Name: glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation
Uploaded: 2016-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
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C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Todos os procedimentos que utilizam indivíduos animais têm sido de acordo com as normas do Institute of Animal Care e Use Committee (IACUC) na Western Michigan University. 1. Os animais <ol><li> Utilizar ratos do sexo masculino e feminino de 3 meses de idade no presente estudo. </li><li> Manter os animais em um 12 hr ciclo de luz / escuro, com livre acesso a comida e água. </li></ol> 2. Preparação de KAX Cocktail para anestesia animal <ol><li> Dissolve-se 50 mg de xilazina (20 mg / ml) em 5 ml de cetamina (100 mg / ml) com 1 ml de acepromazina (10 mg / ml) e 3 ml de água destilada. Homogeneizar. </li><li> Esterilizar com um filtro de seringa e armazenar desta solução para um frasco de soro de 10 ml. </li></ol> 3. Injeção KAX <ol><li> Pesar animais (g) e de regresso ao compartimento até que esteja pronto para a injecção. </li><li> Injectar 0,1 mL KAX / 100 g de peso corporal do animal intraperitonealmente, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml com uma agulha de 28 g. </li><li> Permitirpara animal a ficar inconsciente. Verifique reflexos por beliscar os pés e cauda. </li><li> Mantenha todos os animais de forma segura em laboratório para a duração da cirurgia. </li><li> Pós-cirurgia, substituir animais em suas jaulas e manter confortável em RT até que a consciência é recuperada. retornar apenas animais para a instalação de animal quando os animais despertar e retomar o comportamento normal. </li></ol> 4. Preparação para a cirurgia e Montagem Microneedle <ol><li> Adicione uma solução 2 M de NaCl estéril. </li><li> Use um extrator de microeletrodos (Figura 1C) para puxar um diâmetro interno de 0,86 mm padrão polido pesado e fino tubo de borosilicato murada em duas microagulhas de vidro finamente cônicos (Figura 1D, Figura 1E). </li><li> Backfill uma micro-agulha do passo anterior com 2 M de soro fisiológico usando uma agulha de seringa de aterro e uma seringa de 1 ml (Figura 1B). Toque as bolhas de ar a partir da ponta do eletrodo. </li><li> Encha uma segunda seringa de 1 ml com 2 MNaCl. Ligue uma agulha G 18 e, em seguida, anexar um comprimento (aproximadamente 10 polegadas) de tubo de polietileno (Figura 1A). Utilizar o êmbolo da seringa para encher o tubo de polietileno com uma solução salina através da agulha. </li><li> Quando tanto a micro-agulha e o tubo são cheios com uma solução salina, ligar cuidadosamente os dois. Eliminar qualquer ar na ligação entre os mesmos (figura 2). </li><li> Finamente bisel a ponta do microneedle raspando muito levemente contra o grão de uma toalha de papel claro. </li><li> Verificar a resistência da micro-agulha empurrando suavemente o êmbolo da seringa até um bom fluxo de líquido pode ser visto na toalha de papel. O fluxo de líquido não deve ser maior do que 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparação de animais <ol><li> Aplicar 1 - 2 gotas de anestésico tópico à córnea (Anestalcon Solução Oftálmica, USP, 0,5%). Espere até que não ocorra nenhum reflexo ocular. </li><li> Aparar bigodes com uma tesoura. </li><li> Saturate um aplicador de ponta de algodão com solução de betadine e área de cotonete ao redor do olho experimental. </li><li> Usando um microscópio, anexar uma pinça hemostática para apertar a pálpebra inferior a protuberância do olho, expor a veia episcleral e restringir o movimento dos olhos. (Figura 3, seta) </li></ol> 6. Injecção salina de indução de glaucoma <ol><li> Quando o conjunto de microagulhas eo animal são preparados, começam injeções. </li><li> Quando o animal está confirmado para ser insensível à pitada pés / cauda, ​​perfurar cuidadosamente a veia episcleral com a micro-agulha, vindo em um ângulo baixo entre 10 e 20 graus para a veia (Figura 3, seta branca). Um punção de sucesso na veia é aparente quando o sangue entra na ponta da micro-agulha (Figura 3, seta preta). </li><li> Lenta e manualmente injetar cerca de 50 salinas ul na veia. Isso deve levar cerca de 10 segundos. As veias vai branco blanch como o sal circula through a vasculatura (Figura 4, ponta de seta). Algumas regiões podem manter uma aparência vermelhas do sangue (Figura 4, seta). <ol><li> Executar uma segunda injecção na veia, do lado oposto ao local da primeira, para assegurar a completa danos na retina para a camada de células ganglionares da retina completa. Nota: Dentro de minutos, deve-se ver um aspecto turvo distinta através da íris do olho como o sal circula através do sistema vascular. </li></ol></li><li> Deixar o olho contralateral não tratado para ser utilizado como um controlo interno. </li></ol> 7. Recuperação de Animais <ol><li> Remover a pinça hemostática. </li><li> Use um aplicador de algodão para aplicar pomada antibiótica tripla (bacitracina de zinco, sulfato de neomicina, B sulfato de polymysin) para o site preso pela pinça hemostática e locais de injecção. danos nos tecidos ao redor dos olhos não ocorre usando a pinça hemostática. </li><li> &gt; Place anestesiados animais em suas jaulas em um cobertor água morna de circulação para prevhipotermia ent. Manter os animais sob observação até que a consciência eo comportamento normal são recuperou. Transporte de animais acordados para a colônia animal. Animais permanecem na colônia até o momento do sacrifício. </li></ol> 8. O Sacrifício de Animais e Retina Remoção <ol><li> Um mês após o