Name: establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
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Este trabalho foi apoiado por uma Fundação Cérebro Research Grant Semente (BRFSG-2014-02) para Helen Bateup. Dirk Hockemeyer é um New Scholar em Envelhecimento da Fundação Médica Ellison e é apoiado pela Fundação Glenn, bem como o The Shurl e Kay Foundation Curci. DH também é suportado pelo NIH conceder 1R01CA196884-01.

Os procedimentos descritos neste manuscrito foram revisados ​​e aprovados pela UC Berkeley Stem Cell Research Comitê de Supervisão. 1. Prepare células-tronco para Edição <ol><li> Cresça e cultura de células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) em uma placa de 6 poços contendo 2,4 x 10 6 células / placa mitomicina C de ratinho inactivado fibroblasto embrionário (MEF) cultivadas em alimentadores de gelatina 32. Manter hPSCs em 3 ml de meio de células-tronco embrionárias humanas por poço (mídia hESC) e crescer em um 37 ° C incubadora com 3% de O2 / 5% de CO 2. Nota: Para o sucesso deste protocolo, não é necessário manter hPSCs em uma incubadora de baixo teor de oxigênio; no entanto, é importante notar que hPSCs proliferar mais rapidamente num ambiente de elevada O2, assim os tempos e os números de células deve ser ajustado em conformidade. Deve também ser notado que hPSCs mantidas em baixo teor de oxigénio têm menores taxas de diferenciação espontânea 33. <ol><li> To tornar a mídia 500 ml 380 ml hESC combinar DMEM / F12, 75 ml de soro fetal bovino (FBS), 25 ml KnockOut substituição Serum (KSR). Adicionar Glutamina (1 mM de concentração final), 5 ml de 100x para não-aminoácidos essenciais, 100 unidades / mL de Penicilina-estreptomicina (P / S), Factor de Crescimento de Fibroblastos básico (bFGF) (4 ng / ml de concentração final), e 2- mercaptoetanol (5,5 uM de concentração final). </li></ol></li><li> Mudança de mídia através da remoção de volume inteiro de mídia (3 ml) utilizando uma pipeta de vidro e vácuo. Substitua com a mídia hESC 3 ml morna usando uma pipeta sorológica. Repita mídia mudar todos os dias até hPSCs são aproximadamente 50% confluentes (dia -1). </li><li> Um dia antes de segmentação (dia -1), altere mídia hESC, eliminando a velha mídia e adição de mídia hESC quentes suplementado com 10 mM Y-27632. </li><li> Também no dia -1, preparar um a dois de 6 poços ou placas de 10 cm de resistentes células alimentadoras MEF drogas de DR4 camundongos (2,4 × 10 6 células / placa) 34. Nota: Em geral, placas de 6 cavidades são advantageous mais de 10 cm placas, como eles acomodar mais mídia. 6 placas de poços também assegurar que os clones diferentes de diferentes poços são independentes. No entanto, uma placa de 10 cm permitirá colheita mais fácil, de acordo com o microscópio disponíveis para este processo. </li></ol> 2. Edição pluripotentes Células-Tronco <ol><li> Preparar soluções de transfecção por pipetagem de 5 ug cada de ZFN 1 e 2, TALEN 1 e 2, ou 15 ug do CRISPR / Cas9 codificação px330 plasmídeo (Figura 1) num tubo de 1,5 ml. Pipetar 30 ug do plasmídeo de reparação para este tubo bem. Finalmente, pipeta 1x tampão fosfato salino (PBS) para dentro do tubo para levar o volume até 300 ul. Nota: Preparar plasmídeos como um Midiprep (qualquer kit é adequado) com uma concentração mínima de 300 ng / ul, de modo a manter o volume total da solução de transfecção menos de 300 ul. Não é necessária a realização de extracção com fenol / clorofórmio, para linearizar o plasmídeo, ou de usar um endotoxin kit de preparação plasmídeo livre. </li><li> Remova a mídia da hPSCs usando uma pipeta de vidro e vácuo. Pipetar 2 ml de PBS 1x quente em cada poço para lavar as células. </li><li> Remover o PBS imediatamente utilizando uma pipeta de vidro e de vácuo. Adicionar 0,5 ml de 0,25% de solução de Tripsina-EDTA directamente sobre as células em cada poço. Colocar na incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% de O2) durante aproximadamente 10 min. ou até camada de alimentação começa a levantar a placa. </li><li> Adicionar 2 ml de meio morno esWash (470 ml de DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unidades / ml de P / S) a cada poço para parar a reacção de tripsina. </li><li> Assegurar que as células alimentadoras sair como uma folha. Pipetar o conteúdo de cada poço num único tubo cónico de 50 ml, que combina todas as cavidades. Triturar as células utilizando uma pipeta 10 ml sorológico. Não é necessário para quebrar a camada alimentadora; hPSCs virá fora da camada de alimentação por trituração suave. Não deve ser de cerca de 15 ml da suspensão de células. </li><li> Adicionar 25 ml de meio esWash ao tubo para trazer o volume até 40 ml total. Permitir grandes pedaços de alimentação para se depositam no fundo do tubo de 1-2 min. Remover o sobrenadante (~ 38 ml) a partir do tubo, usando uma pipeta serológica e depósito para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Girar durante 5 min a 190 x g. Retirar o sobrenadante do tubo, usando uma pipeta de vidro e de vácuo. Certifique-se de não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 500 ul de 1x PBS. Combine com uma solução de transfecção de plasmídeo preparado anteriormente. Contar as células nesta etapa. Use 5-10 milhões de células por electroporação. </li><li> Pipetar toda a suspensão