We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).

1. Ensaio de resposta evocada-Touch <ol><li> Preparação de 2 dpf embriões para ensaio de resposta evocada-Touch <ol><li> Certifique-se de que a hora do dia em que o ensaio é efectuado é consistente entre experiências porque a actividade pode variar dramaticamente ao longo do dia 17,18. NOTA: O experimento deve ser realizado cego e a ordem de ensaio randomizado para minimizar artefatos experimentais. </li><li> Atribuir o peixe estirpes um número, que é desconhecida para o indivíduo realizar o experimento. Em seguida, usando ferramentas online disponíveis gratuitamente gerar uma lista aleatória que determina a ordem de ensaio. </li><li> Pelo menos uma hora antes do teste, os embriões dechorionate por rasgando um buraco no cório e puxando o cório além usando um par de pinças finos. Remova todos os detritos da placa de petri antes de voltar ao 28 ° C incubadora. </li></ol></li><li> Execução de ensaio de resposta evocada-Touch <ol><li> sta calorGE a 28 ° C, pelo menos, 15 min antes de se iniciar o teste. NOTA: Esta etapa é temperatura controlada e permanecerá em 28 &#160; ° C durante a duração do teste. Temperatura irá afectar a actividade e por isso é importante para manter uma temperatura constante. Se uma fase de aquecimento não está disponível, então a temperatura da água deve ser monitorizada e todas as experiências deve ser conduzido à mesma temperatura. </li><li> Coloque uma placa de petri preenchida com meio embrião (NaCl 5 mM, 0,17 mm de KCl, CaCl2 0,33, MgSO 0,33 mM 4 em água) para um estágio iluminado e montar a câmera de alta velocidade através da placa de Petri. </li><li> O lançamento do software de vídeo de gravação da câmera (como o fluxo Pix 5, descrito aqui) e sob a guia &quot;espaço de trabalho&quot;, selecione 1.000 quadros por segundo (fps 1000) como a velocidade de captura para assegurar que a ação natação rápida do peixe é gravado. </li><li> Trabalhando com um embrião de cada vez, colocar o embrião no middle do prato Petri com o peixe-zebra claramente visível no campo de visão. NOTA: Se o embrião nada para longe antes do início do experimento substituí-la por outra, como recapturar e posicionamento do embrião pode resultar em ele se tornar insensíveis ao estímulo e respostas estouro repetidas podem promover a fraqueza muscular em alguns modelos de doenças. </li><li> Iniciar a gravação clicando no botão &quot;record&quot; e, entregar o estímulo mecanosensorial ao embrião por tocá-lo suavemente com uma agulha sem corte na parte superior da cabeça. </li><li> Parar a gravação depois que o embrião tem nadado fora do campo de visão ou devolvidos para descansar. NOTA: Os picos de aceleração dentro do primeiro 0,2 seg da resposta de fuga explodiu após o estímulo mecânico. Por conseguinte, assegurar que, pelo menos durante o primeiro 0,2 seg da resposta de fuga a gravar o peixe é no campo de visão. Usando o software descrito no passo 1.2.3, os dados serão automaticamente salvoscomo um arquivo de vídeo AVI. software de captura de vídeo alternativo, como Captura Free Video ou Softonic, ambos os quais estão disponíveis gratuitamente para download, também poderia ser usado. </li><li> Devolver o embrião para uma nova placa de Petri e selecione outro embrião para o teste. Realizar testes em um mínimo de 15 peixes. </li></ol></li><li> Quantificação de comportamento de natação <ol><li> Para quantificar o comportamento de natação, inicie o software e selecione o &quot;Single Larvas Locomotion sem subtração de fundo&quot; módulo para abrir o arquivo de vídeo salvo .avi. </li><li> Usando a &quot;mão livre&quot; ou &quot;polígono&quot; ferramenta na barra de menu áreas selecionadas do filme a ser utilizado para a análise. Certifique-se de que a região engloba tanto a posição original do peixe e da área que os peixes vão nadar em. Certifique-se de que a sonda é excluído da área a ser analisada. O software irá automaticamente rastrear a trajetória dos peixes dentro da área desejada. </li><li> Para executar tanálise ele, clique em &quot;experiência&quot; na barra de menu e selecione &quot;executar&quot;. Quando solicitado, salve o arquivo de análise de dados em bruto (.phr formato) no local desejado. Uma vez salvo, clique em &quot;Iniciar&quot; para iniciar a análise. Terminar a análise, clicando em &quot;stop&quot; no âmbito do &quot;experimento&quot; no menu suspenso. Uma janela contendo os resultados serão exibidos. </li><li> Role para a direita para obter o valor &quot;aceleração máxima&quot;. Se desejar, exportar esses dados, fechando a janela de resultados e clicando no botão &quot;Exportar resultados instantâneos&quot;, sob os &quot;resultados&quot; no menu suspenso. Selecione o arquivo de análise de dados em bruto apropriado e clique em aberto. Um arquivo de texto que pode ser aberto em um programa de planilha será salvo na pasta de destino. </li><li> Repita esse processo para cada peixe individual e média para obter a aceleração máxima média para cada estirpe (ver Figura 1). NOTA: