Somos gratos a Annika Engbers e Frank Kurth pelo seu excelente apoio técnico e Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) para discussões úteis sobre medições TEER. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projeto A03 para HW e LK, CRC TR128, projeta A08; Z1 e B01 para LK e número de concessão HW, e do Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (Faculdade de Medicina de Münster) KL2 / 2015/14 para LK.

Para todas as experiências, os ratinhos foram criados e mantidos sob condições específicas isentas de agentes patogénicos em instalações para animais Central da Universidade de Munster, de acordo com as directrizes alemães para cuidados animais. Todos os experimentos foram realizados de acordo com as orientações do comitê de animais ética experimental e aprovado pelas autoridades locais de North Rhine-Westphalia, Alemanha (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217). 1. MBMEC Isolamento e Cultura NOTA: Isolar MBMECs como previamente descrito em detalhe 14 com as seguintes modificações: <ol><li> Sacrificar 20 adultos C57BL 6 ratos / (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória. </li><li> Lavar o rato com 70% de etanol e decapitá-lo com uma tesoura; remover o couro cabeludo usando uma pinça e tesouras. Fazer incisões no lado esquerdo e direito do crânio, a partir do forame magno. Levante o crânio do seu lado caudal e takde e para fora do cérebro com uma pinça. </li><li> Dentro de uma câmara de fluxo laminar, utilizar uma pinça estéril para colocar o cérebro em uma placa de Petri e remover o tronco cerebral, cerebelo e tálamo, mantendo apenas o córtex. NOTA: O uso de um microscópio não é necessária para qualquer um destes passos. </li><li> Coloque o córtex sobre um pedaço de papel Western blot estéril e enrolá-lo suavemente com uma pinça até meninges não são mais visíveis. </li><li> Após a digestão enzimática e mecânica (seguindo o protocolo 14), recolher as células endoteliais a partir do gradiente de densidade usando, uma agulha estéril de comprimento e um êmbolo 5 ml. As células endoteliais aparecer como uma camada escura acima do anel vermelho com eritrócitos. Transferência de 20-25 ml desta camada para um novo tubo de 50 ml de centrifugação; encher o tubo com DMEM. </li><li> Após dois ciclos de lavagem 14, ressuspender as células em 6 ml de meio contendo puromicina MBMEC (4 ug / ml) e semear-los para seis cavidades de uma placa de 24 poços; deixá-los em um tecidoincubador de cultura a 37 ° C e 5% de CO 2 (referido como &#39;incubadora&#39; daqui em diante) durante três dias. NOTA: Para mais informações sobre solução de revestimento MBMEC, consulte a Tabela de Materiais. </li><li> Alterar a forma através da adição de 1 ml a cada poço de meio fresco sem MBMEC puromicina; colocar a placa de volta a 37 ° C e 5% de CO 2 durante mais dois dias. </li></ol> 2. A colheita MBMECs <ol><li> No dia cinco após isolamento MBMEC, pré-revestimento com inserções permeáveis MBMEC solução de revestimento de: adicionar 80 ul de solução por pastilha e deixá-los a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 h. </li><li> Cuidadosamente pipeta a solução de revestimento e deixar o inserções de ar seco durante 30 minutos. Adicionar 2 ml de temperatura ambiente (TA) de PBS a cada poço da placa, utilizando MBMECs para lavar a forma; repita este passo. Adicionar 0,05% de tripsina-EDTA (300 uL por poço) e deixar a placa na incubadora durante 5-10 min. </li><li> Adicionar 2 ml de meio MBMEC a cada poço para parartripsinização. Transferir as células recolhidas para um tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar a 700 xg los durante 8 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio MBMEC sem puromicina. </li><li> Contar as