Agradecemos ao Prof. Geoffrey Wasteneys, da Universidade da Colúmbia Britânica, pela RFP-TUB6 que expressa sementes e um revisor anônimo por correções úteis. Agradecemos ao Prof. Hugh Dickinson por nos alertar para o uso de filme de celulose como suporte mecânico e para John Baker para fotografia. Este trabalho foi apoiado por BBSRC bolsas de pesquisa BB / G013993 / 1 e BB / D004055 / 1 para IM, e um BBSRC Prêmio de Treinamento de Doutorado e Clarendon Scholarship para CK

1. Criação da Câmara <ol><li> Usando um cortador de vidro, corte tiras de 3 mm de largura da extremidade de um slide de microscópio de 1 mm de espessura. Usando um cianoacrilato super-cola ou fita dupla face, cola essas tiras de vidro aproximadamente 45 mm de distância entre a largura de um segundo slide de microscópio ( Figura 1A ). Um slide por câmara é necessário, além de slides adicionais para derramar placas de agar (um slide produzirá 2-3 placas de agar). Os slides podem ser reutilizados. </li><li> Entre as tiras de vidro, forma uma gaxeta de idêntica altura fora da goma permeável ao gás (dimetilsiloxano). Colocar uma bola de goma de poli (dimetilsiloxano) sobre a lâmina ( Figura 1B ), molhar uma segunda lâmina com uma pequena quantidade de etanol absoluto a 100% e aplainar a bola de goma de poli (dimetilsiloxano) com a segunda lâmina até atingir a altura Das tiras de vidro ( Figura 1C ). <ol><li> Se necessário, corte excesso de poli (dimeTilsiloxano) com uma lâmina de barbear e repita o achatamento. </li></ol></li><li> Utilizando um cortador adequado ou uma lâmina de barbear molhada em etanol absoluto, remova a parte interior da goma de poli (dimetilsiloxano) para criar a cavidade que mais tarde irá reter as plântulas e a placa de agar ( Figura 1D ). </li><li> Cuidadosamente aparar o gel com uma lâmina de barbear para criar uma junta com uma espessura de parede final de aproximadamente 2 mm ( Figura 1E ). A permeabilidade dos gases através de uma barreira de poli (dimetilsilaxano) é independente de espessuras acima de 50 μm 11 . </li></ol> 2. Criação da laje solidificada com agar de meio de crescimento <ol><li> Em uma lâmina de microscopia com duas tiras de vidro, coloque uma lamela (22 mm x 50 mm) de modo que ela se apoie em ambas as tiras de vidro. </li><li> Pipetar o meio de cultura Murashige e Skoog de meia-força fundido contendo 1% p / v sacarose e agar a 1,5% p / v (½ MS) no espaço resultanteAbaixo do lamínula até que este último esteja completamente cheio (aproximadamente 1 mL de volume total) e deixe-se até que o ágar seja ajustado (aproximadamente 5 min). Nota: Os compostos farmacológicos podem ser administrados através da placa de agar adicionando concentrações apropriadas ao meio líquido antes da laje ser vertida. Este foi testado com sucesso para dexametasona 12 , isoxabeno, 2,6-diclorobenzonitrilo (DCB), orizalina e latrunculina B. </li></ol> 3 . Terminando a instalação da câmara <ol><li> Ar equilibram PFD agitando um pequeno volume de PFD em um tubo 7 . Adicionar uma pequena quantidade (aproximadamente 200 μL) de PFD com equilíbrio de ar ao poço da junta de gel, mas não encha a câmara completamente. Este PFD irá ajudar a evitar o aprisionamento de bolhas de ar sob a placa de agar como ele é colocado na câmara. </li><li> Remova a lamela da placa de agar (no passo 2.2 acima) e use uma lâmina de barbear para cortar uma porção deTamanho e forma. Em seguida, coloque-o no poço da junta de gel ( Figura 1F ). Deve haver uma folga de 2-4 mm para a junta ao redor. </li><li> Encha completamente a câmara com PFD com equilíbrio de ar. </li><li> Coloque uma ou mais mudas de A. thaliana (até 3 mudas para imagens por 2-3 dias) na placa de agar com cotilédones e hipocótilo pendurados sobre a borda, flutuando em PFD ( Figura 1G ). </li><li> Para obter mudas, esterilizar sementes com etanol a 70%, plantar em meio ½ MS suplementado com 1% de sacarose e agar a 0,8%, estratificar durante 2-4 dias a 4 ° C e crescer em placas orientadas verticalmente a 22 ° C em 16 H luz / 8 h regime escuro. Para imaginar raízes laterais, cultivar plantas durante 7-10 dias antes de transferir para câmaras de imagem. </li><li> Para fechar a câmara, aplique uma lamela correspondente à óptica da objectiva, empurrando-a suavemente para baixo com a borda de um microscópio de vidro até que a lamelaRepousa em ambas as tiras de vidro ( Figura 1H ). </li><li> Fixe a lamela com tiras de fita cirúrgica micropore de 1,25 cm de largura, cortadas