Como uma alternativa para using o software descrito aqui, embalagens semelhantes, tais como o software ImageJ livremente disponível pode ser usado para extrair os dados de movimento relevantes. O plug-in 3D Particle perseguidor pode ser usado para rastrear trajetórias de natação. </li></ol></li></ol> 2. Locomotion Ensaio - 10 min Swim Teste <ol><li> Preparação de 6 dpf embriões para Análise de Natação <ol><li> Se necessário, tipo embriões para o genótipo necessário, por exemplo, examinando a expressão de uma proteína fluorescente ou por fenótipo, e colocar numa placa de petri separada (25-30 embriões por placa). Alternativamente, o genótipo pode ser determinado após a conclusão do ensaio de locomoção. </li><li> Aos 3 dpf, re-examinar placas de Petri e remover todos os embriões não eclodidos e detritos. Retorno placas de petri de 28 ° C incubadora até 6 dpf. </li><li> Realizar testes de todas as estirpes entre as 9 e as 12 horas, que é o tempo em que larvas do peixe são mais ativos. Aleatória a ordem de testes e posição no ptardio de tipo selvagem e mutantes amostras para minimizar os efeitos das diferenças circadianos e outros desvios experimentais. NOTA: É importante que o tempo de teste é consistente entre experiências porque a actividade pode variar dramaticamente ao longo do dia. </li><li> Pelo menos 30 minutos antes do teste, as larvas lugar em uma placa de 48 poços com uma larva por poço. Após a transferência, encher os poços de modo a que a superfície da água é logo abaixo da parte superior do poço, assegurando que não existem bolhas. Retorno placas a 28 ° C incubadora. </li><li> Aqui as placas para fora da incubadora e aclimatar à luz durante cinco minutos antes do teste. </li></ol></li><li> Realizando Locomotion Assay <ol><li> Colocar a placa de 48 poços para dentro da câmara de gravação, que está equipado com uma câmara digital infravermelho, capturando-se a 60 quadros / segundo, de modo que as larvas podem ser detectados no escuro. Verificar que todas as cavidades são colocadas dentro da grade circular no software de locomoção e de que todas as larvas são CLEarly detectável. </li><li> O lançamento do software e selecione o módulo &quot;tracking&quot;. No &quot;Arquivo&quot;, clique em &quot;gerar um novo protocolo&quot; e editar o número de poços utilizados para o experimento. Definir a duração da experiência e do período de integração de 10 min, clicando nos &quot;parâmetros&quot; no menu suspenso e selecionar os &quot;parâmetros de protocolo&quot; e, posteriormente, na guia &quot;tempo&quot;. Na mesma caixa de diálogo &quot;parâmetros de protocolo&quot;, clique na aba &quot;Opções&quot; e garantir a caixa de seleção &quot;Numeriscope&quot; é clicado após o que, o &quot;parâmetros de protocolo&quot; caixa de diálogo pode ser fechada. </li><li> Para definir as áreas de gravação destacar toda a rede e clique duas vezes em um dos poços. Clique no botão &quot;áreas desenhar&quot; e desenhar em torno do canto superior esquerdo, superior direito, e os poços inferior esquerdo e clique em &quot;construção&quot;, que permite que o software para determinar automaticamente a posição de cada poço. Também desenhar em uma escalabar e clique em &quot;aplicar ao grupo&quot;. Depois de concluído, clique no botão &quot;desenhar áreas&quot;. </li><li> Visualmente determinar o limiar de detecção, deslizando a barra de &quot;limiar de detecção&quot; a um nível em que apenas os movimentos de peixe são realçados com ausência de sinais de fundo. NOTA: O limiar de detecção irá variar entre linhagens e, assim, os limites têm de ser determinados, sempre que uma nova cepa é testada. Nos dados representativos apresentaram um limiar de detecção de 25 mm / seg foi usada. </li><li> Antes de iniciar o teste introduzir limiares de movimento para a detecção de inatividade, e pequenas e grandes movimentos. NOTA: Nos dados representativos apresentou um limite de inatividade de 6 mm / seg e uma actividade limiar explosão de 30 mm / seg foi usado. Os limiares determinar o movimento mínimo a ser considerado ativo e o nível necessário para ser considerado atividade de explosão e permitir a classificação de atividade em pequena (ativo, mas abaixo activi explosãolimiares ty) e grandes (maior do que o limite de atividade de explosão movimentos). Os limiares podem ser alterados, dependendo da actividade das estirpes particulares de peixes analisados. Nota: Embora o ensaio pode ser realizado tanto em condições claras ou escuras, larvas de peixe-zebra foram mostrados para ser mais activos no escuro 18. </li><li> Definir a intensidade da luz no interior da câmara para ser em 0%, clicando no botão &quot;Configurações de condução de luz&quot;, sob os &quot;parâmetros&quot; no menu suspenso. Na caixa de diálogo resultante, adicione as configurações de luz necessários. NOTA: A intensidade da luz no interior da câmara pode ser acionado para ligar e desligar durante o tempo de teste para estimular a atividade larval </li><li> Feche a porta da câmara de gravação e iniciar a gravação de