2/MI. Além disso, preparações de abóbora túbulo podem ser usadas para visualizar características citológicas dos cromossomas (por exemplo, domínios interchromatid (ICDs) e cinetócoros) e centrossomas (centríolos e pericentriolar material/matrizes). O método de abóbora pode ser prontamente executado em paralelo com outras abordagens experimentais, tais como cromatina spreads e extração de proteínas. Além disso, esta técnica foi modificada com sucesso para depositar as células espermatogênico em lâminas para visualização directa13.
O método descrito aqui envolve uma técnica de abóbora de tubo seminífero células inteiras para analisar a transição G2/MI em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem. As características citológicas de espermatócitos primários, entrando a primeira divisão meiótica foram visualizadas com microscopia de imunofluorescência para observar o fuso meiótico. Esta técnica versátil pode ser facilmente modificada para visualizar outros estágios meióticos e diferentes tipos de células. A técnica também é passível de estratégias de visualização alternativos, tais como o DNA e RNA peixe abordagens.

<table><tbody><tr><td>16% Paraformaldehyde Aqueous</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Quality Biological</td><td>119-069-161</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Sigma</td><td>H-1270</td><td></td></tr><tr><td>35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated</td><td>CellTreat</td><td>P886-229638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Sigma</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker Pen</td><td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Humid Box</td><td>Evergreen</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides</td><td>Fisher</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Slides (22mmx60mm)</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microsopes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SteREO Discovery.V8</td><td>Zeiss</td><td>495015-0001-000&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>4109431007994000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEN 2012 blue edition image software</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 CMOS camera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Primary Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mouse anti-SYCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74569</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Rabbit anti-SYCP3</td><td>Fisher (Novus)</td><td>NB300-231</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Goat anti-SCP3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20845</td><td>1 in 50</td></tr><tr><td>Human anti-Centromere Protein</td><td>Antibodies Incorporated</td><td>15-235</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha tubulin</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1 in 1000</td></tr><tr><td>Mouse anti-AIM1</td><td>BD Biosciences</td><td>611082</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;gamma;H2AX</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA1-2022</td><td>1 in 500</td></tr><tr><td>Mouse anti-CENT3</td><td>Abnova</td><td>H00001070-M01</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-pericentrin</td><td>Abcam</td><td>ab4448</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-REC8</td><td>Courtesy of&amp;nbsp; Dr. Karen Schindler</td><td>N/A</td><td>1 in 1000</td></tr></tbody></table>

a seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model

Meiótica progressão nos machos é um processo que exige a acção concertada de uma série de eventos celulares altamente regulamentados. Erros que ocorrem durante a meiose podem levar à infertilidade, perda de gravidez ou defeitos genéticos. Começando no início da puberdade e ao longo da vida adulta, contínuas ondas semisíncronas de espermatócitos submetido a espermatogênese e, finalmente, formam espermatozoides haploides. A primeira onda de espermatócitos de rato em fase meiótica iniciação aparecem no 10º dia pós-parto (dpp 10) e são liberados no lúmen dos túbulos seminíferos como esperma madura no dpp 35. Portanto, é vantajoso utilizar ratos dentro desta janela de tempo do desenvolvimento, a fim de obter populações altamente enriquecidas de interesse. Análise dos estágios de célula rara é mais difícil em ratos mais velhos devido à contribuição das sucessivas ondas espermatogênico, que aumentam a diversidade das populações celulares dentro dos túbulos. O método descrito aqui é uma técnica facilmente implementada para a avaliação citológica das células encontradas nos túbulos seminíferos dos ratos, incluindo espermatogónias espermatócitos e espermátides. A técnica de abóbora túbulo mantém a integridade das células germinativas masculinas isoladas e permite a análise das estruturas celulares que não são facilmente visualizados com outras técnicas. Para demonstrar as possíveis aplicações desta técnica de abóbora do túbulo, montagem do eixo foi monitorada em espermatócitos progredir através da prófase para metáfase que eu transição (transição G2/MI). Além disso, duplicação centrossoma, inativação do cromossomo meiótico de sexo (MSCI) e formação de cromossomo buquê foram avaliados como exemplos das estruturas citológicas que podem ser observadas usando esse método de abóbora do túbulo. Esta técnica pode ser usada para identificar defeitos específicos durante a espermatogênese causadas por mutação ou perturbação exógena, e assim, contribui para a nossa compreensão molecular da espermatogênese.

Aqui, nós usamos o método de abóbora do túbulo para visualizar populações de células transitória em fase da prófase para metáfase eu (G2/MI) transição, que foram enriquecidos por colheita testículos de juvenis selvagem-tipo ratos submetidos à primeira onda de espermatogênese (24 DPP). A Figura 1 retrata imagens representativas das diversas fases de célula que podem ser visualizadas usando o método de abóbora do túbulo. Enriquecido com popul...

Watch this Scientific Journal Video about A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model at JoVE.com

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

a-seminiferous-tubule-squash-technique-for-cytological-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K visualizações.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. O objetivo desta técnica de abóbora do túbulo é rapidamente avaliar características citológicas de desenvolver espermatócitos de rato, preservando a integridade celular. Esse método permite o estudo de todas as fases da espermatogênese e pode ser facilmente implementado juntamente com outras abordagens biológicas bioquímicas e moleculares para o estudo da meiose rato.

Vídeo: A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Biologia do Desenvolvimento

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. Differentiation of germ cells takes place in the cytoplasmic pockets of somatic Sertoli cells that host 4 to 5 generations of germ cells simultaneously and coordinate and synchronize their development. Therefore, the composition of germ cell types within a cross-section is constant, and these cell associations are also known as stages (I&#8211;XII) of the seminiferous epithelial cycle. Importantly, stages can also be identified from intact seminiferous tubules based on their differential light absorption/scatter characteristics revealed by transillumination, and the fact that the stages follow each other along the tubule in a numerical order. This article describes a transillumination-assisted microdissection method for the isolation of seminiferous tubule segments representing specific stages of mouse seminiferous epithelial cycle. The light absorption pattern of seminiferous tubules is first inspected under a dissection microscope, and then tubule segments representing specific stages are cut and used for downstream applications. Here we describe immunostaining protocols for stage-specific squash preparations and for intact tubule segments. This method allows a researcher to focus on biological events taking place at specific phases of spermatogenesis, thus providing a unique tool for developmental, toxicological, and cytological studies of spermatogenesis and underlying molecular mechanisms.

This protocol describes transillumination-assisted microdissection of segments of adult mouse seminiferous tubules representing specific stages of seminiferous epithelial cycle, and cell types therein, and subsequent immunostaining of squash preparations and intact tubule segments.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Spermatogenesis is a unique differentiation process that ultimately gives rise to one of the most distinct cell types of the body, the sperm. ...

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento de injeção de espermátides redondas murinas para estudar o desenvolvimento embrionário

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Injeção de espermátide redonda em camundongo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Biologia

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Transplante de células germinativas e Tecidos Testículo xeno em Ratos

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Citológica Análise da espermatogênese: Preparados ao vivo e fixo