em metade do comprimento em cada extremidade, se desejado ( Figura 1I ). Permitir que a amostra para resolver cerca de 30 min antes da imagem. Isto minimiza o movimento do espécime durante a imagem. </li><li> Realizar a imagem com um microscópio ereto para manter um substrato controlado para o crescimento. Use objetivos 20X / 0.7NA ou 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O método apresentado aqui é uma estratégia simples para a imagem confocal de alta resolução de desenvolvimento de raízes laterais para dois e até três dias. Durante períodos de até 48 h, não foram observados efeitos adversos do sistema de imagem no desenvolvimento da raiz lateral. Após 48 h, o crescimento médio das raízes laterais começou a diminuir, embora um subconjunto substancial das raízes (37%) continuasse a crescer a taxas comparáveis ​​ao crescimento médio das raízes em placas. Portanto, através da imagem um número suficientemente grande de raízes, raízes cujo crescimento retarda após 48 h pode ser excluído. Testes sistemáticos das câmaras de imagem não foram realizados por períodos superiores a 72 h, mas são recomendadas estratégias alternativas se forem desejados períodos alargados de imagem. As câmaras de imagem podem ser deixadas no estágio do microscópio continuamente, se forem proporcionadas condições ambientais adequadas, ou removidas para uma instalação de crescimento e periodicamente devolvidas ao microscópio. Isto permite que várias câmaras sejam fotografadas em paralelo. &lt;/ P&gt; Uma vantagem das câmaras aqui descritas é que as raízes laterais são fixas na sua posição e podem ser visualizadas utilizando lentes de imersão em água de alta resolução. A estabilidade espacial depende criticamente da concentração de ágar utilizada na placa de agar de suporte. Inicialmente, testou-se uma gama de diferentes concentrações de 0,8% de agar a 2% de ágar, revelando que concentrações elevadas neste intervalo fixavam fixamente as raízes no espaço, mas o crescimento das raízes abrandou mais rapidamente e algumas raízes apresentaram sinais de stress mecânico, incluindo o alongamento celular reduzido. Em contraste, baixas concentrações de ágar não forneceram o suporte necessário e as raízes derivaram em x, yez durante a imagem. A placa óptima de agar de 1,5% fixa a posição da amostra sem efeitos mecânicos adversos. Sob estas condições, após a sedimentação nos primeiros 30 min ou assim, as raízes são estáveis ​​ao longo de muitas horas, permitindo a aquisição de dados durante a noite. Durante a aquisição de dados 4D, os intervalos de pilha z foram tipicamente bEncadeado por um adicional de 5-10 μm, mas isso foi principalmente para acomodar o crescimento fora-de-plano de raízes laterais ao invés de z-drift ou oscilação. Embora a concentração padrão de ágar proporcione alguma resistência contra a penetração, as raízes gravitropicamente crescentes irão eventualmente penetrar no ágar. No entanto, através de uma pequena modificação da câmara de imagem, o crescimento das raízes poderia ser mantido paralelo ao lamínula, permitindo que as raízes laterais mais antigas e raízes primárias de ser fotografado. Além disso, a câmara de imagem básica poderia facilmente ser personalizada para hipocótilos. Os hipocótilos flutuam mais livremente neste sistema, pelo que o suporte do eixo z para a aquisição de imagem aumentou normalmente para cerca de 20 μm. Neste estudo, utilizou-se um microscópio ereto, que permitiu controlar as propriedades do substrato. A câmara de imagem pode ser adaptável a configurações de microscópio invertido, mas a influência dependente do tempo da lamela rígida nos órgãos interceptores terá de ser avaliada. </p&gt; Littlejohn e colegas têm apontado que PFD em si não prontamente dissolver moléculas biológicas, o que significa que ele não pode ser usado para o diretamente para a entrega de compostos farmacológicos 7 . Este problema foi superado através do fornecimento de tais compostos através da laje de meio de crescimento solidificado sobre a qual a placa de agar repousa. Embora os sistemas de perfusão continuem a ser o método de escolha para experiências de lavagem, a câmara de formação de imagens foi utilizada com êxito para a administração de dexametasona 12 e outros compostos. Uma nota, enquanto este artigo estava em preparação, von Wagenheim e colegas 18 descreveram uma câmara para a obtenção de imagens do desenvolvimento da raiz lateral usando microscopia de luz-folha.

