Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Este trabalho foi realizado com o apoio de uma subvenção, 5R21HD080684-02, do Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano. O autor deseja agradecer a Ken Cho para seu contínuo entusiasmo e apoio. O autor também gostaria de reconhecer Bruce Blumberg para uso da sua câmera, Rebekah Charney, para a leitura crítica do manuscrito e Sean McNamara e Marcin Wlizla o recurso de Xenopus nacional (RRID:SCR_013731), para o valioso conversas sobre X. tropicalis alimentar e regimes de cuidados com animais.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Irvine e institucional Cuidado Animal.
1. os preparativos para o transplante de PGC
<ol><li>Prepare ferramentas de dissecação com antecedência, como descrito anteriormente,23. Nota: Facas de sobrancelha cabelo são usadas para fazer incisões com o auxílio de um laço de cabelo para estabilizar o embrião durante a realização das cirurgias. Os pelos da sobrancelha e cabelo loops são colados no vidro de borosilicato pipetas Pasteur que ter sido desenhado pela primeira em uma chama e quebrados na porção diluída (ver figura 1A, ponta de seta) para criar uma ponta menor, mais estreita (figura 1B) para maior destreza ao realizar cirurgias.</li>
	<li>Gere sgRNAs usando os procedimentos descritos anteriormente24 . Nota: Brevemente, curtos modelos de DNA que codifica para sgRNAs são criados usando sobreposição deoxyoligonucleotides contendo 5' promotores do bacteriófago T7, que são recozidos e "preenchido" por uma DNA-polimerase termoestável, livre de erros. Reações da síntese in vitro sgRNA são incubadas durante várias horas durante a noite (dependendo do kit usado). As reações são DNAse-tratada para remover o modelo. Os sgRNAs são purificados por métodos padrão de fenol/clorofórmio extração e amônio acetato/isopropanol precipitação, de acordo com instruções24 do fabricante kit.</li>
	<li>Logo antes de executar microinjeções, preparar Cas9-sgRNA complexos pela primeira desnaturação ~ 250 ng de sgRNA em um volume total de 3 µ l de RNAse-livre (diethylpyrocarbonate-tratada) H2O a 60-65 ° C por 5 min, seguido de resfriamento rápido no gelo por 5 min. Centrifugue a sgRNA por alguns segundos, adicionar 1 µ l de 1 proteína de Cas9 µ g / µ l e incubar durante 10 minutos a 37 ° C, para promover a formação do complexo. Nota: Após esta incubação, o tubo pode ser mantido no gelo enquanto prepara os embriões para o microinjection.</li>
	<li>Obter X. tropicalis de embriões, fertilização in vitro usando métodos padrão, como descrito anteriormente,25. Geleia de25,26 os embriões na pós-fertilização 10 min. Nota: O tempo de fertilização é considerado o tempo após a suspensão de esperma é adicionada para os ovos e o prato é inundado com 1/9thX modificado Ringers (MMR)26 de Marc. X. tropicalis25, ao contrário de X. laevis, realizar a eliminação jellying em 1/9 x MMR contendo 3% base cisteína livre (não o sal de HCl), pH ajustado para 7,8-8.0, seguido por várias lavagens em 1/9 x MMR. Transferir os embriões para um agarose (1%)-prato revestido contendo 1/9 x MMR à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferir imediatamente os embriões deve ser injetado para um prato revestido de agarose 1%, contendo 1 x MMR com uma pipeta Pasteur.</li>
	<li>
Injete na fase 1-célula. Ver referências26,27 para obter descrições detalhadas de métodos de microinjeção de Xenopus .
	<ol>
<li>Injetar cada embrião em um único local no polo animal, com 4 nL do complexo Cas9-sgRNA (quantidade final = 1 ng de Cas9 e ~ 250 pg de sgRNA; ver a discussão)24. Após 10-20 min de injeção local de cura, transferir os embriões para um prato de agarose-revestido contendo 1/9 x MMR e incubar a 25 ° C. Também crie um prato de uninjected irmão embriões que servirão como destinatários do enxerto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare-se placas de Petri (60 mm) que contêm um mm ~ 5-camada espessa de agarose a 1% em 0,3 x MMR, se fazer transplantes em X. tropicalis, ou 1 x MMR para X. laevis.
	<ol>
