Nós gostaríamos de agradecer Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan para discussões úteis. Agradecemos também Priya Begani de assistência durante as filmagens. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 AI071727 (para AO) e R01 GM110052 (a SLV).

Dia 1: Expressão de mordaça proteínas utilizando a transcrição in vitro-translation sistema baseado em Lysate germe de trigo 1. Preparação do HIV-1 Gag <ol><li> Remove todos os reagentes do kit comercial CECF de gérmen de trigo a partir de congeladores (lisados ​​de gérmen de trigo são armazenadas a -80 ° C; outros reagentes, a -20 ºC). Descongelar-los em gelo e misturar os componentes como apresentados na Tabela 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (alimentação mix) </td><td></td></tr><tr><td> solução de alimentação </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1.000 l </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mistura-2 (Lisado mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> lisados ​​de gérmen de trigo </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNase água livre </td><td> 7 ul </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> O DNA de plasmídeo em tampão TE (1 ug / uL) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> tampão de reacção </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composições de misturas necessárias para reacções de gérmen de trigo. Nota: Se o experimento foi concebido para examinar o efeito da remoção de ARN por ARNase de Gag de ligação à membrana, substituir inibidores de ribonuclease com água sem RNase. O DNA de plasmídeo deve ser livre de impurezas de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, plasmids preparados utilizando técnicas convencionais, mas não, kits de isolamento de plasmídeos endotoxina-livres têm sido utilizados com sucesso. instruções do fabricante também recomenda o uso de DNA dissolvido em água livre de nuclease. Se utilizando ADN suspensas em TE [Tris-HCl a 10 (pH 7,4) contendo EDTA 1 mM], evitar a utilização de concentrações mais baixas de ADN, uma vez que o EDTA em TE pode afectar o rendimento. Os plasmídeos dissolvido em tampão TE a uma gama de concentrações de 0,8-1 mg / mL foram utilizadas com sucesso. <ol start="2"><li> Primeiro adicione a mistura de alimentação (Mix-1) na cassete de reacção (câmara transparente). Em seguida, adicione a mistura de lisado (Mix-2) para a outra câmara (vermelho). Não introduzir bolhas ao adicionar as misturas nas suas respectivas câmaras, uma vez que podem conduzir a troca ineficaz dos componentes da solução e, portanto, reduzir a eficiência da reacção. </li><li> Cobrir as câmaras com a película adesiva fornecida com o kit. </li><li> Insira a cassete de reação no compartimento de cassete e incubate o conjunto durante 24 horas a 24 ° C a uma velocidade de agitação constante de 900 rpm num Eppendorf Thermomixer R. </li></ol> Dia 2: Preparar GUVs por eletroformação e colheita de germe de trigo Lysates 2. Preparação de GUVs <ol><li> Alíquotas lípidos dissolvidos em solventes inorgânicos tais como o clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol em frascos de vidro com tampas de rosca forrada com forros de teflon e embrulhados com parafilme. Lidar com lipídios com seringas de vidro Hamilton-tipo, ou se disponível, pontas de plástico de clorofórmio-resistente. Retire os frascos de vidro contendo lípidos para ser usado para preparação de GUV a -20 ºC congelador. <ol><li> Uma vez que os frascos são equilibrados até à temperatura ambiente, certifique-se por inspecção visual que as suspensões lipídicas são claras. A qualidade de lípidos, em particular lípidos ácidos, tais como fosfatidilserina palmitoil-oleoil (POP) e PI (4,5) P 2, é importante para experiências bem sucedidas. Não use lipídios que sãoem alíquotas durante mais de 2 meses. </li></ol></li><li> Pré-aquecer