Os autores reconhecem o financiamento do DFG (EXC-1003 a MG).

1. Cultura celular <ol><li> Cultura HeLa ou células COS no Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 4,5 g / L de D-glucose, L-alanina-L-glutamina dipeptídico, piruvato, 10% de soro bovino fetal e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Os neurônios culturais em meios culturais sem L-glutamina, ácido glutâmico ou ácido aspártico, suplementados com 0,5-diperptídeo L-alanina-L-glutamina, suplementos neuronais sem soro e 10 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. </li><li> Uma vez que se alcança 40% de confluência, transfira células com construções de escolha usando um reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha as células transfectadas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 15-18 h. </li><li> Para reduzir as alterações no pH e na osmolaridade (devido à evaporação) durante a aquisição da imagem, encha as câmaras de cultura de células (antes da imagem) até 90% com meio pré aquecido a 37 ° C contendo 20% de 4- (2-hidroxietil) -1 -piperazino-etossulfónico (HEPES). SelarNa tampa, aplique uma fina camada de graxa de vácuo no interior da tampa e pressione-a suavemente sobre a câmara de cultura que contém as células transfectadas. </li></ol> 2. Aquisição de imagens NOTA: O comprimento do filopodia varia de 2-10 μm 13 . Filopodia cresce a uma velocidade média de 0,05-0,1 μm / s 13 , 14 . <ol><li> Adquira imagens usando um microscópio com objetivo 60X ou 100X e sem binário de pixels (aqui, um microscópio confocal de disco giratório). Use taxas de aquisição superiores a 1 Hertz (Hz) para rastrear a dinâmica filopodial. Para minimizar os artefatos fora de foco, imagens filopodia perto da membrana basal ( ou seja , superfície do substrato). </li><li> Para garantir um rastreamento suave, ajuste o tempo de exposição da câmera e a intensidade do laser, de modo que a relação sinal / ruído (SNR) seja maior que 4. Evite a saturação de canais individuais ( ou seja, valores de pixels de255 para imagens de 8 bits e 65,535 para imagens de 16 bits), pois isso impedirá a análise de imagem subseqüente. </li><li> Para evitar o sangramento, use apenas etiquetas de fluorescência compatíveis com linhas laser e filtros do microscópio (para detalhes veja a referência 15 ). </li></ol> 3. Pré-processamento de imagem NOTA: Use ImageJ ou outro software disponível para pré-processar imagens 16 , 17 . <ol><li> Se a amostra estiver em movimento, corrija a deriva lateral usando o software disponível ( por exemplo, https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) antes da análise. Exclua filmes com deriva axial (ou seja, movimento em direção z). </li><li> Fundo correto ( ou seja, valores de cinza de áreas fora da célula), branqueamento ( ou seja, perda contínua, se a intensidade de fluorescência devido ao dano a proteínas de fluorescência) e possíveis cortes de sangramento ( ou seja, sinal de uma gripeSonda de orescência nos dois canais) usando o software disponível ( por exemplo, http://imagej.net/Category:Plugins e 16 , 17 ). Nota: as intensidades de fluorescência dos canais individuais não são alteradas pelo software. </li><li> Para garantir a análise de imagem subsequente, guarde os filmes correspondentes a canais específicos de proteínas em escala de cinza como formato de arquivo empilhado &#39;.tiff&#39; na pasta de trabalho. NOTA: As dimensões (tamanho, comprimento) das pilhas devem ser iguais para todos os canais. </li></ol> 4. Análise de imagem - Etapa 1: carregar imagens NOTA: O software descrito aqui foi escrito em Matlab (conhecido como software de programação) e será executado somente com este programa. <ol><li> Baixe a pasta compactada contendo todos os arquivos necessários para análise de imagens a partir do seguinte site: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwestamos/. Descompacte e copie arquivos na pasta de trabalho. </li><li> Uma vez instalado, abra o software de programação e execute &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39;. GUI Window # 1 irá abrir como mostrado na Figura 2A . </li><li> Carregue os arquivos &quot;.tiff&quot; empilhados salvos correspondentes a uma proteína específica de interesse na GUI Window # 1 usando os botões &lt;1b&gt; para a proteína A, &lt;1c&gt; para a proteína B, &lt;1d&gt; para a proteína C. Veja a Figura 2 e a Tabela 1 para detalhes. NOTA: A Proteína A mostrada