em 800 ul de uma cuvete de electroporação 4 mm, colocar em gelo durante 3-5 minutos. Electroporar células usando o programa exponencial na electroporação sistema com os seguintes parâmetros: 250 V, 500 uF, resistência ∞, e 4 mm de tamanho de cuvete. Após a electroporação, colocar cuvete de volta em gelo durante 3 min. Nota: Observe a constante da eletroporação no sistema de eletroporação tempo. A constante de tempovaria de acordo com o número de células e a pureza do ADN. Transfections bem sucedidos costumam ter uma constante entre 10-14 ms de tempo ao usar as condições listadas e um pulsador gene II. Electroporação eficiências inferiores pode ocorrer quando as constantes de tempo varia a partir destes valores. </li><li> Ressuspender as células electroporadas em 18 ml quente hESC meios suplementados com 10 ï¿½ Y-27632. Placa 3 ml desta suspensão de células individuais em cada poço de uma placa de 6 poços com células alimentadoras DR4. Voltar à incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% de O2). </li></ol> 3. Selecção de colónias positivas <ol><li> Dia 2, remova toda a mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo. Substituir por 3 mL de meios de hES quentes suplementado com 10 uM Y-27632. Dia 3, remova toda a mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo. Substitua com 3 ml de meio hESC quente sem incluir Y-27632. Dia 4, remova toda a mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo. Substitua com 3 ml de mídia hESC quentes suplementados com antibióticos para selectiligar. Voltar à incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% de O2). Nota: O tipo de antibiótico utilizado dependerá da cassete de resistência à incluídas no modelo de reparação. Quando se trabalha com WIBR # 3 hPSCs registo (NIH 0079), 0,5 ug / ml de puromicina, 70 ug / ml de G418 (geneticina), e 35 ug / ml de higromicina foram utilizados com sucesso. As concentrações de selecção deve ser determinado empiricamente, estabelecendo a concentração mínima de antibiótico necessária para matar as células de tipo selvagem dentro de aproximadamente uma semana. </li><li> Dias 5-12, mudar media diária, substituindo a velha mídia de cada vez com a mídia CTEh quentes suplementado com antibióticos. Nota: Esperar uma grande quantidade de morte celular. As colónias individuais se tornará aparente em torno do dia 10/08. Meios células estaminais embrionárias humanas normais sem os antibióticos podem ser usados ​​depois de 12-14 dias de selecção contínua. Se a densidade celular é elevada ou a morte celular é lenta, a acidificação dos meios de comunicação deve ser evitado e pode ser necessário aumentar os volu mediame (até 4-5 ml), durante os primeiros dias de seleção. </li></ol> 4. Escolher colónias seleccionadas (dia 12-14) <ol><li> Observe colônias no dia 14/12. Observe as colônias que estão prontos para pegar em um microscópio de dissecação e garantir que eles não contêm células que estão começando a se diferenciar. O tamanho aproximado deve ser 800-1200 uM. Se colônias atingir este tamanho antes do dia 12, recomenda-se que eles devem ser colhidos em seguida. Nota: Para cada experimento segmentação, escolher como muitas colônias do necessário para assegurar o genótipo desejado é isolado. Como um exemplo, a edição AAVS1 com o modelo de reparação de AAV-EGFP-CAGGS mostrou consistentemente integração robusta, e requer apenas 12-24 colónias de ser escolhidos para se obter cerca de 5-10 clones heterozygously segmentados. Outras experiências de direccionamento podem exigir mais colónias para ser retirado (Tabela 1). A freqüência de eventos de segmentação corretas depende de fatores tais como a eficiência da SSN para introduzir uma DSB, o tamanho da inserção, e a estratégia de selecção. No caso da abordagem de armadilha de genes para o locus AAVS1 aqui apresentado, o marcador de selecção é expresso apenas quando correctamente integrado no sítio alvo, reduzindo o número de colónias necessários para se obter um clone corretamente alvejado. </li><li> Um dia antes da colheita, para preparar as placas de 12 poços de MEFs (2,4 x 10 6 células / placa, um poço será usado para cada colónia colhidos). </li><li> No dia da colheita, remova todas as mídias das 12 placas bem MEF, utilizando uma pipeta de vidro e vácuo e substituir com 1 ml de mídia hESC. Também no dia da colheita, altere mídia hESC sobre as placas de 6 bem que estão indo para ser escolhido. </li><li> Puxar pipetas de vidro para a dissociação mecânica das colónias individuais a partir da camada alimentadora. Abaixe as pipetas sobre um bico de Bunsen de-capuz e suavizou no ponto de expansão até que o vidro é maleável. Remover rapidamente de chamas e retirar a pipeta além criando um ponto angular. Rompem oponto a cerca de 2 cm do eixo curvo, deixando um canal estreito. Lustrar o fim do canal por exposição à chama para 1-2 seg. Nota: Opcionalmente escolher colônias uma pipeta de ponta p20, no entanto, isto pode reduzir a clonality da cultura, como a ponta maçante pode desalojar maiores quantidades de células de cada colônia na mídia, potencialmente contaminando colheitas subsequentes. </li><li> Montar escolhendo dispositivo tomando uma pipeta de ponta de filtro P1000 e anexar uma bomba de sucção para a parte mais estreita. Insira a pipeta de vidro puxado na grande