Para estudar os processos celulares e subcelulares que sustentam o desenvolvimento das plantas, há uma demanda crescente por estratégias de imagem de longo prazo de alta resolução. Um desafio fundamental nessas experiências de imagiologia é a manutenção de condições fisiológicas, incluindo uma troca gasosa suficiente, mais um fornecimento de água e nutrientes 1 , 2 , 3 . Para utilizar objetivos com aberturas numéricas elevadas para uma óptima resolução óptica, os espécimes devem ser posicionados próximos e orientados paralelamente à lamela. O movimento nas direções x, y e z deve ser ideal durante a imagem. Enquanto as mudas são freqüentemente montadas em água ou solução aquosa para imagens de curto prazo, a água tem uma baixa capacidade para dissolver CO 2 e O 2 (1,54 mg / mL e 0,04 mg / mL, respectivamente a 20 ° C, 0,1 MPa) 4 , que fazÉ inadequado para experimentos prolongados de lapso de tempo. Sistemas de perfusão que mantêm níveis constantes de oxigênio e nutrientes são uma solução para este problema e foram desenvolvidos tanto para microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) 1 , 2 , 3 quanto para microscopia de luz (LSM) 5 . Sistemas como o RootChip 2 e o RootArray 3 foram projetados especificamente para imagens em lapso de tempo de desenvolver raízes e envolver a germinação de sementes em um dispositivo multi-espécimes personalizado. Estas disposições garantem uma perturbação mecânica mínima e são concebidas para a análise paralela de plântulas múltiplas, mas não são optimizadas para imagens de estruturas subcelulares. Calder e colegas projetaram uma câmara de imagem de perfusão mais complicada otimizada para imagens de estruturas subcelulares nas quais a amostra é mantida em posição por uma malhaPara permitir o uso de lentes de imersão de alta ampliação 1 . Apresentado aqui uma alternativa, solução simples para este problema que não é baseado em sistemas de perfusão, mas utiliza perfluorodecalin (PFD), um perfluorocarbon que recentemente ganhou popularidade como um meio de montagem para Arabidopsis imagiologia 6 , 7 , 8 . Em tais aplicações, a alta capacidade de PFD para dissolver CO 2 e O 2 (1,9 g / mL para O 2 em PFD em comparação com 0,04 mg / mL em água) 9 , permite a troca gasosa pelo tecido imerso. Além disso, o PFD não é fluorescente e seu índice de refração (1.313) é comparável ao da água (1.333) e está mais próximo do do citosol (~ 1.4) do que o do ar (1.000) 6 . Perfluorocarbonetos têm sido relatados para ter efeito fisiológico mínimo em uma variedade de plantas e plantasQuestões 6 , com sementes de rabanete germinando prontamente quando submerso em PFD e exibindo normal crescimento e desenvolvimento de pelo menos dois dias completos, quando abastecido com água 10 . Observações semelhantes foram feitas para a germinação de sementes de Arabidopsis 6 . Com base no espalhamento Raman estimulado para imagem diretamente a distribuição de PFD em tecidos de folha de Arabidopsis após a infiltração, Littlejohn e colegas concluem que PFD provavelmente não é tomado por células vivas 8 . O PFD foi previamente utilizado predominantemente para a imagem de tecidos aéreos, onde aumenta significativamente a profundidade de imagem, uma vez que se infiltra facilmente nos espaços de ar devido à sua baixa tensão superficial 6 . Aqui, o PFD é adotado para a imagem confocal de longo prazo de raízes laterais em desenvolvimento. Nesta configuração, são colocadas uma ou mais mudas numa placa de meio de crescimento solidificado com agar e imerso em PFD. O PFD permite gNa câmara de imagem, evitando a anoxia. O PFD é altamente volátil por isso é retido por uma junta de goma de poli (dimetilsiloxano) que também tem alta permeabilidade aos gases (1,5 x 10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 para CO 2 ) 11 . Nutrientes e água são fornecidos pela laje de meio solidificado com ágar. Ao mesmo tempo, esta placa de agar pressiona suavemente a raiz contra a lamela, fixando assim a sua posição relativa na câmara de imagem e permitindo a utilização de lentes de imersão de água de alta resolução. Além disso, a placa de agar pode ser utilizada para administrar uma gama de tratamentos farmacológicos, incluindo dexametasona, orizalina e isoxabeno. As câmaras de imagem podem ser montadas em grande número a partir de lâminas de microscopia padrão usando equipamento mínimo. As câmaras de imagem foram desenvolvidas e caracterizadas para estudar o desenvolvimento de raízes laterais, mas são adaptáveis ​​à imagem de outros órgãos de plântulas, tais como pontas de raízes primárias eHipocï¿½ilos.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