num bloco de aquecimento para a temperatura desejada. Esta temperatura deve ser de pelo menos 5 ° C superior à temperatura de fusão (Tm) do lípido (s) com a mais elevada Tm. </li><li> Calcular os volumes de lípidos necessários de acordo com os rácios molares desejados de lípidos. Para estudar o HIV-1 Gag de ligação aqui, utilizar as seguintes razões molares como mostrado na Tabela 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mistura de lípidos </td><td> razão molar </td><td> Volume (em mL) </td><td> da concentração </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P 2: 1 mg / mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Volumes de diferentes lipídios utilizada para obter GUVs. <ol start="4"><li> Adicione os volumes desejados de lípidos em um frasco de vidro com tampa de rosca limpo. </li><li> Lâminas de dimensões 25 x 50 x 1,1 mm3 e resistência 70-100 co (como descritos no catálogo) Uso de ITO revestido. Coloque duas lâminas ITO-revestidos de uma bancada limpa. Cada câmara eletroformação requer dois-tin-óxido de índio (ITO) lâminas de vidro -Revestido. Verificar que o lado condutora da lâmina de vidro é virada para cima, verificando a resistência utilizando um multímetro. Ele deve mostrar um valor de cerca de 200 Ω. Certifique-se a superfície das lâminas são limpos, limpando suavemente com 70% de etanol usando toalhetes sem fiapos. </li><li> Limpar a superfície exterior de uma agulha de uma seringa por RInsing com clorofórmio e colocar a seringa no bloco de calor. </li><li> Colocar uma nova lâmina de vidro revestido de ITO-no bloco de calor com o lado voltado para cima condutora e permitir que ele para equilibrar até à temperatura desejada geralmente cerca de 2-3 min. Não reutilize as lâminas de vidro ITO-revestidos para um risco potencial que o ITO-revestimento nas lâminas de vidro pode ser danificado durante procedimentos de limpeza. </li><li> Use um volume de 40-50 mL da mistura de lípidos para cada slide para uniforme e ainda rápida divulgação dos lipídios sobre a lâmina de vidro. Ajustar o volume total com um solvente orgânico apropriado tal como clorofórmio. <ol><li> Coloque uma metade do volume total da mistura de lípidos na lâmina de vidro e espalhou imediatamente o lípido usando a seringa limpa (passo 2.6) para dar uma película lipidica uniforme (movendo a agulha 2-3 vezes em toda a corrediça). Espalhe o filme lipídico gentilmente (mas rapidamente) para evitar qualquer dano ao revestimento ITO fina. Não uniforme difundir ou espalhar áspera pode levar a sub-óptimarendimentos ou heterogeneidade computacional de GUVs. </li><li> Portanto, certifique-se disseminação uniforme inspecionando o filme lipídico após espalhar antes de prosseguir para a próxima etapa. Se a opacidade do filme parece excessivamente não uniforme, refazer o procedimento usando uma nova lâmina. </li></ol></li><li> Colocar a lâmina revestido dentro de um prato de Petri com o lado revestido voltado para cima. </li><li> Repita os passos de 2,6-2,9 para o resto da mistura utilizando uma outra lâmina de ITO revestido. </li><li> Colocar a placa de petri contendo ambos os diapositivos numa câmara de vácuo convencional dessecação durante 60-90 minutos para remover quaisquer vestígios de solventes orgânicos. </li><li> Durante este processo, definido na incubadora para a mesma temperatura que a do bloco de aquecimento (65 ° C na maior parte dos casos) e pré-aquecer a 300 mM de uma solução de sacarose na incubadora. </li><li> Após a secagem, trazer o prato de petri para o banco e colocar a lâmina de vidro sobre uma superfície limpa. </li><li> Suavemente limpar uma junta de PDMS (Figura 1) usando 70% de etanol e seca-lo completely. </li><li> Colocá-lo sobre a lâmina de vidro revestida de lípido, como mostrado na Figura 1 e suavemente e pressione firmemente de modo a que as formas de vedação uma vedação estanque à água. Confirmar a ausência de lacunas entre a junta PDMS eo slide. Isto resulta na formação de uma câmara superficial que contém a solução de sacarose. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figura 1:. O layout da lâmina de vidro ITO revestido usado para eletroformação <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="16"><li> Encha a câmara com solução de sacarose pré-aquecido, sem quaisquer bolhas. </li><li> Coloque a outra lâmina revestida em cima para fazer um selo apertado. Certifique-se que não há bolhas. A montagem final deve aparecer como mostrado na Figura 2. Aperte o usin câmaraclips g Binder. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figura 2:. Representação esquemática da câmara de eletroformação (vista lateral) <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="18"><li> Retire o excesso de sacarose por aspiração e limpar os slides usando toalhetes sem fiapos. Apertem os slides para a barra de cobre para que os lados condutores estão em contato uniforme com a barra. Certifique-se de que apenas um lado condutor da placa de vidro está em contacto com uma barra de cobre. </li><li> Conectar-se a barra de cobre para a saída do gerador de função usando as garras jacaré. Coloque o conjunto dentro da incubadora para permitir que o conjunto para equilibrar com a temperatura desejada. </li><li> Aplique uma freqüência de onda senoidal de 10 Hz e uma diferença de potencial de 1 V por 90 min. assegue que a tensão é 1 V por um multímetro conforme mostrado na Figura 3. Continuar o processo durante 90 min. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figura 3:. As posições em que os eléctrodos do multímetro são colocados para medir a frequência e corrente <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="21"><li> Após 90 min, lentamente diminuir a frequência de 2 Hz e continuar eletroformação durante mais 10 min. Durante este tempo, a colheita em reacções de tradução in vitro (passos 3,1-3,2). </li><li> Desligue o gerador de função e permitir que o conjunto arrefecer lentamente à temperatura ambiente (desligando a incubadora e deixando a porta da incubadora ligeiramente aberta). </li><li> Após o resfriamento, desconecte os cabos do geradordos conjuntos deslizantes. GUVs pode ser muito frágil e, portanto, precisa ser manuseado com muito cuidado. trazer cuidadosamente o conjunto para o banco. </li><li> Desmonte a câmara, removendo suavemente o cursor superior usando uma pinça. Colheita das suspensões contendo GUVs sacarose utilizando uma ponta ul corte 1.000 e transferir para um tubo limpo. Lidar com o tubo suavemente para evitar a interrupção de GUVs. </li><li> Use as GUVs imediatamente. GUVs são estáveis ​​durante pelo menos 90 minutos após a colheita, quando armazenados à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Reacções colheita tradução in vitro <ol><li> Colher as reacções de tradução in vitro contendo proteínas desejadas a partir da câmara de vermelho utilizando uma micropipeta para um tubo. </li><li> Para remover proteínas agregadas, girar os lisados ​​a 16200 xg durante 15 min numa centrífuga de mesa e transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. </li></ol> 4. ensaio de ligação GUV <ol><li> Usando uma ponta de corte, misturar 51; l de reacções de tradução in vitro contendo proteínas traduzidas e 5 ul de GUVs em um tubo e incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Anexar uma folha de PDMS com um pequeno furo (3-4 mm de diâmetro) em uma lamela limpa e garantir a vedação estanque, pressionando-o suavemente e firmemente contra a lamela. </li><li> Coloque a mistura de 10 ul a partir do passo 4.1 no pequeno orifício. </li><li> Imagem a mistura sob um microscópio de fluorescência invertido confocal de epi ou à temperatura ambiente. Nota: Para evitar a evaporação, a câmara de imagem pode ser coberto por uma lamela. </li></ol>