células; misturar 10 ul de suspensão celular com 90 ul de 0,04% de Azul de Tripano (10X de diluição de células). Pipetar 10 ul desta mistura entre a cobertura de vidro e a câmara de contagem de células (hemocitômetro). Contagem de células tripano azul-livre em todos os quatro quadrantes da câmara (N) e determinar o número médio de células contadas (N &#39;) como se segue: N&#39; = N / 4. </li><li> Calcula-se a concentração celular (em 10 6 células / ml), utilizando a seguinte fórmula: C = N &#39;x 10 4 x 10, em que 10 4 é dada pelas dimensões do hemocitómetro e 10 é o factor de diluição do passo 2.4. </li><li> Semente de 2 x 10 4 células num volume de 260 ul por pastilha. Adicionar 810 ul de meio MBMEC para o compartimento inferior de cada poço. Coloque a placa com inserções na incubadora até que esteja pronto para prosseguir com o ponto 4. NOTA: Os volumes para o compartimento superior e inferior são de inserção específica e não funcionam para todos os formatos de 24 poços. </li></ol> 3. CD4 + T e isolamento das células Estimulação <ol><li> T CD4 + de isolamento de células <ol><li> Sacrificar um rato adulto (6-8 semanas de idade) por inalação de CO 2 e confirmar a sua morte por determinação parada cardíaca e respiratória. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas em uma placa de dissecação limpa e lave-o com 70% de etanol; usar tesouras e pinças esterilizadas para abrir o peritônio e remover os baço e linfonodos (inguinal, axilar, braquial e cervical); Finalmente, a transferência do tecido para um tubo de centrifugação de 15 ml contendo 5 ml de PBS em gelo. </li><li> Sob a câmara de fluxo laminar, transferir o tecido por decantação PBS com o tecido em um tubo de centrifugação de 50 ml com um filtro celular de 70 uM no topo; homogeneizaro tecido, pressionando-o com um êmbolo de 1 ml através do filtro. </li><li> Adicionar 30 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de tampão de FACS. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 40 mm, adicionar mais 20 mL de tampão de FACS para o tubo. </li><li> Centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS. </li><li> Adicionar 20 ul de rato CD4 microesferas magnéticas, misturar bem e incubar durante 15 min a 4 ° C. Adicionar 25 ml de tampão de SCAF e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Enquanto isso, coloque uma coluna de separação LS para o ímã e lave-o com 3 ml de tampão FACS. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de tampão de FACS. </li><li> Adicionar células para a coluna. Lavar a coluna com 3 ml de tampão de SCAF três vezes. Remova a coluna do ímã e colocá-lo em um novo 15 ml centritubo fugation. Adicionar 5 ml de tampão de FACS, lavar as células marcadas com o êmbolo coluna e centrifugar-lo a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio de células T. Contar as células tal como descrito em 2.4 e sementes de 1 x 10 5 células em 100 ul de meio por poço. </li></ol></li><li> Estimulação de células CD4 + T <ol><li> A estimulação das células T CD4 + policlonal <ol><li> Pré-revestimento de uma placa de 96 poços de fundo redondo com anticorpo purificado anti-rato CD3 (clone 145-2C11) em PBS, a uma concentração final desejada. Por exemplo, para pré-revestir a placa completamente com α-CD3 a 1 ug / mL, misturar 10 mL do anticorpo (concentração estoque = 0,5 mg / ml) com 5 ml de PBS, vortex e adicionar 50 uL da mistura para cada poço com uma pipeta multicanal. </li><li> Deixar a placa na incubadora durante 3 h. Depois de isolar as células T, lavar a placa pré-revestido duas vezes com PBS. Adicionar anticorpos anti-CD28 purificada (clone37,51) para as células T isoladas a uma concentração final desejado (por exemplo, a 1 ug / ml); misture bem. Semear as células T e deixá-los