<li>Criar depressões ~ 3-4 mm de profundidade através da inserção de um 3-x 4-poço molde (criado por um corte de uma placa PCR de 96 poços) no agarose derretido quando deitar as placas (ver Figura 1 e D). Segure o molde vários milímetros acima do fundo da caixa de Petri usando uma pinça anexada a um carrinho de anel até a agarose endureceu.</li>
		<li>Além disso, fazer uma placa de 24 para embriões individual casa revestindo as cavidades com uma fina camada de agarose a 1% em 1/9 x MMR. Nota: O meio de cultura adicionado a esses poços é 1/9 x que MMR suplementado com 50 µ g de sulfato de gentamicina/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. transplante de PGCs
<ol><li>Quando os embriões só chegar Nieuwkoop e Faber28 blástula fase 9 (Figura 2A), ~4.5 h pós-fecundação (hpf) para X. tropicalis, removê-los da incubadora a 25 ° C e permitir-lhes equilibrar a temperatura ambiente por um período adicional 0,5 h.</li>
	<li>Para começar o transplante em 5 hpf (Figura 2B), usar uma pipeta Pasteur para transferir um embrião de doador PGC (injetado com Cas9-sgRNA) para o prato de agarose 60mm contendo depressões (criadas na etapa 1.7) em 0.3 x MMR (ou 1 x MMR se usando X. laevis). Também transferi um embrião do irmão uninjected, o destinatário do enxerto, para este prato. Nota: É fundamental que as identidades de cada um destes embriões não são confundidas.</li>
	<li>Manualmente remover os vitelínico envelopes de cada embrião usando fórceps e girar ambos os embriões, de modo que seus polos vegetal estão no modo de exibição e acessível para a cirurgia. Nota: Uma descrição de-vitellination manual de embriões já havia sido descrito26.</li>
	<li>Usando a ponta afiada da faca de cabelo sobrancelha, faça quatro incisões rasas em forma de um quadrado no polo vegetal do embrião destinatário, dentro da zona onde o futuro garrafa células que marcam o Blastóporo irão formar. Fazer as incisões por inserir a ponta da faca sobrancelha cabelo do embrião, logo abaixo da superfície e fazer movimentos de corte para cima enquanto estabilizando o embrião com o laço de cabelo. Nota: A Figura 2 mostra vegetais vistas de um embrião em intervalos médios de 4.5-7.0 hpf para mostrar o tamanho da célula e para fornecer um guia para estimar onde as células de garrafas formarão (círculo branco tracejado). O objectivo é fazer incisões onde caixa tracejada de preto é indicada.</li>
	<li>Uma vez que os quatro lados do quadrado são delineados por incisões, aprofunde cada incisão com a faca de sobrancelha cabelo usando movimentos de corte semelhante para chegar a uma profundidade de aproximadamente 1/3 a 1/2 da distância até o chão blastocoel.</li>
	<li>Livre o explante de tecido vegetal do embrião do destinatário (Figura 3A e B) fazendo uma horizontal (paralela à superfície vegetal) cut(s) na região profunda vegetal. Nota: O tamanho do explante vegetal contendo PGC é aproximadamente 0,4-0,45 mm por lado e 0,25-0.3 mm de profundidade. Este vegetal explante de embrião o destinatário não é mais necessária e, portanto, deve ser anulado para serem descartados.</li>
	<li>Trabalhando rapidamente, repita este procedimento (etapas 2.4-2.6), sobre o embrião de doador do PGC para criar um fragmento de tecido vegetal similarmente feito sob medida para transplante. Nota: É importante realizar esta segunda dissecação com pequeno atraso para minimizar o tempo para o embrião do destinatário curar sua ferida aberta.</li>
	<li>Uma vez que o tecido contendo PGCs é retirado do embrião doador, use o sobrancelha cabelo faca e cabelo laço para mover este explante em posição na abertura criada no embrião destinatário. Nota: A superfície interior do enxerto doador deve estar virado para o interior do embrião do destinatário. Não é necessário corresponder as orientações dos eixos dorso-ventral e direitas do enxerto com o embrião do destinatário.</li>
	<li>Use a borda longa do eixo da faca sobrancelha cabelo, mantida paralelamente à superfície do enxerto, pressione suavemente o enxerto na abertura na superfície vegetal do embrião destinatário.</li>