vídeo. </li></ol></li><li> Quantificação de comportamento de natação <ol><li> Após o experimento for concluída, clique em &quot;stop&quot; no âmbito do &quot;experimento&quot; no menu suspenso. A bo diálogox com todos os resultados serão exibidos. </li><li> Para aceder a estes resultados em Excel, clique em &quot;abrir contendo pasta&quot; e abra o arquivo excel que aparece na pasta resultante. Os parâmetros importantes são &quot;smlct&quot; (pequena contagem de movimento), &quot;larct&quot; (grande contagem de movimento), &quot;smldist&quot; (distância total percorrida pelo peixe em pequenos movimentos) e &quot;lardist&quot; (distância total percorrida pelos peixes em grandes movimentos ). NOTA: Após a gravação, o software retorna também dois ficheiros de saída adicionais sob a forma de um ficheiro de avi (contendo um vídeo da gravação de 10 min) e um ficheiro de imagem PNG (contendo uma representação visual da locomoção durante a 10- min experiência; veja a Figura 2). </li><li> Uma vez que os valores de locomoção são calculados, repetir os arquivos .avi e .png a avaliar se os valores de locomoção calculados com precisão retratam os movimentos de natação do peixe (veja a Figura3). NOTA: Como uma alternativa para usar o software descrito aqui, pacotes, tais como o software ImageJ livremente disponível pode ser usado para controlar o comportamento locomotor. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Muitos modelos animais diferentes, incluindo ratos, cães, peixes-zebra, moscas e vermes têm contribuído para o nosso entendimento da base genética e molecular de doenças musculares, e ajudou no desenvolvimento de abordagens terapêuticas para combatê-las. O peixe-zebra possui várias vantagens para o estudo da doença muscular. O peixe-zebra fornece um sistema geneticamente manipulável para avaliar padrões músculo complexa em um ambiente fisiológico adequado, o que não é possível em sistemas de cultura in vitro. Ao contrário de outros modelos animais vertebrados, o grande número de peixes produzidos, juntamente com a sua claridade óptica, facilita a rápida, de alto rendimento em química vivo e rastreio genético. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de ensaios de circulação de peixe-zebra para fornecer um alto throughput e método automatizado para avaliar o desempenho muscular durante a embriogênese peixe-zebra. Para ambos os ensaios deve-se reconhecer que os ritmos circadianos eestímulos ambientais externos irá afectar significativamente o comportamento de natação do peixe-zebra 17,18. Teste repetido do mesmo peixe-zebra também irá conduzir a habituação causando uma diminuição da resposta ao estímulo táctil 23. Por conseguinte, a fim de obter resultados reprodutíveis entre experiências, cada embrião do peixe-zebra só deve ser testado uma vez, o tempo de dia e as condições de iluminação deve ser normalizada, e a temperatura da água tem de ser fortemente regulada. Usando o toque evocado análise em 2 dpf podemos medir directamente a aceleração máxima de uma acção de ruptura de natação, a qual é proporcional à força muscular. As técnicas anteriores em peixes-zebra foram examinados força muscular, amarrando ambas as extremidades dos embriões a seguinte equipamento experimental que a contração do músculo é estimulado utilizando um campo eléctrico e a capacidade de geração de força do músculo 14 é medido. Embora este método mede a força de capacidade de geração de tele muscular larval, não mede a força real gerada pelo músculo larval durante a natação. Assim, desenvolvemos um método para avaliar indirectamente a força gerada durante o movimento normal de natação das larvas para fornecer uma medida geral de saúde do músculo. O sistema de vídeo de alta velocidade, capaz de gravar os movimentos de peixe-zebra individuais em uma taxa de quadros de 1.000 frames / seg pode ser usado para identificar pequenas, mas significativas diferenças na função muscular, que não são diretamente distinguíveis a olho nu. Será de interesse para ver como relatado anteriormente mudanças na eletroestimulado força geração se correlacionam com mudanças no desempenho de natação. Além disso, o toque evocado ensaios de resposta também pode ser usado para avaliar a cinemática de natação, tais como a forma e a velocidade de onda do corpo durante o movimento de natação 24, para dar uma medição quantitativa do comportamento locomotor. Devido ao movimento espontâneo de zebraflarvas ish após 3 dpf, não fomos capazes de realizar os ensaios de toque-evocar para medir a função muscular. Por outro lado, nós medimos o desempenho muscular durante um longo período por determinação da distância nadada por larvas do peixe às 6 dpf. Este teste, embora uma medida indirecta da função muscular, pode ser utilizada para identificar peixes que apresentem o desempenho muscular prejudicada 8 ou neurodegeneração 25,26. Este teste não só fornece uma medição análoga ao teste de 6 min, mas é também adequado para automatizado de alto rendimento em telas de drogas ou de mutagénese in vivo.