na incubadora por dois a três dias. </li></ol></li><li> Estimulação de células específicas de antigénio de células T CD4 + com células dendríticas (DC) NOTA: Se DCs são usadas como células apresentadoras de antigénio (APCs), seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes excepções: <ol><li> Antes de se homogeneizar o baço, injectá-la com 1 ml de colagenase de tipo IA em PBS a 0,5 mg / ml e transferi-lo para um tubo de centrifugação de 15 ml. </li><li> Incubar em banho-maria a 37 ° C durante 15 min. Após lavagem com PBS, ressuspender o sedimento em tampão de FACS e adicionar 20 ul de rato CD11c microesferas magnéticas, em vez de microesferas de CD4. </li><li> Usar uma coluna de separação de MS e os volumes apropriados: lavar a coluna com 1 ml de tampão de SCAF; Ressuspender as células em 1 ml de tampão de SCAF e lava-se a coluna com 1 ml de tampão de SCAF três vezes. </li><li> de Anúnciosd antigénio de escolha para DC (por exemplo, glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) AA 35-55 a 20 ug / ml), misturar bem e semente 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células T por 96-round-bottom bem. </li><li> Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de cavidades, com o fim, tal como descrito no protocolo para o isolamento de células T. </li></ol></li><li> A estimulação das células T CD4 + específicas para o antigénio com as células B NOTA: Se as células B são usados ​​como APCs, seguir o protocolo para o isolamento de células T, com as seguintes exceções: <ol><li> Use baços de ratinhos transgénicos, cujas células B são específicas do antigénio (por exemplo, ratinhos, IgH MOG (Th), cujas células B reconhecem especificamente MOG 35-55). </li><li> Utilização de células T específicas do antigénio (por exemplo, a partir de TCR MOG (2D2) ratinhos). Adicionar 20 l de rato CD19 microesferas magnéticas em vez de microesferas de CD4. </li><li> Adicionar o antigénio de escolha para o cel BLS (por exemplo, MOG 35-55 em 20 ug / ml), misturar bem e semente de 5 x 10 4 células em 100 ul de meio de cultura de células B por 96 de fundo redondo de poços. </li><li> Adicionar 1 x 10 5 células T em 100 ul de meio de cultura de células T por 96 de fundo redondo de poços, como descrito no protocolo para o isolamento de células T. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Configuração e Execução de Medição TEER <ol><li> Colocar o módulo de 24 poços do instrumento TEER sob a câmara de fluxo laminar. Retire as tampas e inserções lugar com MBMECs no instrumento usando uma pinça. </li><li> Pipetar 810 l de meio fresco para o compartimento inferior das cavidades do módulo: adicioná-lo cuidadosamente entre a pastilha e a parede do módulo bem. </li><li> Fechar as tampas e coloque o instrumento na incubadora. Conecte o instrumento ao seu computador; ligar o controlador de instrumento e abrir o software. </li><li> Selecione &quot;nova medição&quot; na janela pop-up. Check &#39;show TEER &quot;e caixas de&#39; show Ccl &#39;; em seguida, pressione &#39;start&#39;. Depois de completar a primeira medição, selecione &#39;check todos os poços&#39; no separador &#39;Resultados&#39; para ver todos os valores TEER e Ccl. </li><li> Salve o arquivo: Arquivo&gt; Salvar como&gt; &#39;o nome do seu arquivo&#39;. NOTA: Como TEER e Ccl são continuamente medido de forma automatizada, monitorar seus valores durante um período de três a cinco dias. Mudando a forma não é necessário, a menos que a viabilidade celular é sub-óptima, como visualizado por uma ausência de aumento na TEER. </li><li> Escolha o ponto de tempo para co-cultura MBMECs com células T quando Ccl é estável e inferior a 1 uF / cm 2 e TEER atingiu o seu nível máximo. </li><li> inspecione cuidadosamente valores