Vários aspectos do desenvolvimento da planta, como a morfogênese da raiz lateral, ocorrem em períodos de vários dias. Para estudar os processos celulares e subcelulares subjacentes, são necessárias estratégias de microscopia de lapso de tempo de alta resolução que preservem as condições fisiológicas. Os tecidos das plantas devem ter nutrientes adequados e abastecimento de água com troca gasosa sustentada, mas, quando submersos e imobilizados sob uma lamela, eles são particularmente suscetíveis à anoxia. Uma estratégia que tem sido empregada com sucesso é a utilização de um sistema de perfusão para manter um fornecimento constante de oxigénio e nutrientes. No entanto, tais arranjos podem ser complicados, complicados e requerem equipamento especializado. Apresentado aqui é uma estratégia alternativa para um sistema de imagem simples usando perfluorodecalina como um meio de imersão. Este sistema é fácil de configurar, requer equipamento mínimo e é facilmente montado em um estágio de microscópio, permitindo que várias câmaras de imagem sejam configuradas e visualizadas em parAlelo Neste sistema, as taxas de crescimento das raízes laterais são indistinguíveis das taxas de crescimento em condições padrão em placas de ágar durante os primeiros dois dias e o crescimento de raízes laterais continua a taxas reduzidas durante pelo menos outro dia. Os tecidos das plantas são fornecidos com nutrientes através de uma placa de agar que pode ser utilizada também para administrar uma gama de compostos farmacológicos. O sistema foi estabelecido para monitorar o desenvolvimento da raiz lateral, mas é prontamente adaptável à imagem de outros órgãos da planta, tais como hipocótilos e raízes primárias.