	<li>Uma vez que o enxerto foi colocado, use um hairloop ou o eixo de uma faca de cabelo de sobrancelha para deslizar suavemente a "carcaça" do embrião doador através da superfície de agarose e em uma depressão de agarose. Certifique-se de que a ferida aberta da carcaça está enfrentando o líquido em massa. Se não, use a faca de cabelo de sobrancelha para girar o embrião para alcançar esta orientação.</li>
	<li>Deslize o embrião do destinatário, com o enxerto de cura no lugar, em uma depressão adjacente e do mesmo modo certifique-se de que o tecido transplantado polo vegetal está enfrentando o líquido em massa.</li>
	<li>Repita este procedimento (passos 2.1-2.11) usando um outro par de doador e receptor embriões para criar outro par de transplante/carcaça; transferi a estes a depressões vazias. Nota: É fundamental que faz anotações para manter o controle de pares correspondentes de carcaças e rolamento de transplante de embriões. As carcaças do doador serão usadas como um proxy para a eficiência de Cas9 sgRNA-induzida mutagênese nos PGCs transplantados, o que não pode facilmente ser analisada até os transplante-rolamento animais atingem a maturidade sexual (ver passo 3.3, abaixo e a discussão ).</li>
	<li>Continuar a fazer transplantes de embriões alcançará aproximadamente gástrula precoce 10, que é aproximadamente 6.5 hpf em X. tropicalis (ver Figura 2E).</li>
</ol>3. pós-cura de embriões
Nota: Enxertos curam no lugar dentro ~ 30 min, e é normal observar alguns destroços yolky de lise celular exsudação do embrião (Figura 3).
<ol><li>
Uma vez curada, use uma pipeta Pasteur para suavemente de transferência de embriões desde as depressões individuais aos poços de uma placa de 24 Poços revestidos de agarose. O exsudato será removido (figura 3D) pelo fluido durante a transferência de mistura.
	<ol>
<li>Gire os embriões para que são colocados vegetal-polo acima, enfrentando a solução em massa. Novamente, coloque as carcaças de doador e enxertar destinatários em poços adjacentes para ajudar a manter o controle dos pares do embrião; grave esta informação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferi a placa de 24 contendo embriões para uma incubadora de 25 ° C para a cultura durante a noite. Nota: No dia seguinte, os embriões terá atingido estágios tailbud.</li>
	<li>Mova os destinatários de enxerto para limpar placas com revestimento em agarose 6-poços contendo 1/9 x que MMR suplementado com 50 µ g de sulfato de gentamicina/mL, com 1 embrião por bem. Manter um registro claro de carcaças de doador que correspondam a estes destinatários do enxerto.</li>
	<li>Para avaliar a eficiência de mutagénese sequenciamento PCR amplicons5,17,24 ou usando outros métodos que dependem de PCR amplicons (veja a discussão), mova as carcaças individuais para 0,2 mL tira da polimerase. Remover a maioria do meio e homogeneizar em 100 µ l do lysis buffer24 contendo proteinase K (PK) por repetidas pipetagem altos e baixos, com uma pipeta P200.</li>
	<li>Execute o embrião lise24 a 56 ° C, durante 6 h durante a noite para permitir a digestão de PK. Inactivar PK aquecendo a 90-95 ° C por 10 min, seguido de rápido resfriamento a 4 ° C. Use lysates sem outras medidas de limpeza para propagar as reações de PCR para obter amplicons curto para direto de sequenciamento Sanger DNA24. Armazenar os lysates a-20 ° C. Nota: Dentro de alguns dias, os girinos vão chegar a fases de alimentação (fase aproximadamente 45-46) e podem ser alimentados a uma suspensão de pó planctônico (sera Micron).</li>
	<li>Depois de ~ 1 semana, com alterações diárias de meio de cultura para manter a limpeza e minimizar o crescimento microbiano excessivo, mova girinos para tanques pequenos em um sistema aquático circulante com fluxo de gotejamento. Use os dados de sequenciamento para segregar os girinos com PGCs altamente eficiente mutagenized de girinos com menor eficiência de mutagénese. Uma vez que a metamorfose é completa, mova o froglets para o sistema aquático adulto no laboratório. Nota: Regimes desenvolvidos pelo recurso de Xenopus nacional (laboratório de biologia marinha, Woods Hole, MA) fornecem um guia para alimentação29 e sapo adulto manutenção30de girino.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