absolutos TEER e Ccl e excluir os poços nos quais MBMECs não desenvolveram monocamadas confluentes suficientes desmarcando tais poços. </li><li> Grupo do resto dos poços: clique com o botão direito sobre um bem e selecionar &quot;adicionar bem ao novo poço média&quot;. Namenviar um e-lo na janela pop-up; fazer o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados. </li><li> Verificar todos os poços médios para confirmar que todos eles têm as mesmas condições iniciais antes da co-cultura. Se alguns têm significativamente diferentes valores absolutos TEER ou TEER encostas, ou os erros padrão são muito grandes, refazer o agrupamento. NOTA: O agrupamento ideal de poços fornece uma variação mínima em valores TEER, dentro e entre os grupos experimentais. </li><li> Na aba &quot;experimento&quot;, pressione &quot;pausa&quot;, desligue o instrumento e levá-la para fora da incubadora. Retirar as tampas sob a câmara de fluxo laminar. </li><li> Prepare pré-ativado e / ou células T naive, com ou sem citocinas específicas, anticorpos ou outras substâncias, como desejado: Por exemplo: Mistura purificado rato NA / LE anticorpo anti-rato IFN-γ (XGM1.2 clone) com T preparado as células, a 20 ug / ml por poço do instrumento TEER. NOTA: Se as substâncias, tais como inibidor de granzima B são usados, eles são umdded à cultura de células T no início da estimulação das células T: por exemplo, granzima B Inhibitor II (Calbiochem) é misturado com as células T isoladas a uma concentração final de 10 uM em DMSO. Ver Materiais e Equipamentos para mais detalhes. </li><li> Remover parte do meio da inserção (o compartimento bem superior): por exemplo, cuidadosamente pipeta 150 uL (removendo toda a forma deve ser evitado, uma vez que poderiam perturbar a monocamada MBMEC). </li><li> Adicionar células T para MBMECs pipetando cuidadosamente 150 ul de meio contendo 2 x 10 5 células / inserção. NOTA: Quando a colheita de células T pré-ativado, contar apenas explodir, células Trypan Blue-livres. </li><li> Fechar as tampas e coloque o instrumento de volta para a incubadora. Volte a ligar o instrumento e pressione &#39;medição currículo&#39;. Depois de 24 horas, pressione &#39;stop&#39; no separador &#39;experimento&#39; e salve o arquivo (Arquivo&gt; Salvar). </li></ol> 5. Data Export e Análise Estatística <ol><li>Exportar os resultados escolhendo Arquivo&gt; Exportar. </li><li> Na guia &quot;Configurações&quot; da janela pop-up, selecione &quot;.dot&quot; na opção &quot;separador decimal&quot; e &quot;tabulator&quot; na opção &quot;delimitador de campo&quot;. </li><li> Na aba &quot;resultados de exportação&quot;, o nome do arquivo, verifique todos os poços a serem exportados, e marque a opção &quot;TEER&quot; e caixas &quot;Ccl&quot; na &quot;escolha de dados&quot; opção. </li><li> Pressione &quot;exportar dados,&quot; abrir o arquivo exportado, e copiar os dados para uma planilha. </li><li> Normalizar os dados exportados (classificado por cada repetição, com valores TEER e Ccl dadas para cada execução (medição)): valores Set TEER e Ccl do último ponto de tempo antes que a co-cultura para 100% e mudar de acordo com os valores para todos os outros runs, em relação ao run &#39;100%&#39;. </li><li> Copiar os dados normalizados para um software de escolha para gerar um gráfico, usando poços individuais e exibindo o erro padrão da média para cada grupo de tratamento. </li><li> Perform dois sentidos teste estatístico ANOVA com correção de Bonferroni para comparações múltiplas, utilizando o software estatístico de escolha. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl and L. Klotz have nothing to disclose. H.-J. Galla is a scientific advisor of nanoAnalytics GmbH, the manufacturer of the automated cell monitor.