Ao longo da última década peixe-zebra tem sido cada vez mais usado para estudar a biologia das células musculares e doenças. O desenvolvimento rápido externo do embrião do peixe-zebra, juntamente com a sua clareza óptica, permite a visualização directa da formação de músculo, crescimento e função. O processo de desenvolvimento muscular é altamente conservada no peixe-zebra e isto permitiu a modelagem bem sucedida de uma gama de doenças musculares incluindo distrofias musculares e miopatias congénitas 1-8. A análise detalhada dos modelos de peixe-zebra tem não só proporciona novos insights sobre a pathobiology destas condições, mas também proporcionou uma plataforma para o teste de terapias adequadas 6,9-13. A análise de modelos de peixe-zebra de doenças musculares depende de ensaios confiáveis ​​e reprodutíveis para medir o desempenho muscular. Estudos anteriores já haviam medido com sucesso a capacidade de geração de força do músculo tronco peixe-zebra em peixes entre 3 e 7 dpf porestimular eletricamente contração de um peixe do imobilizado ligado a um sistema de forças de transdução de 14. Isto pode fornecer medições detalhadas de força, mas não são ideais para experimentos de rendimento mais elevados e há vantagens para medir o desempenho muscular durante a natação. Às 2 dpf muscular peixe-zebra é totalmente funcional e os peixes podem provocar movimentos explosão de natação em resposta a estímulos. O ensaio de resposta de fuga toque-evocar é usado para medir a aceleração durante um movimento de ruptura natação, que pode ser usado como uma medida da força contráctil. Uma das medidas mais utilizadas da função muscular em pacientes com miopatia é o teste de caminhada de 6 min, que registra a distância total percorrida em uma superfície plana e dura 15,16. Nós aplicamos um teste semelhante para medir a função muscular em 6 dpf larvas do peixe, que nos monitorar a distância total nadado, eo número total de movimentos realizados por cada larva por um período de 10 min. Esta é realizadausando um sistema de seguimento automático, que permite medições fiáveis ​​e de alto rendimento de desempenho muscular. Ambos os testes musculares são altamente reprodutíveis e têm sido usados para quantificar as diferenças no desempenho muscular em modelos miopatia zebrafish 8.