procedimento para induzir glaucoma, os animais são sacrificados por asfixia com CO2 e punção torácica secundária. <ol><li> Colocar o animal na câmara e colocar a tampa em forma segura. </li><li> Abrir as válvulas CO 2 e regulador de gás para permitir volume de 20% / min de CO 2 deslocamento de oxigênio na câmara. </li><li> Permitir que quatro a cinco minutos para que o animal a expirar. </li><li> Desligue ambas as válvulas. </li><li> Remover animal a partir da câmara e realizar uma punção torácica secundária com um bisturi estéril. </li></ol></li><li> Após a eutanásia, usar um bisturi para cortar o tecido conjuntivo no interior da cavidade orbital em torno do olho, being cuidado para não cortar na própria globo ocular. </li><li> Cuidadosamente utilize uma tesoura para cortar borda curva do nervo óptico e qualquer tecido restante para extrair o globo ocular intacta. Coloque globo ocular extraído em um x 15 mm placa de Petri estéril 60 milímetros descartável contendo PBS fresco. </li><li> Faça um ocular do globo ocular. Para fazer isso, fazer uma pequena incisão com o bisturi apenas posterior à fronteira entre a íris e esclera. Seguir esta incisão em torno da circunferência do olho com uma tesoura pequena mola para remover o hemisfério da córnea do globo ocular. O hemisfério ligado ao nervo óptico permanece. </li><li> Encontre a retina muito fina rosa / bege dentro da ocular do animal sacrificados. Segurar a camada pigmentado da retina com uma pinça embotadas para estabilizar a ocular. Use outro par de pinças fechadas de provocar muito suavemente toda a retina intacta fora da parte posterior do olho. Evite beliscar, puxar, ou puxando a retina diretamente. </li><li> Use pequenas tesouras para cortar a molaa área onde o nervo óptico ainda está ligado à retina. </li><li> Certifique-se de cortar qualquer epitélio pigmentar residual ou tecido escleral da retina. </li><li> Usando uma pipeta de transferência, muito gentilmente transferir a retina isolado a um Sylgard limpo revestido 35 milímetros x 10 mm placa de Petri contendo PBS fresco. </li></ol> 9. Retina Preparação Whole-Mount <ol><li> Uma vez no prato Sylgard, utilize uma pinça e uma agulha de cacto para fixar a retina no lugar. Manter a camada de células ganglionares da retina para cima e para baixo do nervo óptico. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada. </li><li> Use pequenas tesouras para cortar a retina em quatro quadrantes, fazendo a forma de um trevo de quatro folhas irradiando a partir da cabeça do nervo óptico. </li><li> Pin os quadrantes da retina com agulhas de cactos adicionais para tornar a retina o mais plano possível withoUT alongamento (Figura 5). </li><li> Fixar as retinas fixados no prato Sylgard com 3 ml de paraformaldeído a 4% O / N à temperatura ambiente. </li></ol> 10. Coloração de anticorpos de Retina Nota: as retinas mancha fixas com anticorpos primários e secundários para a visualização de neurónios da retina (Figura 6). <ol><li> Lavar, retinas planas montadas fixas três vezes para 2 min cada em PBS. </li><li> Permeabilizar as retinas com 1% de Triton X-100 com soro bovino fetal a 1% em PBS durante 60 min. </li><li> Enxaguar retinas três vezes, 2 minutos cada, com PBS. </li><li> Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem. </li><li> Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem. </li><li> Incubar com 1% de Triton X-100 e soro fetal de bovino a 1% em PBS à temperatura ambiente durante 45 min. </li><li> Lavar duas vezes com 0,1% de Triton X-100 em PBS, 5 minutos por lavagem. </li><li> Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem. </li><li> Incubar cada retina em soro fetal bovino a 3 ml de 1% em PBScom rato purificada anti-rato CD90 / rato CD90.1 (diluição 1: 300) O / N à temperatura ambiente. </li><li> Lavar uma vez com retinas 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min. </li><li> Lavar duas vezes com PBS, 5 min por lavagem. </li><li> Incubar cada retina em 3 ml de PBS (sem FBS) com Alexa Fluor 594 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho secundário (1: 300) O / N à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as retinas com PBS liberalmente. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, remover cuidadosamente agulhas cacto da retina. </li><li> Gentilmente transferir retinas em lâminas de microscópio com uma pipeta de transferência. Certifique-se de manter a orientação com a camada de células ganglionares da retina de frente para o teto. forma hemisférica da retina é notável, mesmo após a fixação. A curvatura da retina vai enrolar para o tecto, quando a camada de células ganglionares da retina é na orientação desejada. </li><li> Absorve o excesso de PBS com Kimwipe ou outro material, tais absorvente. Tenha cuidado para não absorver a retina. </li><li> Adicione 5 gotas de ½ glicerol e ½ PBS em peso, como ammedia ONTAGEM. </li><li> Cubra retina com lamela, evitando bolhas de ar. </li><li> Seguro lamela usando clara polonês prego, cola, ou outro adesivo. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Este protocolo descreve um método de induzir condições de glaucoma semelhante em um modelo de rato in vivo em. Este procedimento utiliza uma injecção de solução salina hipertónica para induzir a formação de cicatrizes na malha trabecular 29, 32. O desenvolvimento de tecido de cicatriz oclui o escoamento do humor aquoso, que aumenta a pressão na câmara anterior. Com a diminuição da vazão e pressão construir, a lente suspensa por ligamentos elásticos empurra de volta para a câmara ví...