final. </li><li> Coloque uma placa de 6 poços de hPSCs para ser retirado na plataforma de um microscópio de dissecção montado em um capuz de cultura de tecidos. Comprima o bulbo do dispositivo de picking e gentilmente extirpar e cortar uma colónia individual em 10-20 partes de igual tamanho, tomando cuidado para não soltar peças na mídia. Tome peças HPSC excisadas da colônia para a pipeta, liberando a lâmpada. Tente tomar tão pouco quanto possível a mídia durante a transferência. </li><li> Transfer a colónia individual para um único poço de uma placa de 12 poços MEF, comprimindo a lâmpada de novo directamente para dentro do poço, libertando a colónia agora quebrado. Rotular cada poço para permitir a identificação única de clones derivados de uma única célula. Repita o procedimento para o maior número de colônias, se necessário, mudando a pipeta de vidro de cada vez. Nota: colônias da colheita pode levar algum tempo para aprender. Recomenda-se que a prática experimentador em algumas células de controlo antes de tentar isolar colónias visadas. </li><li> Rendimento de 12 placas de poços para a incubadora (37 ° C / 3% de O2 / 5% de CO 2), agitando suavemente a placa primeiro para evitar a acumulação de células no meio de cada poço. </li><li> No dia seguinte, e cada dia subsequente, remover o volume total de mídia usando uma pipeta de vidro e vácuo e substituir com 1,5 ml de meio hESC quente até que as células são cerca de 50% confluentes (o que normalmente leva 10-12 dias). </li><li> Após 10-12 dias, escolher uma a duas colónias de cada poço e transferidos para novas placas de 12 poços MEF repeating passos de 4,1-4,8 para gerar uma placa réplica. </li><li> Extracto de ADN (ver abaixo) a partir das colónias remanescentes em cada poço das placas de MEF originais. <ol><li> Remova a mídia de todos os poços utilizando uma pipeta de vidro e vácuo. Pipeta de 1 ml de PBS 1x em cada poço para lavar as células. Remover PBS usando pipeta de vidro e vácuo. Pipetar 250 L de tampão de lise celular (concentrações finais em H2O: 10 mM de Tris HCl, 5 mM de EDTA, 0,2% SDS, NaCl 200 mM, 0,08 mg / ml de Proteinase-K) em cada poço. Colocar na incubadora (37 ° C / 3% de O2 / 5% de CO 2) O / N. </li><li> No dia seguinte, o conteúdo da pipeta de cada poço em tubos de 1,5 ml cada. Pipetar 250 L de álcool isopropílico em cada tubo para precipitar o ADN. Agitar vigorosamente tubo. Um precipitado branco deve ser visível. </li><li> Girar cada tubo para baixo durante 3 minutos a 13.000 rpm numa centrífuga de topo de mesa. Depois de spin para baixo, elimine o sobrenadante por decantação em resíduos líquidos. Um pequeno pellet de DNA deve continuar a ser preso ao fundo dao tubo. Pipetar 250 l de etanol a 70% a cada tubo para lavar o sedimento de DNA. Agite bem. Girar cada tubo para baixo durante 3 minutos a 13.000 rpm numa centrífuga de topo de mesa. </li><li> Depois de girar para baixo, elimine o sobrenadante por decantação em resíduos líquidos. Um pequeno pellet de DNA deve continuar a ser preso ao fundo do tubo. Pipetar para fora do restante do sobrenadante por isso não há líquido deixado no tubo. Deixe tubo aberto para secar em bancada para 5-10 min. Após a secagem, ressuspender o ADN em 250 pL de tampão TE. Coloque a 37 ° C durante 6 h para permitir que o DNA para dissolver. </li></ol></li><li> Genótipo cada amostra usando uma estratégia blot pré-otimizada PCR ou do sul. Nota:.. Para AAVS1 direccionamento utilizando o modelo de reparação de AAV-CAGGS-EGFP, a estratégia de Southern blot pode ser encontrado em Hockemeyer et ai, 2009 4 Um protocolo de transferência de Southern abrangente pode ser encontrada em Southern, 2006 35 Para a PCR multiplex genotipagem de. na mesma experiência, os iniciadores e as condições podem serencontrados na Tabela 2 36. </li><li> Descarte poços que não estão devidamente direcionados e continuar mudando media hESC em células corretamente direcionados a cada dia. Congelar para baixo as células quando elas são aproximadamente 50% confluentes, veja abaixo para protocolo de congelação. <ol><li> Um dia antes do congelamento, altere mídia hESC, eliminando a velha mídia e adição de mídia hESC quentes suplementado com 10 mM Y-27632. </li><li> No dia do congelamento preparar 0,5 ml de cada vez de solução A e solução B por poço de uma placa de 12 poços que está a ser congelado para baixo em dois tubos cónicos de 15 ml. Soluções de colocar no gelo. Solução A: 50% mídia hESC e 50% FBS; Solução B: 80% de FBS e 20% de dimetilsulfóxido (DMSO). </li><li> Dissociar colônias HPSC em células isoladas antes do congelamento. Siga os passos 2,2-2,8 de fazer isso, escalando volumes em conformidade. Pellet celular totalmente ressuspender em 0,5 mL da solução A. </li><li> Adicionar 0,5 ml de solução B para suspensão de células, pipeta cima e para baixo para fazer a suspensão celular homogênea. Take o volume total da suspensão de células (~ 1 ml) e depósito em 2 ml de tubo criogénico. Tampa de rosca com força. </li><li> Colocar num criotubo -80 ° C congelador O / N. No dia após o congelamento, remover células congeladas a partir de -80 ° C congelador e imediatamente colocar dentro do tanque de azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O método apresentado aqui para o isolamento de populações homogêneas de células-tronco