<table><tbody><tr><td>21 G x 1&#039; Blunt Needle</td><td>Terumo/Admiral Medical Supplies</td><td>TE2125</td><td></td></tr><tr><td>48-well plates</td><td>Sigma</td><td>M8937</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri Dishes</td><td>Pacific Laboratory Products PT</td><td>S90001</td><td></td></tr><tr><td>High Speed Camera</td><td>Baumer</td><td>HXC20</td><td></td></tr><tr><td>http://www.randomization.com</td><td>N/A</td><td></td><td>Steps 1.1.2, 2.1.3</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TEI-43L</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Pipette</td><td>VWR</td><td>16001-188</td><td></td></tr><tr><td>StreamPix5</td><td>NorPix</td><td></td><td>Step 1.2.3</td></tr><tr><td>Temperature Control Unit</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 8</td><td>ProSciTech</td><td>T04-821</td><td></td></tr><tr><td>Zebrabox System</td><td>Viewpoint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint</td><td></td><td>Steps 1.3.1, 2.2.1</td></tr></tbody></table>

using touch-evoked response and locomotion assays to assess muscle performance and function in zebrafish

desenvolvimento muscular Zebrafish é altamente conservada com sistemas de mamíferos, tornando-os um excelente modelo para estudar a função muscular e doença. Muitas miopatias que afetam a função do músculo esquelético pode ser rápida e facilmente avaliada no peixe-zebra ao longo dos primeiros dias da embriogênese. Por 24 horas pós-fertilização (hpf), wildtype peixe-zebra espontaneamente contrair seus músculos da cauda e em 48 hpf, comportamentos de natação controlada apresentam peixe-zebra. Redução na frequência de, ou outras alterações nos, esses movimentos podem indicar uma disfunção do músculo esquelético. Para analisar o comportamento de natação e avaliar o desempenho muscular no desenvolvimento do peixe-zebra no início, nós utilizamos ambos os ensaios de resposta e locomoção de fuga evocada pelo toque. ensaios de resposta de fuga evocada-Touch pode ser usado para avaliar o desempenho muscular durante os movimentos de ruptura curtas resultantes da contração das fibras musculares de contração rápida. Em resposta a um estímulo externo, o qual neste caso é uma torneira decabeça, peixe-zebra tipo selvagem em 2 dias pós-fertilização (DPF) normalmente exibem um poderoso mergulho explosão, acompanhada de curvas fechadas. O nosso método quantifica a função do músculo esquelético através da medição da aceleração máxima durante um movimento de ruptura natação, a aceleração sendo directamente proporcional à força produzida pela contração muscular. Em contraste, os testes de locomoção durante o desenvolvimento das larvas de peixe-zebra cedo são utilizados para avaliar o desempenho muscular durante períodos prolongados de actividade muscular. Usando um sistema de rastreamento para monitorar o comportamento de natação, obtém-se um cálculo automatizado da frequência de atividade e distância em 6 dias zebrafish de idade, reflexo de sua função do músculo esquelético. As medições de desempenho natação são valiosas para a avaliação fenotipica de modelos de doenças e de rastreio de alto rendimento de mutações ou tratamentos químicos que afectam a função do músculo esquelético.