O glaucoma é um grupo de doenças dos olhos que afectam os neurónios da retina, em particular, as células ganglionares da retina 1-2. Os axónios dessas células convergem para tornar-se o nervo óptico que transporta a informação visual para o cérebro onde a visão é percebida. Danos para CGR e seus axónios, por conseguinte, provoca defeitos visuais. As principais características associadas a distúrbios de glaucoma são degeneração RGC e da morte, aumento da pressão intra-ocular (PIO) e escavação do disco óptico e atrofia. Estas características levam a perda de campo visual ou completa, cegueira irreversível. Atualmente, o glaucoma tem causado cegueira em 70 milhões de pessoas em todo o mundo 3. Como tal, é a terceira maior causa mundial de cegueira 4. O mecanismo exato da morte RGC em glaucoma permanece desconhecida. Muita investigação tem sido feito para desvendar o mistério. Sabe-se, no entanto, que o factor de risco primário de glaucoma é um aumento iN pressão intra-ocular devido à circulação irregular de humor aquoso (AH) na câmara anterior do olho. AH actua como um substituto transparente e incolor para o sangue na câmara anterior avascular do olho. Ela alimenta as células vizinhas, remove os resíduos segregadas a partir de processos metabólicos, transporta neurotransmissores, e permite a circulação de drogas e células inflamatórias dentro do olho durante estados patológicos 1. A manutenção da circulação de humor aquoso envolve o corpo ciliar e a malha trabecular. O humor aquoso é produzido pelo corpo ciliar. Em seguida, flui para a câmara anterior para manter a saúde geral do tecido ocular. 75-80% do fluxo de humor aquoso é segregado activamente através do epitélio ciliar não pigmentada, quando o fluido é filtrado através de três camadas de tecido esponjoso no músculo ciliar. As saídas de fluido através da malha trabecular e através do canal de Schlemm que apropriaçãos para o sistema sanguíneo 5 .A restantes 20 - 25% do escoamento ignora a malha trabecular e é passivamente segregada por ultrafiltração e a difusão através da via uveo-escleral. Esta via parece ser relativamente independente da pressão intra-ocular 1. Quando a produção de humor aquoso e saída estão fora de equilíbrio, a pressão aumenta dentro do olho. Como foi dito, este aumento na pressão intra-ocular é o principal factor de risco no desenvolvimento do glaucoma. Essa pressão faz com que dano para as camadas intrincadas de neurónios na retina na parte posterior do olho. Danos aos axônios de células ganglionares da retina do nervo óptico leva o cérebro a não receber mais informação visual precisa. Como resultado, a percepção de visão é perdida e pode ocorrer cegueira completa. Até à data, não existe cura para o glaucoma. Existem métodos de tratamento diferentes que visam principalmente para reduzir a pressão intra-ocular. Estes incluem tópicaclasses de medicamentos, tais como bloqueadores do receptor beta 1-adrenérgicos, ou análogos de prostaglandinas tópicos. Bloqueadores beta reduzem a pressão intra-ocular através da diminuição da produção de humor aquoso 7. Prostaglandinas funcionar para reduzir a pressão intra-ocular através do aumento da drenagem do humor aquoso 8-14. agonistas adrenérgicos alfa e inibidores da anidrase carbónica, também são utilizados como métodos de tratamento secundário. Alfa agonistas adrenérgicos aumentar a vazão através da via uveoscleral 15-17. Inibidores da anidrase carbónica reduzem a produção de AH por inibição enzimática 18. Muito mais procedimentos invasivos, também estão a ser usadas para tratar o glaucoma. Trabeculoplastia a laser é usado para aumentar a drenagem do humor aquoso a 19. Outra terapia cirúrgica, chamada trabeculectomia, cria um local de drenagem alternativa para filtrar AH quando a via trabecular tradicional está bloqueada 20-21. Estas opções de tratamento têm sido conhecida a EFFectively reduzir a PIO. No entanto, até 40% dos pacientes de glaucoma mostram níveis normais de PIO que indica uma necessidade para métodos terapêuticos mais completos. 22,23 Além disso, de células ganglionares da retina morte visto no glaucoma é irreversível uma vez que começa e tratamentos actuais não parar a progressão da doença 24-28. Este pôs em evidência a necessidade de terapias neuroprotetoras eficazes que visam a sobrevivência dos próprios neurônios. Desenvolvimento de modelos de glaucoma é fundamental para esse desenvolvimento. Neste estudo, estão a demonstrar um método de induzir efeitos glaucoma semelhante em ratos Long Evans adultos utilizando um procedimento modificado descrito originalmente por Morrison 29. Neste procedimento, as injecções de 2 M de solução salina hipertónica no plexo venoso episcleral induz condições glaucoma semelhante por tecido cicatricial para reduzir a saída de humor aquoso na malha trabecular que conduz a um aumento na pressão intra-ocular e uma significativa perda de CGR Within de um mês após o procedimento 30-31. procedimentos de indução de glaucoma, como o aqui descrito, pode ser a chave para desvendar novos desenvolvimentos em tratamentos de glaucoma.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