pluripotentes humanas editada por genes é uma abordagem poderosa para gerar linhas HPSC isogênicas que diferem apenas no locus alvo. Estas células são um sistema ideal para sondar os mecanismos da diferenciação celular e desenvolvimento humano, bem como para compreender a patofisiologia de doenças monogénicas, num ambiente controlado genética. Como demonstrado aqui, é possível usar três estratégias de desenho independentes SSN (ZFNs, TALENS, CRISPR e / Cas9) para conseguir a integração alvo no locus AAVS1. Cada um destes métodos tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Uma vantagem potencial da ZFNs e, em certa medida, é TALENS sua flexibilidade de desenho, o que permite a engenharia iterativo, a fim de melhorar a domínios de nucleases individuais 42 de ligação do ADN. Essa otimização nuclease poderia aumentar a especificidade do ZFNs e TALENS além do que é possível com a CRISistema SPR / Cas9. Tal selectividade pode ser importante para aplicações clínicas requerem um alto grau de especificidade alvo. A principal vantagem do sistema CRISPR / Cas9 é a sua facilidade de uso. Embora TALEN e ZFN kits de construção têm sido postos à disposição do público (ou seja, através de Addgene 21), CRISPR / SSN baseados em Cas9 são significativamente mais fáceis de construir, como o único personalização necessário é um par oligonucleótido de 20 bases (quando se utiliza o plasmídeo px330 projeto 14). Esta simplicidade revela-se vantajosa para os laboratórios de pesquisa que procuram incluem edição genoma em seus estudos. Existem técnicas de transfecção alternativos, incluindo nucleofection 43, para criar linhas HPSC editada por genes; No entanto electroporação foi demonstrado ser eficaz 4,5,25 consistente e custo. Nucleofection pode ser utilizado para transfectar directamente Cas9-guia complexos de ARN no núcleo de ribonucleoproteína, aumentando a eficiência de um SSNd fidelidade 44. Crescer hPSCs em MEFs é um método robusto e baixo custo de manutenção hPSCs em um estado pluripotente sem diferenciação excessiva. Além disso, permite o isolamento fácil das colónias geneticamente idênticos. Em alternativa, é possível hPSCs cultura sem MEFs, no entanto, estas condições de cultura podem ser mais caros do que as culturas baseadas alimentadoras. Além disso, todo o processo é escalável, permitindo o isolamento de edição de eventos muito raros ou a geração de muitas linhas de células diferentes em experiências paralelas de edição. O protocolo aqui descrito é robusta; no entanto, existem vários passos-chave que afetam a eficiência com que os clones corretamente editados podem ser obtidos. O componente mais importante para este método é que tem MEFs de alta qualidade e MEFs DR4 resistentes aos medicamentos. A sobrevivência de hPSCs individuais é tênue, e MEFs de baixa qualidade vai impedir o isolamento das linhas HPSC indiferenciadas. Em segundo lugar, o uso de Y-27632 é tambémchave para permitir a sobrevivência da célula única, sem gerar uma pressão seletiva para as células com um cariótipo anormal 45. Em terceiro lugar, escolher colónias bem espaçadas garante a homogeneidade genética das linhas celulares derivadas. Finalmente, é importante preparar pipetas de vidro de modo que a abertura é suficientemente pequena para quebrar a colónia em muitos pedaços menores, assegurando que várias colónias irão crescer no novo poço. Isto permite a colheita de subclones bem espaçados para uma placa de réplica para ter na cultura, deixando a chapa original de colônias isoladas para genotipagem. A parte difícil neste protocolo é o manual puxando das pipetas de vidro; esta deve ser praticada de antemão. Deve notar-se que existem várias técnicas de separação clone que não necessitam de uma pipeta de vidro. Experimentadores são incentivados a encontrar o que funciona melhor para eles. Existem limitações para este protocolo que pode ser superado por modificações simples. Um experimento destina-se a óomente perturbar o locus de interesse, sem reparação ou uma reparação cujo modelo não contém uma cassete de selecção, deve usar outro método de enriquecimento de células que foram editados. Note-se que o número de colónias que deve ser escolhido para encontrar um clone positivo aumenta grandemente na ausência de selecção. Uma estratégia para melhorar a eficiência é a co-transfecção de um plasmídeo não integrando que expressa uma proteína fluorescente. Depois de permitir que as células recuperar durante dois dias, as células visadas podem ser classificados em fluorescência positiva utilizando separação de células activada por fluorescência e replaqueadas 29. Este processo enriquece para as células que foram transfectadas com os plasmídeos por electroporação e, assim, aumenta a probabilidade de um evento edição concorrente na célula. As técnicas descritas aqui pode ser estendido para usar vários RNAs guia para atingir simultaneamente vários 14,46,47 loci. Muitos protocolos foram criados para diferenciar hPSCsem tipos de células distintos, permitindo várias manipulações genéticas em tipos de células de interesse 30. No geral, temos demonstrado o potencial para edição genoma eficiente em hPSCs independentemente da escolha SSN. Propomos que esta técnica pode ser adaptada para criar linhas isogénicas HPSC que foram gene editado em qualquer local genómico.