Vários passos do protocolo descrito são essenciais para uma experiência de sucesso. Durante o isolamento e cultura MBMEC inicial, é crucial que o trabalho é executado sob condições estéreis, tanto quanto possível, para evitar a contaminação da cultura de células com esporos de fungos ou bactérias. A fim de se obter uma cultura pura de células endoteliais, é recomendado o uso de um meio contendo puromicina para os três primeiros dias, o que permite que a sobrevivência das células endoteliais, mas não o...

A barreira sangue-cérebro separa a circulação sistémica a partir do sistema nervoso central (SNC) 1-3. Ele fornece uma barreira física que inibe a livre circulação das células e à difusão de moléculas solúveis em água e protege o cérebro de agentes patogênicos e substâncias potencialmente nocivas. Para além da sua função de barreira, o BBB permite o fornecimento de oxigénio e nutrientes para o parênquima cerebral, o que assegura o bom funcionamento do tecido neuronal. As propriedades funcionais da certificação são altamente regulados pelos seus componentes celulares e acelulares, com ECs altamente especializada sendo o seu principal elemento estrutural. CEs da certificação são caracterizados pela presença de junção estanque (TJ) complexos, falta de fenestrações, extremamente baixa actividade pinocytic, e mecanismos de transporte permanentemente activas. Outros componentes da certificação da membrana basal CE, pericitos incorporação do endotélio, pés terminais astrocíticos e = par associadomembrana basal enchymal também contribuir para o desenvolvimento, manutenção e função da BHE 2,4 - 6 e, em conjunto com os neurónios e microglia, formam a unidade neurovascular (NVU), que permite o bom funcionamento do SNC 7-9. Numa variedade de doenças neurológicas, tais como neurodegenerativas, doenças inflamatórias ou infecciosas, a função da BHE está comprometida 2,5,10. A desregulação de TJ e complexos mecanismos de transporte moleculares leva ao aumento da permeabilidade a certificação, o extravasamento de leucócitos, a inflamação e dano neuronal. A fim de estudar as propriedades de BBB sob tais condições fisiopatológicas, vários modelos in vitro da BBB foram estabelecidas 9,11,12. Juntos, eles têm fornecido informações valiosas sobre as mudanças da integridade da barreira, a permeabilidade, bem como mecanismos de transporte. Estes modelos utilizam células endoteliais de origem humana, de ratinho, rato, porcino ou bovina 13-18; células endoteliais primárias ou linhas celulares são cultivadas quer como uma monocultura ou em conjunto com os pericitos e / ou astrócitos para imitar mais de perto a certificação in vivo 19-25. Nos últimos anos, a medição da resistência eléctrica transendotelial (TEER) tornou-se uma ferramenta amplamente aceito para avaliar as propriedades de barreira endotelial 26,27. TEER reflecte a impedância ao fluxo de iões através da monocamada de células e a sua redução proporciona uma medida sensível da integridade da barreira endotelial comprometida e, por conseguinte, aumento da permeabilidade. Vários sistemas de medição TEER têm sido desenvolvidos, incluindo epitelial Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato Eléctrica Impedância de detecção (ECIS), e análise de células em tempo real 15,28 - 30. TEER reflecte a resistência ao fluxo de iões entre CEs adjacentes (via paracelular) e é directamente proporcional àa integridade da barreira. Em espectroscopia de impedância 27,31, impedância total complexo de (Z) é medida, que fornece informações adicionais sobre a integridade da barreira medindo Ccl. Ccl relaciona-se com a corrente capacitiva através da membrana celular (via transcelular): a camada de células actua como um condensador no circuito eléctrico equivalente, que separa as cargas em ambos os lados da membrana e é inversamente proporcional à integridade da barreira. Quando cultivadas em inserções permeáveis, ECs aderir, proliferar e espalhar sobre a membrana microporosa. Isto resiste a corrente capacitiva fundo da inserção (que por sua vez actua como um condensador) e leva a uma diminuição na capacitância até que atinge o seu nível mínimo. Isso é seguido pelo estabelecimento de TJ complexos que vedar o espaço entre as células endoteliais adjacentes. Isso restringe o fluxo de iões através da via paracelular, e TEER aumenta até atingir o planalto. Sob condições inflamatórias, no entanto, o endotheliai barreira está comprometida: TEER diminui à medida que TJ complexos são interrompidos e Ccl aumenta à medida que o componente capacitivo da inserção sobe novamente. Nossa medição TEER usa o sistema automatizado de monitorização das células 32: segue-se o princípio da espectroscopia de impedância e estende suas aplicações anteriores. Aqui, nós descrevemos um modelo in vitro a certificação que permite o estudo das propriedades de barreira, incluindo a interacção de endotélio cerebral com células do sistema imune; em particular células T activadas. Tais condições fisiopatológicas são observadas em doenças auto-imunes do sistema nervoso central, tais como a esclerose múltipla e o seu modelo animal experimental de encefalomielite auto-imune 33-37. Aqui, um passo crucial é a transmigração de células T encefalitogénicas, específicos de mielina em todo o BBB. Isto é seguido pela sua reactivação no espaço perivascular e entrada dentro do parênquima do cérebro, onde se recrutar outras células do sistema imunológico e meinflamação diate e subsequente desmielinização 1,35,38. No entanto, os mecanismos moleculares da interacção entre estas células T e as células endoteliais, os principais constituintes da BBB, não são bem compreendidos. Nosso protocolo visa preencher esta lacuna e dar novos insights sobre as consequências sobre as células endoteliais (ou seja, a integridade da barreira e permeabilidade) mediante o seu contacto directo e complexa interação com as células T ativadas. O protocolo aqui descrito faz uso de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato primária, cultivadas como uma monocamada em inserções permeáveis ​​com membranas microporosas. As células endoteliais são co-cultivadas com células T CD4 +, que podem