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We declare that we have no conflicting interests.

O ensaio de ligação GUV como descrito acima fornece uma boa alternativa em situações onde outros ensaios de interação proteína-lipídica têm as suas limitações. Este ensaio nos permite examinar as interações entre ácido mirístico Gag de corpo inteiro e lipídios ácidos com cadeias acilo de comprimento nativa no contexto bicamada lipídica e fazê-lo sem longas centrifugação flotação por meio de alta densidade gradientes de sacarose ou outro processamento pós-obrigatório de Gag-lipídico complexos. O...

vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é um vírus com envelope que monta a e gomos a partir da membrana plasmática (PM) na maior parte dos tipos de células. A montagem do HIV-1 partículas de vírus é conduzida por a proteína de núcleo virai de 55 kDa chamado Pr55 Gag (GAG). Gag é sintetizado como um precursor de poliproteina composto por quatro domínios estruturais principais, isto é, matriz, da cápside, nucleocápside, e P6, bem como dois péptidos espaçadores SP1 e SP2. Durante a montagem, o (MA) de domínio matriz é responsável pelo direcionamento de mordaça para o local de montagem, o capsídeo (CA) de domínio medeia interações-Gag Gag, o (NC) de domínio nucleocï¿½side recruta RNA genômico viral, e fatores do hospedeiro p6 recrutas que auxiliam vírus cisão de partícula a partir da membrana plasmática. Gag também sofre uma modificação co-translacional pela adição de um ácido gordo de 14 carbonos ou radical miristato na sua extremidade N-terminal. ligação de Gag membrana é um requisito essencial para a montagem viral, uma vez que mutants que são defeituosos na ligação à membrana não produzem partículas virais. Nós e outros autores mostraram que a ligação de gag é mediada por sinais bipartidos dentro do domínio MA membrana: a porção miristato de N-terminal que medeia interacções hidrófobas com a bicamada lipídica e um aglomerado de resíduos básicos dentro do domínio MA denominado como região altamente básica ( HBR) que interage com lípidos ácidas sobre o PM 1-4. Estudos de gag-membrana interacções utilizando a expressão ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), uma enzima que catalisa a hidrólise do fosfolípido phosphatidylinositol- ácida PM-específico (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, em células sugeriram que Gag-AM localização é mediada por PI (4,5) P 2 3,5. No entanto, estudos in vitro visando a entender mais detalhes mecanicistas de Gag-PI (4,5) P 2 interações têm provado ser um desafio para um número de razões. Paraexemplo, a purificação de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 por experiências bioquímicas tem sido tecnicamente difícil, pelo menos em parte, devido à tendência de Gag para agregar durante a purificação. Assim, as formas truncadas de HIV-1 da mordaça, tais como Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou a forma não-miristoiladas têm sido frequentemente utilizada em estudos que necessitam de purificação da mordaça (por exemplo, ressonância magnética nuclear, a pegada de proteína, e a superfície ressonância de plasma de 6-9). Alternativamente, acoplados em reacções de transcrição-tradução in vitro têm sido utilizados para produzir de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 em outros estudos bioquímicos 1,2. Tipicamente neste sistema, um plasmídeo Gag-codificação é transcrita e traduzida com lisados ​​de células eucarióticas (por exemplo, os lisados ​​de reticulócitos de coelho) que são desprovidas de quaisquer membranas celulares e RNAs mensageiros mas contêm os mecanismos de transcrição e tradução. Após a reacção, os lisados ​​de células que contêm gag são misturados com membranes para análise das interações da mordaça com lipídios. Além da facilidade de preparação de comprimento completo miristoilada Gag, os métodos que utilizam o sistema de tradução in vitro de transcrição têm uma vantagem que a síntese de gag e reacções de ligação à membrana posterior ocorrer num meio &#39;eucariótica citosol-like &quot;, que podem representar melhor as condições fisiológicas. Esta propriedade contribuiu para os estudos que mostraram que as moléculas de RNA ligadas ao domínio MA regular Gag ligação a lípidos ácidas de forma competitiva 