O autor não tem nada para divulgar.

Este relatório fornece um protocolo detalhado para o transplante de tecido vegetal contendo PGCs. transplante de PGCs é usado em conjunto com tecnologias de edição de genoma (por exemplo, CRISPR/Cas9) para modificar o germline de um animal enquanto mantendo a quase todos os tecidos somáticos como geneticamente tipo selvagem. Para saltos para ser bem sucedido, há um número de fatores críticos a considerar antes de realizar a execução de transplantes.
Para garantir a completa ...

Como genótipo codifica o fenótipo tem sido uma grande questão em biologia desde a redescoberta de leis de Mendel. Uma compreensão das funções dos genes, sua regulação e interações nas redes do gene e as funções das promessas de produtos codificado para fornecer ferramentas para descobrir nova biologia e melhorar Estados de doença. Para mais de meio século1, a africana Xenopus, Xenopus, tem sido um líder modelo para estudos sobre uma grande variedade de tópicos em biologia básica e biomedicina, incluindo o controle genético do desenvolvimento. Historicamente, a maioria das pesquisas sobre Xenopus tem usado o sapo allotetraploid, X. laevis, mas mais recentemente, devido à sua Diploidia, X. tropicalis desenvolveu-se como um modelo genético de anfíbios. Foram montadas sequências do genoma completo de ambas as espécies de Xenopus 2,3. A comunidade de"sapo" é agora um ponto de viragem onde tecnologia de modificação do genoma básicos permite o estudo da função do gene, praticamente à vontade. Programável CRISPR/Cas9 endonucleases fizeram o mutagenesis de genes altamente eficiente, com biallelic mutação possível na maioria das células do animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Estes estudos, sublinhados por Bhattacharya et al 12 e Shigeta et al 13, têm mostrado que a função de muitos genes pode ser estudada por mutagênese em animais de mosaico F0 . Esta abordagem tem muitas vantagens; no entanto, Cas9-sgRNA-injetadas embriões frequentemente exibem fenótipos variáveis devido a perda incompleta da função (LOF). Mais significativamente, a geração de linhas mutantes é altamente vantajosa para alguns aplicativos — em especial, ao estudar os genes que têm uma contribuição materna do mRNA. MRNAs maternos e proteínas e suas influências na epigenética, persistirem por um período prolongado na embriogênese14,15,16, tornando as contribuições do desenvolvimento precoce de muitos genes refratários para análises de F0 . Portanto, outras abordagens LOF são necessárias.
Quando pretendem criar linhas mutantes, o caminho para obtenção de embriões LOF homozigotos tem vários obstáculos. Mutagênese em primeiro lugar, eficiente para produzir mutações biallelic pode ser desvantajoso porque a perda das funções essenciais do gene resulta em falha para sobreviver à maturidade sexual, interferindo com a produção de uma linha viável. Uma solução comum é a titulação cuidadosa da quantidade de Cas9-sgRNA entregado. Aqui, o objetivo é alcançar um equilíbrio entre reduzir letalidade enquanto também maximiza a eficiência de mutagénese germline. Um segundo problema surge a partir do esquema de reprodução padrão, onde análises fenotípicas são diferidas até à geração2 de F. Usando a abordagem padrão, sexualmente maduras animais de0 F que transmitem mutante alelos através do germline são outcrossed para produzir F1 heterozigoto "transportadoras", que em seguida são cultivadas para a maturidade sexual. Dois heterozigotos de1 F são então intercrossed para produzir embriões mutantes de F2 com uma frequência mendeliana esperada de 25%. Assim, duas gerações de reprodução são necessárias para a análise de fenótipos mutantes. Animais mutantes poderiam ser homozigotos ou heterozigotos compostos (ou seja, a descendência que contém dois alelos mutantes diferentes, que depende dos genótipos dos animais parentais utilizados em intercross de1 a F).
Estes obstáculos podem ser superados por confinar programável mediada por nuclease mutagênese de células germinativas, que está subjacente a um novo método chamado saltando17. Saltos tem dois componentes principais: (1) a microinjeção de mRNA Cas juntamente com sgRNA, ou sgRNA-nuclease complexos (ou, em princípio, TALENs ou zinco nucleases de dedo) na fase de célula única para eficientemente mutagenize embrionárias genomas, seguido por (2) o transplante de PGCs em embriões de sua irmã, onde os PGCs endógenos foram removidos. Quando os dois passos são germline eficiente, completa substituição com mutantes de células germinativas pode ser obtido. Blackler demonstrado na década de 1960 que Xenopus PGCs poderiam ser transplantadas entre embriões no neurula atrasado e cedo tailbud fases18,19. Para saltos, abordagem do Blackler foi modificada por realizar os transplantes para o estágio de blástula17, quando PGCs são localizadas no polo vegetal do embrião20,21. Transplante antes gastrulação tem duas vantagens principais. Primeiro, a enxertia de transplantes e o subsequente desenvolvimento normal foi encontrada para ser mais eficiente quando o transplante é realizado na fase de blástula (observações não publicadas). Em segundo lugar, realizando transplantes de blástula-palco logo após a transcrição zigóticos começou, um pode evitar a letalidade decorrentes do desenvolvimento gene mutações que interrompem a gastrulação ou que caso contrário levar ao neurulae tarde malformado. PGC transplante-rolamento ("leapfrogged") embriões são cultivados a maturidade sexual, e inter-cruzamentos entre estes animais de0 F têm demonstrado que, em muitos casos, 100% da descendência F1 exibir o fenótipo LOF (a maioria sendo composto heterozigotos), indicando a substituição completa do germline com as mutações específicas.
Espera-se que saltos acelerará abordagens genéticas em Xenopus. Saltos também fornece uma alternativa para o método de "transferência de acolhimento"22 para a análise LOF dos genes maternos-efeito (observações não publicadas). Na atual publicação, uma descrição detalhada do método, concentrando-se especialmente na transplantação de PGC, é apresentada em X. tropicalis (com pequenas modificações para X. laevis). O transplante de PGCs é demonstrado aqui para facilitar uma mais rápida transferência desta tecnologia para outros laboratórios que trabalham com Xenopus. Os princípios deste método devem ser bem sucedidos em outros anfíbios (por exemplo, urodeles), e modificações do organismo específico na metodologia permitir aplicação para muitos outros animais na qual mutagênese eficiente pode ser realizado e PGCs são prontamente para transplante.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20 or 11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Eyebrow hair knife</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td></td><td>Homemade</td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td><td>Elmer&#039;s Products, Inc.</td><td>KG581</td><td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td></tr><tr><td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom ordered</td><td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td></tr><tr><td>Megascript T7 kit</td><td>Ambion/ThermoFisher</td><td>AM1334</td><td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td></tr><tr><td>Phenol, Tris buffered</td><td></td><td></td><td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td></td><td></td><td>High quality chloroform from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>High quality ethanol from any commercial supplier</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td><td>PNA Bio, Inc.</td><td>CP01</td><td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>10X Marc&#039;s Modified Ringers solution</td><td></td><td></td><td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td></tr><tr><td>60 X15 mm Petri plates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Falcon</td><td>3047</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>C7352-100G</td><td>Free base, not HCl salt</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>03 115 828 001</td><td>Typically ~20mg/ml from Roche</td></tr><tr><td>sera Micron</td><td>sera</td><td></td><td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td></tr></tbody></table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