As raízes laterais crescem a taxas fisiológicas em câmaras de imagem. Os comprimentos de raízes laterais das plantas nas câmaras de imagem foram medidos a intervalos de uma hora ( Figura 2A , esquerda, Filme 1, n = 23) e as taxas de crescimento foram comparadas com as de raízes laterais cultivadas em placas de Petri padrão contendo o mesmo meio solidificado com agar . 2A , direita, Filme 2, n = 23). As taxas de crescimento podem variar consideravelmente entre as raízes laterais, sendo o comprimento da raiz um fator determinante devido às zonas cada vez mais longas de crescimento e proliferação 13 . Portanto, foram selecionados conjuntos de raízes laterais para representar raízes de diferentes comprimentos iniciais (variando de 50 μm a 1150 μm) tanto na câmara de imagem como na placa de ágar. Comprimento médio da raiz lateral no início da experiênciaFoi semelhante em cada conjunto (439 e 442 μm para câmaras de imagem e placas, respectivamente). No intervalo de tempo analisado de 27 h, o crescimento das raízes laterais foi aproximadamente linear tanto em câmaras de imagem como em placas, com uma taxa média de crescimento de 52 μm / h (R 2 = 0,997) em placas e 51 μm / h em câmaras de imagem R 2 = 0,993) ( Figura 2B ). As taxas de crescimento de raízes laterais individuais são altamente variáveis ​​tanto em placas quanto em câmaras de imagem ( Figura 2C ), variando de 17 μm / h a 82 μm / h em câmaras de imagem e de 13 μm / h a 87 μm / h em placas. Embora as taxas de crescimento geralmente aumentassem com o comprimento da raiz, as taxas de crescimento variaram ainda substancialmente entre raízes de comprimento semelhante, mas a variância foi semelhante em câmaras de imagem e em placas. Raízes laterais proliferam em câmaras de imagem e podem serGh objetivos de abertura numérica. As raízes laterais co-expressando o marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP 14 e o marcador de microtúbulos UBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6 (RFP-TUB6) 15 foram visualizadas por CLSM 10 a intervalos de 1 h para documentar o comportamento dos microtúbulos durante a proliferação celular em câmaras de imagem ( Figura 2D , Filme 3). Nestas câmaras, as raízes laterais eram altamente estáveis ​​na sua posição nos eixos x, y e z, permitindo a aquisição de pilhas confocal contínuas de lapso de tempo ao longo de várias horas. As células meristemáticas proliferaram continuamente, como é evidente a partir da formação de bandas pré-prófase ( Figura 2D , setas verdes), fuso mitótico ( Figura 2D , setas brancas) e fragmoplastos ( Figura 2D , setas azuis). Tal como acontece com mudas em placas de Petri,Células de raiz totalmente alongadas em câmaras de imagem iniciaram cabelos de raiz ( Figura 2A , Figura 2D , cabeças de seta), indicando ainda que o desenvolvimento prosseguiu conforme esperado nas câmaras de formação de imagens. Para proporcionar um campo de visão largo, as imagens na Figura 2D foram obtidas com um objectivo de 20x / 0,7 NA. Também foi possível obter imagens de alta resolução de raízes laterais utilizando um objetivo de imersão em água NA de alta abertura numérica 63x / 1,2 ( Figura 2E ). O crescimento das raízes laterais é sustentado em câmaras de imagem por até três dias. Para quantificar quanto tempo as câmaras de imagem poderiam suportar o crescimento das raízes laterais a taxas fisiológicas, o comprimento da raiz lateral nas câmaras de imagem (n = 27) e nas placas (n = 33) foi quantificado às 0 h, 24 h, 48 h e 72 h. As raízes do choSen eram menores do que 200 μm às 0 h, com um comprimento médio da raiz lateral de 117 μm nas câmaras de imagem e 121 μm nas placas. Uma vez que as raízes mais curtas crescem mais lentamente em média ( Figura 2C ), elas crescem com mais freqüência sobre a borda da placa de agar e são mais fáceis de representar. O crescimento médio de todas as raízes laterais não foi significativamente diferente nas câmaras de imagem em comparação com as placas de Petri nas primeiras 48 h ( Figura 3A ). No entanto, o crescimento médio foi significativamente reduzido entre 48 h e 72 h ( Figura 3A ). Embora as taxas de crescimento pareçam diminuir em geral nas câmaras de imagem após 48 h, as taxas de crescimento entre indivíduos continuam a ser altamente variáveis ​​( Figura 3B , 3C ), o que significa que existe um subconjunto substancial de raízes laterais que cresce a taxas comparáveis ​​em placas e câmaras Durante o período completo de 72 h de crescimento. 23 das 33 raízes laterais cultivadasEm placas (69,7%) atingem um comprimento dentro de um desvio padrão do comprimento médio a 72 h (entre 927 e 3 163 μm, Figura 3B , vermelho). 