1,2,10-12. No entanto, uma vez que a quantidade total de proteínas Gag obtidos nestes lisados ​​de células não são elevadas, a marcação metabólica das proteínas com aminoácidos marcados radioactivamente é necessário para a sua detecção. Dependendo do método para medir as interações Gag-lípidos, têm sido utilizados uma variedade de preparações de membrana. Cada um desses métodos tem seus pontos fortes e limitações. A maioria dos ensaios baseados-RMN requerem a utilização de lípidos com acilo curtocadeias que são solúveis em água (por exemplo, C4-C8-e PI (4,5) P 2) 6,8. Enquanto os métodos de RMN de teste de ligação de Gag aos lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento encontradas nas células estão a ser desenvolvidos, eles foram usados ​​apenas com MA com ácido mirístico ou nonmyristoylated, até agora, 8,13. Em alternativa, os lipossomas preparados a partir de lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento nativos têm sido utilizados em métodos bioquímicos, tais como lipossomas ou flotação fluorescente talão lipossoma ensaios de ligação 2,3,10,14-16. No entanto, os lipossomas utilizados nestes ensaios têm pequenos diâmetros, e, assim, as suas membranas têm curvaturas acentuadas e positivos. Em contraste, durante a fase inicial de montagem de partículas em células de VIH-1 infectados, Gag se liga ao PM, que é praticamente planar na escala de Gag, e, subsequentemente, induz curvatura negativa durante a floração. Portanto, as membranas de lipossomas com curvatura acentuada e positivo pode não ser bicamadas lipídicas ideais para estudar as interações da mordaça-lipídico. Quanto Flot lipossomaensaios ation, outra ressalva potencial é que a exposição de complexos Gag-lipídicas para gradiente de sacarose hipertônica durante a centrifugação pode afetar o resultado experimental. Para atenuar estas limitações e proporcionar um sistema experimental complementar, para ensaios de ligação a GAG de gigantes vesículas unilamelares (GUVs) têm sido desenvolvidos nos últimos anos. GUVs são vesículas única bicamada lipídica cujos diâmetros se estendem a várias dezenas de micrómetros. Assim, a curvatura destas membranas se assemelha a PM na escala de Gag. Além disso, devido ao seu grande tamanho, que permite a inspeção visual sob microscópios ópticos, ligação à membrana proteínas da mordaça de fluorescência marcados ou rotulados com essas vesículas após a mistura pode ser facilmente determinada sem tratamento posterior dos complexos Gag-lipídicas. Nós aqui descrevemos um protocolo para estudar HIV-1 Gag membrana ligação usando GUVs obtidos a partir de um método eletroformação. Vários métodos, tais como a hidratação suave, hidratação assistida-gel, microfonerofluidic de jacto, e eletroformação 17-22 têm sido usados ​​para obter GUVs. Para o protocolo aqui descrito, o método da eletroformação é utilizado principalmente devido à sua eficiência na formação GUVs lípidos com ácidos e a sua relativa facilidade de utilização, sem a necessidade de instalações dispendiosas. Uma vez que a visualização de Gag necessita de um repórter fluorescente, amarela proteína fluorescente (YFP) está geneticamente adicionado ao C-terminal de Gag (gag-YFP). Proteínas gag-YFP são obtidos por reacções de transcrição in vitro e tradução em lisados ​​de gérmen de trigo com base na tecnologia contínua de permuta de fluxo contínuo (CECF). Nesta tecnologia, tanto a remoção de produtos secundários inibidores das reacções e fornecimento de substratos de reacção e componentes de energia são alcançados de um mecanismo baseado em diálise. Para estas reacções, é usado um plasmídeo que codifica Gag-YFP sob o controlo de um promotor de T7. É de notar, como mostrado anteriormente, lisados ​​de gérmen de trigo apoiar miristoilaï¿½o sem componentes adicionais 23,24. Usando este método, foi possível obter quantidades suficientes de comprimento completo miristoilada Gag-YFP para visualização de Gag em membranas GUV 24. Aqui nós descrevemos o protocolo com a qual o HIV-1 Gag ligação a PI (4,5) P 2 molecular contendo membranas GUV podem ser examinados sem processamento subsequente longa seguinte reacções de ligação e propor que este método complementa preexistente Gag-membrana ensaios de ligação e pode ser estendido para entender melhor o HIV-1 Gag-membrana vinculativo.