ser pré-activados quer policlonal ou de um modo específico do antigénio. Co-cultura de células T com MBMECs pré-activado, mas não ingénuos induz uma diminuição da TEER e um aumento em CCL, a qual fornece uma medida quantitativa da disfunção e barreira perturbação MBMEC. a técnicaé não-invasivo: ele usa built-in em vez de eletrodos pauzinho, que impedem a grande perturbação da monocamada CE; ele pode ser utilizado para monitorizar a função de barreira, sem a utilização de marcadores de células. Faz medições contínuas em uma forma automatizada e permite uma avaliação independente dos dois parâmetros de barreira (TEER e CCL), simultaneamente, ao longo do tempo. O método também é suficientemente sensível para distinguir entre diferentes níveis de activação de células T e os efeitos de tais células T na ECS. Ele pode ser usado numa grande variedade de ensaios funcionais diferentes: as citocinas e / ou quimiocinas implicados em processos inflamatórios podem ser adicionadas à co-cultura de células T e MBMECs; anticorpos bloqueadores contra moléculas de adesão celular em ambos o lado CE ou de células T pode ser utilizado; e inibidores de marcadores de activação das células T ou de suas propriedades citolíticas pode ser adicionado durante a iniciação de células T ou a sua co-cultura com células endoteliais. O ensaio é também útil para a transmigração de células Tensaios, uma vez que pode servir como um controlo da integridade monocamada MBMEC antes da adição de células T qualidade. Tudo isto torna este método uma ferramenta versátil e fiável para estudar a certificação in vitro, com um foco no efeito de células T activadas na integridade monocamada CE. Isto é de particular importância para a compreensão dos mecanismos de certificação da interrupção na patogénese de doenças auto-imunes, como a esclerose múltipla e o seu modelo animal de EAE, em que, as células T auto-reactivas encefalitogénicas atravessar a BHE e causar inflamação e dano neuronal.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com</td><td>including: 24-well Cell Module, Controller, PC with cellZscope software v2.2.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 software</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td><td>for analysis of T cell transmigration</td></tr><tr><td>Oak Ridge centrifuge tubes, PC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 0.4 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>for TEER measurement as the main readout</td></tr><tr><td>Transwell membrane inserts - pore size 3 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>for TEER measurement as the quality control prior to T-cell transmigration assay</td></tr><tr><td>24-well cell culture plate</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>flat-bottom; for MBMEC culture</td></tr><tr><td>96-well cell culture plate</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>round-bottom; for immune cell culture</td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>for T cell and B cell isolation; supports MACS LS columns</td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>for dendritic cell isolation; supports MACS MS columns</td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Cell strainer, 70 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>MACS LS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>for T cell and B cell isolation</td></tr><tr><td>MACS MS separation columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD4 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td>for CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>for B cell isolation</td></tr><tr><td>Mouse CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Collagen type IV from human placenta</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>for MBMEC coating solution</td></tr><tr><td>Collagenase 2 (CSL2)</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td><td>for MBMEC isolation</td></tr><tr><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for MBMEC isolation and MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>for MBMEC and immune cell isolation</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>for MBMEC culture medium</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833</td><td>for MBMEC culture medium; only for the first three days</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>for harvesting MBMECs</td></tr><tr><td>Collagenase Type IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td>for dendritic cell isolation</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>for immune cell isolation</td></tr><tr><td>IMDM + 1% L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>for T cell culture medium</td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>protect from light; for B cell culture medium</td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (100x Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>for B cell culture medium</td></tr><tr><td>mouse MOG&lt;sub&gt;35&amp;mdash;55 &lt;/sub&gt;peptide</td><td>Biotrend</td><td>BP0328</td><td>for antigen-specific T cell activation</td></tr><tr><td>purified anti-mouse CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>clone 145-2C11; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>purified NA/LE anti-mouse CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>clone 37.51; for polyclonal T cell activation</td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>PeproTech</td><td>315-05</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>Recombinant Murine TNF-&amp;alpha;</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td>for T-cell transmigration assays</td></tr><tr><td>NA/LE purified anti-mouse IFN-&amp;gamma; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>clone XMG1.2; recommended final concentration: 20 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B Inhibitor II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>recommended final concentration: 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD4 antibody</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>clone RM4-4; for analysis of T cell transmigration</td></tr></tbody></table>