Tecnologias de edição genoma estão evoluindo rapidamente em ferramentas padrão para biologia molecular e celular 1. A engenharia genética de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) é de particular interesse como hPSCs representam uma fonte de auto-renovação das células primárias humanas geneticamente intactas. hPSCs podem ser diferenciadas em vários tipos de células para a modelagem doença ou como uma fonte para terapias de transplante 2,3. Aqui demonstrada é um protocolo que utiliza três diferentes tipos de nucleases específicas do local (SSNs) em conjunto com os mecanismos de reparação de ADN endógenas alvo para a integração de uma construção repórter no locus AAVS1. Após transfecção de CPFs em hPSCs, demonstramos como isolar populações de células isogï¿½nicas abrigar o repórter. A capacidade de manipular genomas, especificamente pluripotent stem genomas celulares, usando CPFs não é um fenômeno novo como o utilitário de nucleases de dedo de zinco (ZFNs) e transcrição activatnucleases efetoras ou semelhantes (TALENS) para a edição gene foi demonstrado há vários anos 4-10. No entanto, com o advento do S. pyogenes CRISPR / tecnologia Cas9 11-13, edição gene tornou-se amplamente acessíveis 14. Todos os CPFs introduzir uma quebra de DNA de cadeia dupla (DSB) no local de destino especificado 1,4,5,11 que seja reparado por mecanismos celulares endógenos usando não homóloga de reparação (NHEJ) juntando-final ou homologia dirigido (HDR) 15. NHEJ é propensa a erros e pode introduzir mutações deslocamento do quadro resultando em perda da função do gene, enquanto HDR permite novos elementos para ser introduzido através da co-transfecção de um modelo de reparação com o SSN. Embora os princípios subjacentes de reparo do DNA que facilitam a edição gene são pensados ​​para ser basicamente o mesmo para cada SSN, algumas diferenças entre as plataformas podem ser observados. De novo projeto de ZFNs permite flexibilidade e otimização nuclease 16, no entanto, o uso de publicamentebibliotecas de montagem disponíveis e ferramentas de triagem para projetar ZFNs individuais pode ser demorado. Uma vez que o local desejado para segmentação ZFN mediada é determinado, pares ZFN pode ser projetado com a ferramenta on-line ZiFit 17. Depois de design, ZFNs podem ser modularmente montado através de várias rodadas de clonagem plasmídeo 18. Como alternativa, há muitos disponíveis comercialmente, pré-validado ZFNs 19. Nucleases CONTO também podem ser projetados usando ferramentas on-line e componentes publicamente disponíveis 17,20. Por exemplo, TALENS pode ser rapidamente montada a partir de blocos de cinco repetições conto, através do conjunto FLASH 21 ou usando PCR hierárquica montagem 22 Golden Gate base. Facilidade de projeto SSN e velocidade de construção utilizando CRISPR / Cas9 fez genoma editar uma ferramenta amplamente acessível. O guia curta mediada RNA-targeting de CRISPR / Cas9 também permite a multiplexação de RNAs guia para direcionar vários loci com uma única construção 14. O designde Cas9 para edição gene requer apenas a identificação de um motivo adjacente protospacer (PAM; um trinucleótido NGG por S. pyrogenes Cas9) proximal em relação ao locus alvo. Através da inserção de um oligonucleótido que corresponde aos 20 pares de bases 5 &#39;do PAM no plasmídeo px330 14, a construção pode ser montado em uma etapa de clonagem. Além S. pyogenes Cas9, Cas9 de N. meningitidis (NmCas9) que reconhece um 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;(PAM) foi mostrado para permitir a eficiente do gene de edição em hPSCs 23. Em adição às diferenças na facilidade de concepção SSN, cada plataforma tem propriedades específicas. Por exemplo, ZFNs e TALENS utilizar o domínio de nuclease Fokl, que gera um de quatro nucleótidos 5 &#39;saliência 24, enquanto Cas9 é pensado para gerar na maior parte neutralizar LAP casquilhos. ZFNs, TALENS, e Cas9 diferem nas suas estabilidades de proteína, a taxa de sobre-off no ADN alvo, e o modo de digitalização do ADN, todos os quais Could teoricamente resultar em pequenas diferenças no resultado de edição 1. Embora mais estudos serão necessários para compreender plenamente as consequências dessas diferenças, nós descrevemos aqui um protocolo que é altamente robusto em todas as três plataformas e pode ser usado para gerar prontamente hPSCs geneticamente modificados. Independentemente da escolha SSN, eletroporação é um procedimento robusto para transfectar CPFs e modelos de reparação de homologia em hPSCs 25. O número de colónias sobreviventes após selecção para resistência a antibióticos depende de parâmetros específicas para um local e a estratégia de edição (por exemplo, tamanho de inserção transgénica e o modo de selecção). O protocolo aqui descrito geralmente resulta em cerca de 150-400 colónias derivadas de uma única célula. No locus AAVS1 utilizando este protocolo de edição de gene tenha sido previamente utilizado para demonstrar a eficácia de SSN 4,5. O modelo de reparação de AAV-EGFP-CAGGS utiliza um str armadilha de genesategy para conferir resistência puromicina de uma maneira específica local. Resumidamente, o modelo de reparação contém um local aceitador de união a montante da cassete de promotor de resistência puromicina. Após integração correcta no primeiro intrão do gene PPP1R12C no locus AAVS1, a cassete de resistência é expresso a partir do promotor do gene editado. A robustez deste ensaio AAVS1 específica nos permite comparar a eficiência de cada plataforma SSN. Edição Gene usando CPFs é poderosa, dada a capacidade de perturbar e / ou alterar teoricamente qualquer gene. Aplicando esta estratégia para hPSCs oferece versatilidade como hPSCs pode ser posteriormente diferenciadas em uma infinidade de tipos de células humanas, como neurônios 26, os hepatócitos 27 e cardiomiócitos 28. Além disso, a utilização de células estaminais pluripotentes induzidas derivadas de doentes permite a reparação ou a introdução de mutações causadoras de doenças conhecidas num fundo genético específico do paciente 29 </sup&gt;, Proporcionando uma plataforma para investigar os mecanismos da doença e terapêutica de teste usando próprias células de um paciente 30. Em resumo, edição gene em hPSCs é uma abordagem eficiente e versátil para investigar a biologia básica do desenvolvimento humano e da doença 31.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor - basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, plugged</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Cryotubes</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation

Genoma de edição de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) fornece uma plataforma controlada geneticamente e clinicamente relevante do que para entender o desenvolvimento humano e investigar a fisiopatologia da doença. Ao empregar nucleases específicas do site (CPFs) para edição genoma, o rápido derivação de novas linhas HPSC abrigando alterações genéticas específicas em um ambiente de outra forma isogênico se torna possível. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS) e agrupados repete regularmente palindrï¿½icas curtas intercaladas (CRISPR) / Cas9 são os CPFs mais comumente usados. Todas estas nucleases funcionar através da introdução de uma pausa de DNA de cadeia dupla em um local especificado, promovendo assim a edição gene preciso em um locus genómico. Edição genoma SSN-meditado explora dois dos mecanismos da célula endógenos de reparo do DNA, final não homóloga juntar (NHEJ) e homologia reparo dirigido (HDR), quer para introduzir inserção / mutações de deleção ou alter o genoma utilizando um modelo de reparação homóloga no local da ruptura de cadeia dupla. Eletroporação de hPSCs é um meio eficiente de transfecção de CPFs e modelos de reparação que incorporam transgenes como repórteres fluorescentes e cassetes de resistência a antibióticos. Após a electroporação, é possível isolar apenas os hPSCs que incorporaram a construção de reparação por selecção de resistência a antibióticos. Mecanicamente separar colónias HPSC e confirmando a integração apropriada no local alvo através de genotipagem permite o isolamento de linhas celulares corretamente alvejadas e geneticamente homogéneos. A validade do presente protocolo é demonstrado aqui, utilizando todas as três plataformas SSN para incorporar EGFP e uma resistência puromicina construir no AAVS1 seguro lócus porto em células-tronco pluripotentes humanas.