10 de 27 (37,0%) raízes laterais em câmaras de imagem atingem um comprimento dentro deste intervalo ( Figura 3B , vermelho). As câmaras de imagem podem ser facilmente adaptadas para raízes laterais mais antigas, raízes primárias e hipocótilos . Uma das limitações do projeto da câmara de imagem original foi que enquanto a placa de agar rígida forneceu alguma resistência mecânica, as raízes gravitropicamente crescentes penetraram na placa de agar, resultando em perda de qualidade de imagem ( Figura 4B ) e crescimento além da distância de trabalho de NA elevada Até mesmo o objectivo relativamente longo de 0,3 mm de distância de trabalho 63X / 1,3 NA CS2. As raízes laterais jovens não possuem asColumella necessárias para o gravitropismo 17, de modo que inicialmente cresceram paralelamente à lamela em câmaras de imagem ( Figura 2E ). À medida que crescem mais e columela e statoliths formam, raízes laterais exibem gravitropismo positivo crescente, enquanto raízes primárias exibem uma forte resposta gravitrópica de germinação em diante. Isto restringe a algumas horas o período sobre o qual as raízes primárias podem ser visualizadas e limita severamente o comprimento inicial das raízes laterais que podem ser visualizadas continuamente por 48 h ou mais. Para ultrapassar esta limitação, a câmara foi modificada de tal modo que o crescimento é mantido paralelo à lamela por uma membrana celulósica de celofane que actua como uma barreira de penetração na superfície da placa de agar ( Figura 4A ). As primeiras tentativas usando uma placa de agar a 1,5% causaram redução no crescimento da raiz dentro das primeiras 24 h, devido talvez ao estresse mecânico. As baixas concentrações de ágar na placa foram testadasD verificou-se que em câmaras com uma placa contendo 0,8% de agar e película de celulose, as taxas de crescimento das raízes laterais jovens não diferiram significativamente das taxas de crescimento em câmaras convencionais durante as primeiras 48 h. Durante 0-24 h, o crescimento médio das raízes nas câmaras de celulose e câmaras convencionais foi de 242 μm e 262 μm respectivamente (p = 0,78 Student t-Test) e para 24-48 h foi 330 μm e 355 μm 1 respectivamente (p = 0,67 Student&#39;s T-Test); N = 12 e n = 11, respectivamente. Este arranjo efetivamente impediu que as raízes laterais crescessem longe da lamela, para dentro do ágar, e também permitiu a imagem de raízes primárias por até 48 h ( Figura 4C ). Para testar se as câmaras de imagem poderiam ser adaptadas para órgãos diferentes das raízes, foram escolhidos os hipocótilos de Arabidopsis. Os hipocótilo são substancialmente mais espessos do que as raízes, pelo que na câmara de formação de imagens convencional,Ells foram espremidos contra a lamela, levando a deformação. Um desenho alternativo foi, portanto, desenvolvido usando cavidade slides que contêm uma depressão oval em seu centro ( Figura 4D ). Nesta configuração, colocou-se uma placa de agar de 1 mm de espessura (preparada como no ponto 2.2 acima) com uma extremidade que se projetava alguns mm para dentro da cavidade de deslizamento ( Figura 4D ). Os hipocï¿½ilos foram posicionados acima da cavidade na corrediï¿½ enquanto a raiz foi posicionada acima da parte horizontal. Isso garantiu que a plântula foi fixada no espaço pela raiz, mas o hipocótilo não foi esmagado. Embora as taxas de crescimento em câmaras comparadas com placas não fossem quantificadas sistematicamente, os hipocótilos em câmaras de imagem exibiram a bem descrita onda de crescimento longitudinal migrando para cima do hipocótilo ( Figura 4E , 4F ) 16 . <img alt="figura 1"Class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ arquivos / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Montagem de uma câmara de imagem. Todos os detalhes são descritos no texto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> Figura 2 : As raízes laterais crescem sob condições fisiológicas em câmaras de imagem. ( A ) Desenvolvimento da raiz lateral de Arabidopsis em câmara de imagem (à esquerda) e em placa (direita) superior a 25 h (luz constante, incubação horizontal, imagem simultânea). Barras de escala = 200 μm. ( B ) Parcela com comprimento de raiz lateral superior a 27 h (medido em intervalos de 1 h), de raízes laterais, conforme mostrado em ( A ). Individual(N = 23 para placas e câmaras de imagem), comprimento médio como círculos vermelhos. Barras de erro = 1 SD. A linha vermelha é ajustada linearmente através de comprimentos médios. ( C ) Parcela mostrando a taxa média de crescimento para todas as raízes laterais mostradas em ( B ) em relação ao seu comprimento inicial. ( D ) Projeções de intensidade máxima de pilhas 3D confocal adquiridas a partir de raízes laterais que expressam NPSN12-YFP e RFP-TUB6 em pontos de tempo consecutivos. Inserção: Ampliação da região encaixotada. Setas verdes: bandas pré-pró-fase; Setas brancas: fusos mitóticos; Setas azuis: phragmoplastos; Pontas de flecha: pêlos radiculares. ( E ) Projeções de intensidade máxima de imagens de alta resolução adquiridas a partir de uma raiz lateral jovem da linha transgênica mostrada em ( D ) usando um objetivo 63X / 1.2 NA e amostragem de Nyquist (dimensões de pixel 77 nm x 77 nm) às 0 h e 16 H; Os asteriscos localizam células idênticas em cada ponto de tempo; Seta indica uma célula que se divide entre 0h e 16 h.Barras de escala = 50 μm (AC); 20 μm (E). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> Figura 3 : Desenvolvimento de raízes laterais a longo prazo em câmaras de imagem. ( A ) Parcela mostrando o crescimento médio absoluto da raiz em três intervalos consecutivos de 24 h em câmaras de imagem em comparação com placas. Ns indica p @ 0,05; *** indica p &lt;0,001 (teste t de Student). N = 33 (placas) e n = 27 (câmaras de imagem). ( B ) Plot mostrando comprimentos de raízes laterais em pontos de tempo consecutivos em todas as raízes usadas em (A). Vermelho: todas as raízes laterais com um comprimento final dentro de 1 DP da média de todas as raízes laterais cultivadas em placas (entre 927 e 3163 μm). ( C ) Máximo emProjeções de tensão de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP em raízes laterais, adquiridas em pontos de tempo consecutivos ao longo de 72 h. Barras de escala = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> Figura 4 : As câmaras de imagem podem ser adaptadas para outros órgãos de plantas. ( A - C ) Adaptação da câmara de imagem para raízes primárias. ( A ) Esquema do desenho da câmara de imagem. Isto é idêntico ao desenho padrão ( Figura 1 ) para além de duas modificações: a placa de meio MS contém 0,8% de ágar em vez de 1,5% de ágar e uma película de celulose (vermelha) é colocada entre agar e planta para impedir o crescimentoNo ágar. ( B ) projeções de intensidade máxima XY (superior) e XZ (inferior) de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP na raiz primária de uma plântula de 7 dias de idade fotografada às 0 h e 48 h em uma imagem convencional câmara. Note-se que a raiz cresce no agar devido à sua resposta gravitrópica. ( C ) projeções de intensidade máxima XY (superior) e XZ (inferior) de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana de plasma NPSN12-YFP na raiz primária de uma plântula de sete dias de idade fotografada às 0 h e 48 h na imagem Com película de celulose. Antes da aplicação, a película de celulose foi esterilizada em etanol a 80% e embebida em meio líquido ½ MS. Note-se que o crescimento gravitrópico da raiz no ágar é impedido. ( D - F ) Adaptação de câmara de imagem para hipocótilos. ( D ) Esquema mostrando design de câmara de imagem de hipocótilo. Uma junta de goma de poli (dimetilsiloxano) (cinza) é manufactuVermelho sobre uma cavidade slide entre duas tiras de vidro (amarelo). Uma placa de 1,5% de ágar de espessura uniforme (bege) é colocada sobre a lâmina, atingindo parcialmente a cavidade. A câmara é preenchida com PFD (azul). As plântulas são colocadas sobre a placa de agar de modo que o hipocótilo ocupa a região inclinada para baixo da placa de agar na cavidade enquanto a raiz é posicionada na parte horizontal do ágar. A câmara é fechada com uma lamela. ( E ) Projeções de intensidade máxima de pilhas confocal 3D representativas do marcador de membrana plasmática NPSN12-YFP em um hipocótilo de uma plântula de dois dias de idade reproduzida durante 48 h em pontos de tempo consecutivos. ( F ) Crescimento longitudinal em dois intervalos de tempo consecutivos de células individuais ao longo do eixo basal ao eixo apical (posições relativas a 0 h ao longo do eixo mostrado em E) do hipocótilo mostrado em ( E ). Observe a onda de crescimento previamente descrita migrando para cima do hipocótilo 16 . Barras de escala = 100 μM. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Filme 1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> Filme 1: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste filme.</a> <img alt="Filme 2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> Filme 2: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">Clique aqui para fazer o download deste filme.</a> <img alt="Filme 3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> Filme 3: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">Por favor c</a>Lamba aqui para baixar este filme.

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A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Apresenta-se aqui uma técnica simples para imagens em tempo real confocal de alta resolução de desenvolvimento de raiz e hipocótilo por até 3 dias utilizando objectivos de elevada abertura numérica e perfluorodecalina como meio de imersão.

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K visualizações.  University of Oxford.  Apresenta-se aqui uma técnica simples para imagens em tempo real confocal de alta resolução de desenvolvimento de raiz e hipocótilo por até 3 dias utilizando objectivos de elevada abertura numérica e perfluorodecalina como meio de imersão. 

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biologia do Desenvolvimento

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Bioengenharia

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neurociência

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

A raiz do cabelo morfologia de plântulas de Arabidopsis em uma plataforma Microfluidic de duas camadas de imagem

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biologia

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medindo espacial e temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em Arabidopsis Plantas

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Uma câmara simples para a imagem confocal a longo prazo do desenvolvimento da raiz e do hipocótilo

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