O glaucoma é uma doença do sistema nervoso central que actua nas células ganglionares da retina (RGCs). axônios RGC que compõem o nervo óptico carregam informação visual ao cérebro para a percepção visual. Danos para CGR e seus axónios leva a perda de visão e / ou cegueira. Embora a causa específica do glaucoma é desconhecida, o factor de risco principal para a doença é uma pressão intra-ocular elevada. procedimentos de indução de glaucoma em modelos animais são uma ferramenta valiosa para os investigadores que estudam o mecanismo da morte das CGR. Tal informação pode levar ao desenvolvimento de tratamentos neuroprotectores eficazes que podem auxiliar na prevenção da perda de visão. O protocolo no presente documento descreve um método de indução de glaucoma - como condições em um modelo de rato in vivo, onde 50 ul de 2 M solução salina hipertônica é injetado na plexo venoso episcleral. Descascamento dos vasos indica injecção bem sucedida. Este procedimento causa a perda de CGR para simular o glaucoma. Um mês seguinteinjecção, os animais são sacrificados e os olhos são removidos. Em seguida, a córnea, lente, e são removidos do vítreo para fazer uma ocular. A retina é então desenrolada a partir da parte posterior do olho e fixado em placas de Sylgard utilizando agulhas cacto. Nesta altura, os neurónios da retina pode ser corada para análise. Os resultados deste laboratório mostram que aproximadamente 25% dos RGCs são perdidos dentro de um mês do procedimento em relação aos controles internos. Este procedimento permite a análise quantitativa da morte das células ganglionares retinais num modelo de glaucoma em ratos in vivo.

Esta seção ilustra os componentes do aparelho e procedimento utilizados para induzir condições de glaucoma-like em um modelo de glaucoma in vivo de ratos. Mostramos as ferramentas individuais e o equipamento usado para realizar uma injecção de solução salina hipertónica, que provoca um aumento na pressão intra-ocular. Mostramos a injecção no plexo venoso episcleral com o seu efeito de branqueamento característica e o aspecto turvo do que resulta da câmara anterior....

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K visualizações.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

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Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Neurociência

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Bioengenharia

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

A Magnetic Microbead Oclusão Modelo para induzir Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma em Ratos

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

Medicina

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

O modelo de roedor de nonarterítica óptica isquêmica anterior Neuropatia (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Biologia

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

Abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

Uma técnica de injeção de solução salina hipertônica para induzir glaucoma em ratos

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

Glaucoma de indução de Procedimento em um

Resumo

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