Toque evocado ensaio de resposta pode ser utilizado para determinar a velocidade e aceleração dos movimentos de natação que é uma medida proporcional da força muscular. Em resposta a um estímulo mecânico, tal como uma pequena batida na cabeça 2 dpf tipo selvagem exibem zebrafish uma ação de natação rápida. Vídeos foram capturadas e analisadas por dois diferentes modelos de peixe-zebra: miopatia Tg (ACTA1 D286G -eGFP), um modelo de miopatia nemalínica que tem sido mostrado ter a fraqueza muscular significativa, e um modelo de distrofia muscular de Duchenne onde defeitos musculares graves têm sido descrito a 5 dpf 19,20. Imagens de um vídeo de um toque típico evocado ensaio estão representados na Figura 1A. Aceleração do peixe-zebra foi examinado e considerado de pico no primeiro 0,2 seg da resposta estouro natação escape (Figura 1B). Esta aceleração máxima pico fornece uma medida que é proporcional à força generating capacidade do músculo esquelético. Os valores máximos de aceleração-se a média para se obter um valor máximo de aceleração média (± erro padrão da média) para cada estirpe: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): média = 276,0 ± 28,8 m / s 2, n = 3 experiências independentes em duplicado que compreende 15 peixes individual; controle de tipo selvagem: média = 500,8 ± 50,28 m / s 2, n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 15 peixes individual; DMD PC2 - / - mutante: média = 249,9 ± 19,1 m / s 2, n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 12-19 peixes individual; DMD PC2 +/- heterozigotos: média = 235,9 ± 8,7 m / s 2, n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 16-27 peixes individuais; DMD homozigotos PC2 + / + de tipo selvagem: média = 230,9 ± 8,7 m / s 2, n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 8-27 peixes individuais (Figura 1C). Como esperado, a Tg (D286 ACTA1G -eGFP) peixes foram encontrados para ter uma diminuição significativa na aceleração máxima indicando a função muscular reduzida, o que é consistente com modelos de ratos e os dados dos pacientes 8,21,22. O PC2 DMD - / - peixes mutantes no entanto, não mostrou diferença em aceleração máxima, a 2 dpf, consistente com a detecção de defeitos musculares de 3 dpf 20 (Figura 1D). Os ensaios foram realizados de locomoção em 6 dpf para determinar a actividade e nadado distância por estirpes de peixes-zebra como uma indicação do desempenho muscular. Após o teste, uma representação em diagrama dos movimentos de natação ao longo do período de teste de dez minutos foi gerado, com linhas vermelhas e verdes representam períodos de movimento lento e rápido, respectivamente, e as linhas pretas representam períodos de inactividade (Figura 2). Individual wildtype alta atividade show de peixe-zebra com relativamente sem períodos de inactividade como opposed para Tg (ACTA1 D286G -eGFP) de peixe, que são menos ativas durante o período de testes (Figura 2B). O comportamento de natação foi quantificada calculando a média dos valores individuais do número de movimentos ea nadado distância por cada peixe (Figura 3). Ambos, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) peixe (Figura 3A e 3B) e DMD PC2 - / - peixe mutante (Figura 3C e 3D) foram encontrados para ter uma diminuição significativa no número médio de movimentos e nadado distância em relação ao seu respectivo controles: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fish: número médio de movimentos = 94,3 ± 13,6, meio distância nadada = 112,9 ± 18,4 mm, de n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 45 peixes; controles de tipo selvagem: número médio de movimentos = 177,4 ± 14,0, média distância nadada = 300,2 ± 22,8 mm, de n = 3 r independenteexperimentos eplicate que compreendem 45 peixes; DMD PC2 - / - mutante: número médio de movimentos = 163,3 ± 30,0, média distância nadada: 298,4 ± 60,37 mm n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 12-20 peixes; DMD PC2 +/- heterozigotos: número médio de movimentos = 362,3 ± 38,8, média distância nadada: 660,3 ± 86,1 milímetros n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 17-27 peixes; DMD homozigotos PC2 + / + de tipo selvagem: número médio de movimentos = 341,9 ± 91,6, média distância nadada = 574,3 ± 170,9 milímetros n = 3 experiências duplicadas independentes que compreendem 8-25 peixe. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig1.jpg" /> Figura 1:. Quantificação de touch-evocar ensaio de resposta de 2 dpf embriões de peixe-zebra imagens (A) instantâneo de um peixe-zebra controle durante touch-evocar ensaios de 2 dpf. (B) perfil de aceleração para o primeiro 0,2 seg de umúnica Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (vermelho) e peixe-zebra de controle único (azul) após a aplicação do estímulo táctil. A aceleração máxima é representado pelas linhas a tracejado. (C, D) Quantificação da aceleração máxima (m / s 2) gravada a partir de ensaios de resposta evocada pelo toque de (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) e peixe-zebra (D) PC2 DMD - / - peixes mutantes em relação ao controle de peixe-zebra em 2 dpf. As barras de erro representam ± SEM por 3 experiências duplicadas, * p &lt;0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig2.jpg" /> Figura 2:. Representação de ensaios de locomoção para embriões de peixe-zebra (A) Zebrafish embriões são colocados em placas de 48 poços e locomoção é gravado a partir de cima utilizando uma câmara digital infravermelho. (B) Esquema de circulação peixe-zebra durante o período de testes com linhas vermelhas representando movimentos rápidos, linhas verdes que descrevem movimentos lentos e linhas pretas que descrevem inatividade (como determinado pelos limiares de detecção inseridos no software). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54431/54431fig3.jpg" /> Figura 3:. Quantificação dos ensaios de locomoção para 6 dpf larvas do peixe Quantificação do (A) número de movimentos e (B) distância percorrida pelo Tg peixe-zebra (ACTA1 D286G -eGFP) em relação ao controle de peixe-zebra em 6 dpf.Quantificação do número (C) dos movimentos e (D) distância percorrida pela DMD PC2 - / - peixes mutantes em relação ao controle de peixe-zebra em 6 dpf. As barras de erro representam ± SEM por 3 experiências duplicadas, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54431/54431fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