Aqui demonstramos um protocolo compatível com três plataformas diferentes SSN para criar linhas HPSC geneticamente modificadas. Nós alvo WIBR # 3 células estaminais embrionárias humanas no locus AAVS1 usando ZFNs publicados anteriormente 4, 5 e TALENS CRISPR / Cas9s 37 usando um modelo de reparação que introduz um repórter EGFP e uma cassete de resistência à puromicina 4. Nós cultivadas nossos hPSCs em MEFs para um fluxo de trabalho de cultura de células permitindo a manutenção e expansão da hPSCs indiferenciadas (Figura 2), que também é rentável e escalável. Se as células são cultivadas mais tempo do que o necessário, há um risco de aumento da diferenciação, a redução do número de células pluripotentes que são transfectadas e, consequentemente, o número de colónias HPSC correctamente alvejados obtidos. Nós electroporated 5,0 x 10 6 culas por plataforma SSN e semeadas as células a partir de cada alvo numa única placa de 6 poços de DR4 MEFs. Após selecção, cada plataforma resultaram em colónias EGFP-positivo (Figura 3) e uma combinação de clones irrelevantes, homozigoticamente segmentados e heterozygously segmentados (Figura 4A, B; Tabela 3). Sob as condições aqui apresentados, achamos que o AAVS1 TALENS resultou na maioria dos clones EGFP-positivos. O modelo de reparação usado para esta experiência consiste em um local aceitador de união a montante do repórter e resistência à puromicina cassete EGFP. Utilizando esta estratégia de &quot;gene trap&quot; (Figura 1), a construção deverá ser inserida no primeiro intrão do locus AAVS1, utilizando o promotor endógeno para dirigir a expressão da cassete de resistência à puromicina. A falta de um promotor que conduz a expressão do gene de resistência à puromicina dentro do molde a reparação deverá impedir a expressão no<html> evento de integração aleatória. Portanto, esperamos que todos os clones puromicina resistentes seriam visados ​​no local AAVS1. Deve notar-se que um subconjunto dos clones de realizar integrações aberrantes no locus AAVS1 que são detectáveis ​​por mancha de Southern utilizando uma sonda interna, mas não pela maioria das estratégias de PCR (Figura 1; Figura 4C) 4. Estes eventos de integração são provavelmente o resultado de eventos de alvejamento heterólogos que conduzem a várias integrações do plasmídeo dador 4. Nós escolhemos 24 colônias de cada experimento SSN e descobriu que todas as plataformas tiveram ganhos de eficiência muito elevados de segmentação e mostrou diferenças apenas mínimos. Como interrogado por PCR, CRISPR / Cas9 produziu os clones mais correcto direccionamento enquanto a plataforma TALEN tinha os clones mais homozigoticamente segmentados (Tabela 3). &quot;width =&quot; 700 /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Esquema de gene editado AAVS1 local usando o modelo de reparação AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. As colónias de WIBR # 3 células. Representativos imagens campo brilhantes de colônias de WIBR # 3 células estaminais embrionárias humanas anteriores à segmentação. Observe a falta de diferenciação e a separação clara da camada de alimentação em uma colônia ideal (à esquerda), em oposição a um não-ideal (à direita). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. EGFP-positivo WIBR # 3 células. Imagens representativas de WIBR # 3 células-alvo com um modelo de reparação que expressam EGFP no locus AAVS1. Imagens de colônias representativas editadas com ZFNs, TALENS e CRISPR / Cas9 são apresentados. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. estratégias Genotipagem para confirmar a segmentação correta. (A) resultados de genotipagem Representante PCR mostrando clones não segmentados, heterozigotos e homozigotos alvejados nas três plataformas SSN. WT CTL = controle de tipo selvagem. (B) Repreresultados de Southern blot sentativas mostrando um heterozigoto alvo clone e um clone alvo homozigoto detectado com sonda externa a 3 &#39;. Tamanhos dos fragmentos: WT-6,5 kb, editado 6,9 kb. (C) os resultados de Southern blot representativos mostrando um clone corretamente editado e um clone heterozigotos com um não-aleatório duplo-integração. Tamanhos dos fragmentos: corretamente. Editadas 6,9-kb, aberrante integração-5 kb adicional <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Estude </td><td> Gene alvejado </td><td> Plataforma </td><td> Reparação tipo de modelo </td><td> Nº de clones escolhidos </td><td> Segmentação eficiência </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td&gt; <td> não declarada </td><td> não declarada </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td> Higromicina </td><td> não declarada </td><td> não declarada </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39,0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> 14,9% </td></tr><tr><td> , Hockemeyer et al. 2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> 91,0% </td></tr><tr><td> , Hockemeyer et al. 2011 </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> 13,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> Repórter-Geneticin </td><td> 139 </td><td> 94,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al. &lt;/ em&gt;, 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> Repórter-Geneticin </td><td> 30 </td><td> 93,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> Hcrt </td><td> Cas9 </td><td> Repórter-Geneticin </td><td> 154 </td><td> 92,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> Repórter-Geneticin </td><td> 11 </td><td> 45,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> não declarada </td><td> 30,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> não declarada </td><td> 14,0% </td></tr><tr><td> Soldner et al., 2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> 1,0% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Descrição de outros genes alvo utilizando este método, com Correpondente visando ganhos de eficiência tomadas a partir de estudos publicados anteriormente. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Lugar geométrico </td><td> Seqüência </td><td> Notas </td></tr><tr><td> AAVS1-F iniciador </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> As condições de PCR: T m = 57 ° C, 35 ciclos </td></tr><tr><td> AAVS1-WT-R iniciador </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> Banda WT: 1273 pb </td></tr><tr><td> AAVS1 Targeted-R cartilha </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> Banda alvejado: 992 pb </td></tr><tr><td> T2-Cas9-guia </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> A partir de Mali et al., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-direito </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> De Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-esquerda </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> De Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-direito </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> , De Hockemeyer et al. 2011 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-esquerda </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> , De Hockemeyer et al. 2011 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Lista de primers e sequências de direccionamento SSN. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Construção de direccionamento </td><td> Número de EGFP + Colonies </td><td> Clones escolhidos para públicos específicos (PCR verificado) </td><td> Anterior Relatados Eficiência Targeting correta (por Southern blot) </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) </td><td> 56% (50% Het / 6% homo) </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) </td><td> 47% (37,5% het / 9,3% homo) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95,7% (69,5% Het / 2Homo 6,3%) </td><td> não declarada </td></tr></tbody></table> Tabela 3. números comparativos de EGFP-positivo e alvejado TALEN, ZFN e CRISPR / Cas9 colônias de células-tronco humanas. PCR verificada integrações no locus AAVS1 para esta experiência são comparados a transferência de Southern verificou integrações únicas adequadas em experiências anteriores 4,5.