na GUI A Janela # 1 atua como o canal de referência para a análise ratiométrica final. </li><li> Crie uma imagem superpuesta da célula a partir dos canais de proteína clicando em &lt;1a&gt;. </li><li> Clique em &lt;2a&gt; para atribuir o primeiro quadro e &lt;2b&gt; para o último quadro usado para análise. </li><li> Opcionalmente, coloque a região de interesse (ROI) contendo o filopodium de interesse usando o botão &lt;2h&gt;, gire a imagem.Toque o botão &lt;2i&gt; ou elimine regiões indesejadas usando a ferramenta de desenho de mão livre &lt;2j&gt;. NOTA: Para simplificar a análise de imagens, recomenda-se isolar o ROI ( isto é , cortar, girar, excluir) juntamente com as outras etapas de pré-processamento (resta, correção de branqueamento, etc.) usando o ImageJ. </li><li> Mova o controle deslizante &lt;2c&gt; para cada quadro para controle de qualidade e verifique se o filopodium permanece claramente visível durante todo o filme. </li></ol> 5. Análise de imagem - Etapa 2: gerar rastreamento <ol><li> Clique no botão &lt;3a&gt; na Janela GUI # 1 para abrir a janela GUI # 2 (veja a Figura 2B ). </li><li> Clique no botão &lt;4&gt; na Janela GUI # 2 para gerar a máscara do corpo celular sobreposto (gerado na Janela GUI # 1 depois de clicar em &lt;1a&gt;). O programa também gera o limite da máscara, onde o casco convexo é implementado para obter os vértices. </li><li> CliBotão ck &lt;5&gt;; Um cursor aparecerá. Use o cursor para selecionar a base (de onde a distância da ponta filopodial é medida) seguida pela ponta do filopodia no quadro onde aparece pela primeira vez. Para fazer isso, mova o controle deslizante na janela # 2). NOTA: Para minimizar erros na saída de dados, coloque o ponto base verticalmente abaixo da ponta filopodial ao longo do eixo. Posicionar o ponto base em outros locais ( por exemplo, deslocados lateralmente) pode introduzir uma polarização direcional em valores de fluorescência dentro do corpo da célula. </li><li> Selecione o comprimento do limiar (acima do qual o filopodia se dobrará) usando &lt;6c&gt;. Nota: Este comprimento é definido como a distância entre o ponto base (selecionado usando &lt;5&gt;) e o limite do corpo da célula ( ou seja, a região de onde o filopodia começa a crescer). A distância é medida é em pixels. </li><li> Especifique o número de segmentos usados ​​para aproximar a forma do filopodia na caixa &lt;6a&gt;. NOTA: o mO número mínimo de segmentos depende do comprimento máximo alcançado pelo filopodium, mas também como o filopodium se dobra. Não selecione um número de segmentos maiores do que o número de pixels entre a base e a ponta ( ou seja, o comprimento do limiar). Selecionando mais segmentos do que o limite definido na etapa 5.4. ( Ou seja, o número de pixels entre a base e a ponta) resultará em uma superestimação do comprimento do filopodium. </li><li> Especifique a largura da varredura, que atua como scanner horizontal para colocar os nós, em &lt;6b&gt;. NOTA: Estes nós são usados ​​pelo programa para ajustar a linha que une a base e a ponta com o corpo do filopodium ( ou seja, para criar a espinha dorsal). Como ponto de partida, coloque um valor em pixels igual ao comprimento máximo multiplicado por um fator de <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> Especifique o raio de varredura (em pixels) na caixa &lt;6d&gt;. Use um valor que é aproximadamente 50% maior do que o obServido deslocamento da ponta entre moldura. NOTA: Usar um raio de varredura muito grande pode pegar os pontos do casco convexo indesejados em quadros onde não existe uma dica filopodial real ( por exemplo , movimento fora do plano ou SNR baixo). </li><li> Especifique o ângulo de flexão na caixa &lt;6e&gt;. NOTA: O limiar de ângulo é determinado pelo ângulo máximo que o filopodium está dobrando durante toda a análise. Especificar o limite de ângulo ajuda o software a excluir o rastreamento de estruturas indesejadas que crescem do lado da filopodia quando o filopodia se dobra em direção ao corpo celular. O programa funciona de forma confiável para filopodia com ângulos basculantes inferiores a 45 graus do eixo vertical. </li><li> Para iniciar o rastreamento, clique no botão &lt;Seguir e analisar&gt; na janela GUI # 2. Clique na caixa &quot;Histórico rastreio&quot; na GUI Janela # 2 para salvar todo o protocolo de rastreamento para futuras referências. NOTA: Após o procedimento de rastreamento ser concluído, o