using-touch-evoked-response-locomotion-assays-to-assess-muscle

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.7K visualizações.  Monash University. Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function. 

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Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Biologia

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Assessment of Swim Endurance and Swim Behavior in Adult Zebrafish

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. Following complete transection of their spinal cord, zebrafish extend glial and axonal bridges across severed tissue, regenerate neurons proximal to the lesion, and regain their swim capacities within 8 weeks of injury. Recovery of swim function is thus a central readout for functional spinal cord repair. Here, we describe a set of behavioral assays to quantify zebrafish motor capacity inside an enclosed swim tunnel. The goal of these methods is to provide quantifiable measurements of swim endurance and swim behavior in adult zebrafish. For swim endurance, zebrafish are subjected to a constantly increasing water current velocity until exhaustion, and time at exhaustion is reported. For swim behavior assessment, zebrafish are subjected to low current velocities and swim videos are captured with a dorsal view of the fish. Percent activity, burst frequency, and time spent against the water current provide quantifiable readouts of swim behavior. We quantified swim endurance and swim behavior in wild-type zebrafish before injury and after spinal cord transection. We found that zebrafish lose swim function after spinal cord transection and gradually regain that capacity between 2 and 6 weeks post-injury. The methods described in this study could be applied to neurobehavioral, musculoskeletal, skeletal muscle regeneration, and neural regeneration studies in adult zebrafish.

Capable of functional recovery after spinal cord injury, adult zebrafish is a premier model system to elucidate innate mechanisms of neural regeneration. Here, we describe swim endurance and swim behavior assays as functional readouts of spinal cord regeneration.

Avaliação da resistência ao natação e comportamento de natação em zebrafish adulto

Due to their renowned regenerative capacity, adult zebrafish are a premier vertebrate model to interrogate mechanisms of innate spinal cord regeneration. ...

Neurociência

Ensaio de Sobressalto para Avaliação de Toxicidade em Embrião de Peixe-Zebra

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

Autor em destaque: Triagem de toxicidade de alto rendimento usando ensaio de resposta de sobressalto de embrião de peixe-zebra

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.

Avaliando a toxicidade de produtos químicos usando um sistema de triagem de resposta de sobressalto de vibração de peixe-zebra

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

Usando resposta ao toque evocadas e locomoção Os ensaios para avaliar o desempenho muscular e funcional de Zebrafish

Resumo

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