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Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K visualizações.  University of California, Berkeley. Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance. 

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, seleção e Colony-picking de induzidas pelo homem pluripotentes Células-Tronco TALEN-alvo com um gene GFP no AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Biologia do Desenvolvimento

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Genética

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfectando e Nucleofecting células-tronco pluripotentes induzidas

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biologia

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

Geração rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes Recombinante Humana pela recombinase mediada troca cassete no<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Medicina

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Derivação e Caracterização de um free-Transgene Human Induced Pluripotent Stem Cell Line e Conversão em Definidas condições clínicas de grau

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical application of this technique, particularly in pluripotent stem cells, presents certain challenges, such as being time- and labor-intensive and having low editing efficiency. Here, we describe the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in a human embryonic stem cell (hESC) line stably expressing sgRNAs for the L2HGDH gene, using a highly efficient and stable lentiviral-mediated gene delivery system. The sgRNAs targeting exon 1 of the L2HGDH gene were chemically synthesized and cloned into the lentiCRISPR v2-puro vector, which combines the constitutive expression of sgRNAs with Cas9 in a highly efficient single-vector system to achieve higher lentiviral titers for hESC infection and stable selection using puromycin. Puromycin-selected cells were further expanded, and single-cell clones were obtained using the limited dilution method. The single clones were expanded, and several homozygous knockout clones for the L2HGDH gene were obtained, as confirmed by a 100% reduction in L2HGDH expression using Western blot analysis. Furthermore, using MSBSP-PCR, the CRISPR mutation site was mapped upstream of the PAM recognition sequence of Cas9 in the selected homozygous clones. Sanger sequencing was performed to analyze the exact insertions/deletions, and functional characterization of the clones was conducted. This method produced a significantly higher percentage of homozygous deletions compared to previously reported non-viral gene delivery methods. Although this report focuses on the L2HGDH gene, this robust and cost-effective approach can be used to create homozygous knockouts for other genes in pluripotent stem cells for gene function studies.

<meta charset="utf8"></head><body>Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

The presented method describes the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in the human embryonic stem cell (hESC) line H9, which stably expresses sgRNAs targeting the L2HGDH gene using a highly efficient lentiviral-mediated gene delivery system.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...