comprimento do filopodium em cada quadro é armazenado emA folha chamada &#39;length_vel&#39; de &#39;dynamics.xlsx&#39; para futuras referências. Da mesma forma, todos os outros parâmetros de rastreamento são armazenados na folha denominada &#39;parameters&#39; de &#39;dynamics.xlsx&#39;. </li><li> Opcionalmente, se o filopodia não for detectado automaticamente em todos os quadros, use as seguintes etapas para corrigi-lo manualmente. <ol><li> Visite o respectivo quadro usando o controle deslizante na Janela # 2 e selecione manualmente a ponta do filopodium. Nota: Os quadros, onde nenhum ponto convexo do casco são detectados, serão representados por uma região azul na janela de rastreamento da janela GUI # 2. É obrigatório verificar o botão &#39;Histórico rastreio&#39; antes que o programa de rastreamento fosse iniciado para acessar as coordenadas nodais nesse quadro. </li><li> Selecione os pontos de referência (base seguido de dica) usando &lt;6f&gt; na janela da GUI # 2. Especifique os outros parâmetros, como &quot;comprimento da varredura&quot;, &quot;Medição precisa após&quot; e &quot;ângulo de flexão máximo&quot;; Para esse quadro como descrito nos passos 5.4-5.8. </li><li> Clique no botão &lt;6i&gt; para salvar os novos parâmetros (específicos desse quadro). As etapas devem ser repetidas para todos os quadros indicados pela região azul. </li><li> Quando terminar, reinicialize o procedimento de rastreamento usando &lt;7&gt;. NOTA: Esta correção também pode ser usada se o programa mudar repentinamente de um filopodial para outro dentro de um filme. Como alternativa, considere cortar filmes que contenham filopodios múltiplos. </li></ol></li></ol> 6. Análise de Imagem - Passo 3: Análise de Proteínas Spatio-temporais <ol><li> Para a análise espaço-temporal, selecione a caixa representada por &lt;8b&gt; seguida do canal de proteína de interesse (&lt;8c&gt; e / ou &lt;8d&gt; e / ou &lt;8e&gt;). Nota: É obrigatório selecionar Proteína A antes da análise ratiométrica (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; e / ou &lt;9c&gt;), pois a Proteína A é usada como referência. </li><li> Clique em &lt;8a&gt;Para iniciar o rastreamento de proteínas ao longo do comprimento filopodial usando o traço gerado no passo 5.9. </li></ol> 7. Análise de imagem - Etapa 4: análise de proteína métrica <ol><li> Marque a caixa &lt;9b&gt; ou &lt;9c&gt; e clique no botão &lt;9a&gt; para obter o gráfico ratiométrico espaço-temporal. NOTA: Para evitar a falsa representação da concentração relativa de proteína, a imagem ratiométrica não é plotada como X / Y, mas como log (X / Y). Para uso futuro, o gráfico ratiométrico é exportado em arquivos de formato &#39;.png&#39; e &#39;.fig&#39;, e os dados do gráfico em bruto são armazenados no arquivo &#39;dynamics.xlsx&#39;. </li></ol> 8. Análise da imagem - Passo 5: Análise de ponta filopodial <ol><li> Marque a caixa &lt;8f&gt; e especifique o comprimento da ponta e o comprimento do limiar da base usando &lt;8g&gt; e &lt;8h&gt;. Clique em &lt;botão pressionar&gt; para salvar dados no arquivo &#39;dynamics.xlsx&#39;. Clique em &lt;Analisar Intensidades de Proteínas&gt; para gerar oRastro de intensidades de proteína da ponta filopodial e para economizar para análise ratiométrica. NOTA: O comprimento da ponta determina o número de pixels na ponta utilizada para a análise. O software retornará o valor de intensidade média dos pixels na ponta sobre cada quadro. O comprimento do limiar determina a distância mínima da base à ponta acima da qual o filopodium (ponta filopodial) começa a crescer (e quando o programa começa a rastrear o valor da intensidade da ponta). Portanto, o comprimento da ponta deve ser menor do que o comprimento do limiar. </li><li> Clique na proporção desejada a ser analisada usando &lt;9d&gt; ou &lt;9e&gt;. </li><li> Clique no botão de comparação &lt;9a&gt; para gerar os dados ratiométricos. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para rastrear a dinâmica do crescimento filopodial e a análise das concentrações relativas de proteína nessas estruturas dinâmicas através do algoritmo convexo-casco. Usando o software, até 3 canais podem ser comparados por pares em uma única execução, pelo que as concentrações relativas de dois canais ( ou seja, proteínas) são determinadas ao longo do ciclo de extensão / retração e armazenadas como arquivos de imagem e dados em pastas separadas. Além ...