A criação de linhas de mutante editando genoma está acelerando a análise genética em muitos organismos. CRISPR/Cas9 métodos foram adaptados para o uso na africana Xenopus, Xenopus, um organismo de longa data modelo para investigação biomédica. Os regimes tradicionais de reprodução para criar linhas mutantes homozigotos com mutagénese CRISPR/Cas9-alvo têm várias etapas demoradas e trabalhosas. Para facilitar a criação de embriões mutantes, particularmente para superar os obstáculos associados a bater para fora os genes que são essenciais para a embriogênese, foi desenvolvido um novo método chamado saltos. Esta técnica utiliza a robustez dos embriões de Xenopus "cortar e colar" métodos embriológicos. Saltos utiliza a transferência de células germinativas primordiais (PGCs) de embriões de doador de forma eficiente-mutagenized em sua PGC-ablated irmãos. Este método permite a eficiente mutação de genes essenciais criando animais quiméricoes com sua células somáticas que carregam uma mutante da linha germinal. Quando dois animais de0 F carregando "saltar transplantes" (isto é, células germinativas mutante) são intercrossed, eles produzem homozigotos, ou compostos heterozigotos, nulos F1 embriões, economizando assim um tempo de geração completo para obter dados fenotípicos. Saltos também fornece uma nova abordagem para a análise de genes de efeito materno, que são refratários à análise fenotípica de0 F seguindo CRISPR/Cas9 mutagênese. Este manuscrito detalha o método dos saltos, com especial ênfase em como executar com sucesso o transplante de PGC.

Após o transplante, a determinação qualitativa da eficácia de mutagénese CRISPR/Cas9 deve ser executada antes de despender o esforço na pecuária de crescer e manter os animais a maturidade sexual. Porque animais portadores leapfrog transplantes são somaticamente sua e do germline é difícil acesso para medições directas, salvar os cadáveres de embriões de dador torna-se importante. Análise de DNA de carcaças serve como um proxy para a extensão de mutagênese que ocorre no ...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

primordial-germ-cell-transplantation-for-crisprcas9-based

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

8.3K visualizações.  University of California, Irvine. Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Biologia do Desenvolvimento

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Clonagem Funcional Utilizando um<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Sistema de Expressão

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genética

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Geração de Axolotis Quiméricos com Membros Haploides Mutantes através de enxerto embrionário

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Biologia

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Transplante de células de germes primordial para baseado em CRISPR/Cas9 saltos em Xenopus

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Manipulação e

Stem Cell-like

Clonagem Funcional Utilizando um