an in vitro model of the blood-brain barrier using impedance spectroscopy: a focus on t cell-endothelial cell interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

A Figura 1 fornece uma visão geral do modelo de certificação in vitro utilizado para estudar a interação entre células T e células endoteliais. O experimento consiste em três etapas principais. O primeiro passo é o isolamento de MBMECs primárias a partir de córtices cerebrais, e a sua cultura durante cinco dias. Quando atingem confluência na placa de cultura celular, MBMECs são tripsinizadas e re-semeadas em inserções permeáveis, os quais são, e...

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An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da barreira sangue-cérebro que usa espectroscopia de impedância: Um foco na interação celular T Cell-endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

11.2K visualizações.  University Hospital Münster. Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Medicina

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Imunologia e Infecção

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Neurociência

Análise de modelos de barreira hematoencefálica via coloração por imunofluorescência

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

Autor em destaque: Avançando o uso da tecnologia de chip de tecido para estudar tecidos humanos 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Bioengenharia

Medição da resistência transendotelial para avaliar a integridade da barreira celular

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

Autor em destaque: Aplicações da detecção TEER para avaliar a integridade da barreira celular 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

A

Resumo

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Criação de um

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Um modelo de Interface de sangue-cérebro humano para estudar os cruzamentos de barreira por agentes patogénicos ou medicamentos e suas interações com o cérebro

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Uso da Plataforma de Tecido de Barreira MicroSiM (μSiM) para Modelagem da Barreira Hematoencefálica

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial

Registro da Integridade Funcional da Barreira em bEnd.3 Células Endoteliais Vasculares via Detecção de Resistência Elétrica Transendotelial