O controle espaço-temporal das proteínas reguladoras da actina está associado à dinâmica do filopodium 1 , 2 . O rastreamento da concentração de proteína resolvida espacialmente ao longo do comprimento todo filopodial através do tempo é, portanto, crucial para avançar a nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à iniciação, alongamento, estabilização ou colapso dessas estruturas dinâmicas 3 , 4 . Ao contrário da análise de proteínas no citossolo, onde muitas mudanças de formas de células ocorrem em uma escala maior, filopodia são micro estruturas dinâmicas que constantemente se curvam 5 e se dobram, impedindo a análise usando uma abordagem simples, como uma varredura de linha. Diferentes soluções de software para rastrear a forma filopodial estão disponíveis 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, software para o rastreamento ratiométrico da dinâmica das proteínas dentro do corpo celular foi desenvolvido 10 , 11 . Para combinar o rastreamento automatizado da forma filopodial e da análise da proteína espaço-temporal, recentemente desenvolvemos um software de análise de imagem baseado no algoritmo convexo-casco 12 . Este novo método de análise, que é operado através de uma interface de usuário gráfica (GUI), combina pela primeira vez, a concentração relativa de proteína ao longo do comprimento filopodial e da velocidade de crescimento, permitindo assim a medição precisa da distribuição da proteína espaço-temporal independente do movimento desses Estruturas dinâmicas 12 . A idéia por trás do software (o código fonte está disponível gratuitamente, veja abaixo) é que um dos vértices do casco convexo coincidirá com a ponta do filopodium ( Figura 1A ). Ao olhar para o quadro subsequente paraO vértice mais próximo do casco convexo, a dica móvel pode ser rastreada em todo o filme. Uma vez que a ponta é detectada em cada quadro, sua posição é usada para desenhar um eixo juntando a ponta com um ponto de referência na base do filopodium ( Figura 1B ). Finalmente, o uso de pontos nodais equidistantes, cujas posições são determinadas pelo pixel médio com intensidade máxima ao longo da linha ortogonal ao eixo, são usados ​​para determinar uma espinha dorsal que segue a forma filopodial. Aproveitando esse backbone adaptativo, é gerado um kymograph para rastrear o crescimento filopodial e as concentrações de proteína para até três canais ao longo do comprimento filopodial ( Figura 1C ). <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Figura 1: Princípio de Trabalho do Software de Análise de Imagem. ( A ) O algoritmo por tráso software. No Passo 1, o usuário especifica a referência (base) e o vértice (a ponta) do filopodium. Na Etapa 2-1, a espinha dorsal do filopodium é obtida usando o pixel médio com valor de intensidade máxima. Na Etapa 3, a espinha dorsal é usada para o perfil de intensidade da proteína espacial. Na Etapa 2-2, o software acompanha automaticamente a ponta no quadro subseqüente. Todo o procedimento itera. ( B ) Instantâneo do algoritmo com filopodium real que apresenta elementos importantes, como o casco convexo que está sendo usado para o rastreamento. ( C ) Visão geral dos parâmetros que podem ser medidos com o algoritmo. Esta figura foi modificada a partir da referência 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> O software de análise de imagem é operado no Matlab (conhecido como software de programação) por meio de um uso gráficoR interface. Para maximizar a flexibilidade e a robustez para a configuração experimental particular, o usuário pode ajustar uma série de parâmetros de rastreamento ( por exemplo, ângulo de flexão permitido e movimento entre moldura) e também fazer algumas correções nos filmes ( por exemplo , corte, rotação, remoção de objetos indesejados) ( Figura 2A e Tabela 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Não. </td><td> Obrigatório </td><td colspan="5"> Descrição </td><td> Nome (em GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Carregando o arquivo .tiff empilhado que representa o corpo da célula (com caixa marcada) ou crie o corpo celular sobreposto a partir de canais </td><td> Corpo celular </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 1 </td><td> Proteína 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 2 </td><td> Proteína 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Carregando arquivo de imagem empilhado correspondente à proteína 3 </td><td> Proteína 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> Redefine tudo para arquivos de imagem empilhados pré-carregados </td><td> Restabelecer </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra de rolagem para determinar a moldura inicial para análise na janela GUI # 2 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra de rolagem para determinar o quadro final para análise na janela GUI # 2 </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Barra de rolagem representando curdaQuadro nt </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5"> O valor cinza dos pixels abaixo do qual todos os pixels serão definidos como zero </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> O valor cinza dos pixels acima do qual todos os pixels serão definidos como valores máximos </td><td> N / D </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> Defina os valores de intensidade dos pixels especificados em &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; </td><td> Conjunto </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2g </td><td> N </td><td colspan="5"> Jogue o filme ajustado pela intensidade </td><td> Toque </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> Cortar imagem </td><td> Colheita </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> Girar imagem </td><td> Girar </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2j </td><td> N </td><td colspan="5">Eliminar regiões na pilha inteira </td><td> Eliminar regiões </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para abrir a &#39;Janela de análise&#39; (janela GUI # 2) </td><td> Janela de rastreamento </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o tamanho de um pixel em microns </td><td> Digite o tamanho do pixel </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para gerar a imagem limite / borda do corpo celular sobreposto </td><td> fronteira </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para selecionar a base e a ponta do filopodia </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o número de segmentos ou nós </td><td> Número de segmentos </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o comprimento da varredura (perpendicular ao eixo) </td><td> Largura de digitalização </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar </td><td> Precise Meas after </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Digite o raio do círculo de detecção da ponta (ou seja, a área onde o vértice pode ser localizado no próximo quadro) </td><td> Radius of tip detection </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Insira o ângulo máximo que o filopodium pode dobrar do eixo vertical </td><td> Limiar de ângulo </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5"> Adicione pontos de referência para a base e a dica para esse quadro específico </td><td> Selecione referência </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6 g </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite o comprimento acima do qual o filopodia começa a dobrar esse quadro específico </td><td> Precise Meas after </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite o raio do círculo de detecção para esse quadro específico </td><td> Radius of tip detection </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> Depois de inserir todos os parâmetros para o quadro específico, clique para armazenar os valores na memória e no arquivo para referência adicional </td><td> Adicionar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para excluir os parâmetros manualmente configurados para essa moldura </td><td> Excluir </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para excluir todos os parâmetros armazenados manualmente usando o &quot;painel de recursos opcionais&quot; para todos os quadros </td><td> Restabelecer </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique antes de rastrear para armazenar todos os resultados de rastreamento na memória para futuras referências </td><td> Traço de história </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Clique para iniciar o rastreamento </td><td> Acompanhar e Analisar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para iniciar o rastreamento da intensidade do canal protéico </td><td> Analisar Intensidades de Proteínas </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para rastrear a intensidade do canal protéico ao longo do comprimento filopodial </td><td> Filopodias inteiras </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique o rastreamento da proteína de referência ou proteína A </td><td> ProteinA </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique o rastreamento da proteína B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique o rastreamento da proteína C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5"> Cheque para rastrear a intensidade média da proteína naE dica </td><td> Ponta principal </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite o comprimento da dica </td><td> Comprimento da ponta </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> Digite a distância mínima da base acima da qual a ponta começa a formar </td><td> limite </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para salvar os resultados da análise de ponta líder para arquivar </td><td> Botão de apertar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5"> Clique para iniciar a análise da proteína ratiométrica </td><td> Comparar </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína B com respeito a A </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína C em relação a A </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;Td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína B com respeito a A na ponta </td><td> Log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> Verifique para comparar a proteína C com respeito a A na ponta </td><td> Log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10a </td><td> N </td><td colspan="5"> Escolha outro mapa de cores (padrão: Jetplot) </td><td> Mapa de cores </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5"> Edite o mapa de cores </td><td> Editar o mapa de cores </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Visão geral de todas as funções presentes na GUI Windows # 1 e # 2. Uma vez que isso é realizado, o programa cria um casco convexo e rastreia automaticamente a dica ao longo do filme. Parâmetros extraídos do filme, como um kymograph ratiométrico, velocidade de crescimento e comprimento filopodial aÉ exibido e também armazenado na pasta de trabalho como imagens e como arquivos de dados. Outros parâmetros, tais como vida útil filopodial, taxa de crescimento e taxa de retração, podem então ser extraídos e analisados ​​a partir dos arquivos de dados armazenados ( Figura 2B ). <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Figura 2: Interface gráfica do usuário para usar o software de análise de imagem. ( A ) GUI Janela # 1 é usada para carregar e processar imagens. O programa pode carregar até 3 canais de proteína, pelo que 2 canais são comparados em par. A janela vem com características obrigatórias (azuis) e opcionais (verde) para pré-processamento das imagens antes do rastreamento ( B ) GUI A Janela # 2 é usada para rastrear análises de proteínas filopodium e spatio-temporais e métricas. Novamente, os recursos opcionais estão marcados em verde. Esta figura foi modificadaDa referência 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para preparação de amostras e manipulação de software. Começamos com instruções detalhadas sobre cultura de células e aquisição de filmes otimizados para análise de imagens. Esta seção sobre aquisição de dados é seguida por uma descrição detalhada para operar o software de análise de imagem. Ao longo do protocolo, apresentamos etapas críticas e recursos opcionais que devem ser considerados ao coletar e processar dados. Finalmente, analisamos filopodia de sistemas modelo diferentes com o software de análise de imagem, antes de fechar com uma comparação do software de análise de imagem descrito com outros programas disponíveis para quantificação filopodial e uma discussão sobre limitações e direção futura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Filopodia são protrusões celulares dinâmicas, semelhantes a dedos, associadas à migração e à comunicação célula-célula. Para entender melhor os complexos mecanismos de sinalização subjacentes à iniciação filopodial, alongamento e posterior estabilização ou retração, é crucial determinar a atividade da proteína espaço-temporal nessas estruturas dinâmicas. Para analisar a função de proteína em filopodia, desenvolvemos recentemente um algoritmo de rastreamento semi-automatizado que se adapta às mudanças de forma filopodial, permitindo análises paralelas da dinâmica de protrusão e da concentração relativa de proteína ao longo de todo o comprimento filopodial. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo detalhado para otimizar o gerenciamento de células, a aquisição de imagens e a análise de software. Além disso, fornecemos instruções para o uso de recursos opcionais durante a análise de imagem e representação de dados, bem como diretrizes de solução de problemas para todos os passos críticos ao longo do caminho. Finalmente, também incluímos uma comparação do dEscreveu software de análise de imagem com outros programas disponíveis para quantificação de filopodia. Juntos, o protocolo apresentado fornece uma estrutura para análise precisa da dinâmica de proteínas em protrusões filopodiais usando software de análise de imagem.

Usando células COS transfectadas com um marcador para a actina filamentosa (f-tractin 18 , vermelho) e uma referência citosólica (verde), encontramos protrusões filopodiais ricas em actina ( Figura 3A , painel superior). As séries temporais mostraram que os filopodios se estendiam e retraíam rapidamente ( Figura 3A , painel do meio). Usando o software de análise de imagem, então rastreamos filopod...

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A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K visualizações.  University of Muenster.  Apresentamos uma solução de software para o rastreamento semi-automatizado da concentração relativa de proteína ao longo do comprimento de protrusões celulares dinâmicas. 

Vídeo: A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicação de Light-resina adesivo dental para Eletrodos de montagem ou Sondas microdiálise em Experimentos crônica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biologia

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visualmente Rastreamento Odor Mediated Durante o Voo em Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Rastreamento Deformações Tissue Morfogenéticas no embrião de galinha precoce

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...