<table><tbody><tr><td>Digital Multimeter</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.</td></tr><tr><td>ITO coated glass slides</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Gauge 22S, Syringe number 702</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td><td>BiotechRabbit,&lt;br/&gt; Berlin, Germany</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&amp;nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&amp;nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Brain-PI(4,5)P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

A proteína estrutural do VIH-1, Pr55 da mordaça (ou GAG), liga-se à membrana plasmática em células durante o processo de montagem do vírus. ligação de Gag membrana é um passo essencial para a formação de partículas de vírus, uma vez que um defeito no resultado de ligação à membrana da mordaça em grave comprometimento da produção de partículas virais. Para obter detalhes mecanísticos de interacções da membrana Gag-lipídicos, e métodos in vitro com base em RMN, a pegada de proteína, ressonância de plasma de superfície, a centrifugação dos lipossomas de flutuação, ou grânulo fluorescência ligação de lípidos têm sido desenvolvidos até agora. No entanto, cada um destes métodos in vitro tem as suas limitações. Para ultrapassar algumas destas limitações e proporcionar uma abordagem complementar com os métodos previamente estabelecidos, foi desenvolvido um ensaio in vitro em que as interacções entre o HIV-1 gag e membranas lipídicas ter lugar num ambiente de &quot;célula-like&quot;. Neste ensaio, Gag ligação a membranas lipídicas é visualmente analisadas usando-YFP Tagged Gag sintetizado em um germe de trigo baseada no sistema de tradução in vitro e GUVs preparados por uma técnica da eletroformação. Aqui nós descrevemos os antecedentes e os protocolos para obtenção de proteínas da mordaça completos com ácido mirístico e membranas GUV necessárias para o ensaio e para detectar Gag-GUV ligação por microscopia.

<html> Usando o protocolo acima, preparamos GUVs compostos por POPC + + POPS Chol (razão molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composição foi escolhida para aproximadamente reflectir as concentrações de colesterol e de PS PM. Robusto e eficiente ligação de Gag foi observada somente quando o cérebro-PI (4,5) P 2 foi incluída na mistura POPC + POPS + Chol-PI cerebral (4,5) P 2 [razão molar (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1], neste exemplo) (Figura 4, ...

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K visualizações.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Imunologia e Infecção

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Biologia

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma membrane and the numerous factors that influence protein behavior in live cells. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are a biomimetic and highly tunable in vitro model system for investigating protein-membrane interactions and probing protein behavior in a precise, stimulus-dependent manner. In this protocol, we present an inexpensive and effective method for fabricating GUVs with the human serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stably integrated in the membrane. We fabricate GUVs using a modified hydrogel swelling method; by depositing a lipid film on top of a mixture of agarose and 5-HT1AR and then hydrating the entire system, vesicles can be formed with properly oriented and functional 5-HT1AR incorporated into the membrane. These GUVs can then be used to examine protein-membrane interactions and localization behavior via microscopy. Ultimately, this protocol can advance our understanding of the functionality of integral membrane proteins, providing profound physiological insight.

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

This protocol utilizes agarose swelling as a powerful and generalizable technique for incorporating integral membrane proteins (IMPs) into giant unilamellar lipid vesicles (GUVs), as described here for the reconstitution of the human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), one of the classes of pharmacologically important G protein-coupled receptors.

Construção de membranas lipídicas modelo incorporando receptores acoplados de proteína G (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

Bioengenharia

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Puxando a membrana nanotubos de vesículas Unilamellar gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

Imagem de fluorescência multiplexada de célula única para visualizar ácidos nucleicos virais e proteínas e monitorar HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus e Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...