This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

Preparação 1. Amostra <ol><li> Cruzar a linha de Gal4 3,22 motorista para UAS-GCaMP5G 19 moscas (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Permitir que a cruz de crescer a 25 ° C. Nota: Generating voa com várias cópias dos transgenes Gal4 ou UAS-GCaMP pode ajudar a melhorar a intensidade do sinal fluorescente. Uma versão anterior do transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostraram muito fraca intensidade de fluorescência quando expressa sob o controlo do condutor Gr68a-Gal4. <ol><li> Coletar e separada por sexo recém-eclosed moscas adultas e levantar a 25 ° C. Nota: O nível básico de GCaMP5G florescimento é o ideal em moscas com idade entre 14-28 dias. Isolando moscas por sexo exclui a possibilidade de interações sociais que podem influenciar as respostas neurais. </li></ol></li><li> Anestesiar uma mosca sob uma corrente suave de CO 2. </li><li> Fixe a fly a uma lamela de vidro, colocando primeiro uma pequena gota de unha polonês no centro de uma lamela de 0,17 mm. Suavemente colocar uma mosca no seu lado sobre a gota de unhas polonês claro e assegurar que toda a queda é coberto pela mosca. </li><li> Execute os passos 1.5 e 1.6 sob um microscópio estereoscópico de dissecação, usado em 8x ampliação. </li><li> Use um pincel molhado para estender uma pata dianteira da mosca. Fixar a pata dianteira em posição pela colocação de duas tiras delgadas de fita ao longo dos primeiro e quinto segmentos do tarso (Figura 2A). Isto irá expor segmentos do tarso T2-T4 para imagiologia (Figura 2B). </li><li> Para neurônios imagem na tromba, coloque uma fina tira de fita adesiva sobre a tribuna das tromba para expor o labelo (Figura 2C, D). </li><li> Desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor da mosca com uma caneta PAP para evitar solução de fluir sobre a superfície da lamela. Fazer medições no prazo de 30 min de montagem. </li></ol> 2. Preparação de EstímuloSolução <ol><li> Diluir ligandos lipofílicos (tais como CH503, utilizada neste estudo) em uma solução de PBST: 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4. <ol><li> Produzir uma solução stock de 1 mg / ml de ligando utilizando PBST. Prepare todas as diluições posteriores da solução utilizando PBST. Nota: Dependendo da solubilidade do ligando de interesse, podem ser necessários diferentes solventes para dissolver o ligante. A solubilidade do CH503 em vários solventes é descrita na Tabela 1. Ao contrário de outros solventes, PBST não produzir um aumento na fluorescência. </li></ol></li></ol> 3. Estimulação da Gustativa Neurônios e Aquisição de Imagem <ol><li> Utilizando um pipetador de 10 ul, 10 ul de colocar PBST para os segmentos do tarso. Nota: Esta etapa umedece a perna e impede que os segmentos do tarso de drifting. </li><li> Use um sistema óptico que possui uma câmara de suvelocidade ficiente e sensibilidade para alcançar um bom sinal de fluorescência de resolução temporal alta. Nota: Para este estudo foi utilizado um microscópio confocal disco giratório e uma câmera scmos (veja Lista de Materiais). </li><li> Escolha do segmento e neurônios tarsal específica a ser trabalhada. Adquirir três pré-estimulação confocal Z-stacks. <ol><li> Idealmente, as configurações de aquisição de uso que são rápidos o suficiente para permitir a resolução de tempo máximo enquanto ainda captar o volume da célula inteira. Configurações de aquisição de exemplo são: 200 exposição ms, binning 2 x 2 e 6 x 0,5 m 2 secções de óptica, capturados a cada 2 s. Nota: as pernas imobilizadas ter sido fotografados com sucesso para até 10 minutos, em intervalos de 30 seg, sem branqueamento discernível do sinal GCaMP. Para maiores tempos de gravação, verifique se as pernas são mantidas firmemente no lugar na lamela. </li><li> Optimizar a potência do laser para a mais alta relação sinal-ruído possível com fotodegradação mínima durante toda a imaging regime. Para os experimentos aqui descritos, usar um 491 nm diodo laser (100 mW) a transmissão de 30% para exames ambos os neurônios Gr68a e gustativos ppk23 nas pernas e tromba. Use 2 x 2 binning para permitir tempos de exposição mais curtos enquanto ainda alcançar resolução espacial suficiente. Nota: As configurações de energia do laser foram otimizados para permitir a detecção da mudança fluorescente que vão desde um aumento de 1,2 a 4,5 vezes. </li></ol></li><li> Pipetar 10 ml da solução para o estímulo segmentos do tarso. Para experiências de controle, adicionar mais 10 mL de PBST. imediatamente adquirir 117 imagens pós-estimulação. Nota: o número de imagens de pós-estimulação é adquiridos com base na quantidade de tempo em que foi alcançado alteração máxima na fluorescência (aproximadamente 2 min). <ol><li> Passo crítico: Enquanto pipetando solução sobre a preparação, não para tocar a mosca com a ponta da pipeta uma vez que este fará com que a pata dianteira para mover fora de posição. Nota: Como alternativa, useum micromanipulador para posicionar com precisão um capilar de vidro contendo estímulo perto do segmento tarsal a ser trabalhada. Fornecer volumes controlados de estímulo, utilizando um dispensador de microinjecção intracelular de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li></ol> 4. Processamento de Imagem e Análise: Quantificação da resposta <ol><li> Abra uma série de Z-pilhas confocal usando Fiji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 ou ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> software) análise e processamento de imagem 24. </li><li> Adicione uma projecção soma de intensidade de todas as seis fatias Z para cada um dos 120 pontos de tempo. <ol><li> Selecione a opção &quot;Pilha&quot; em &quot;Imagem&quot;. Além disso, selecione a opção &quot;Z projecção&quot; e digite &quot;1&quot; como a fatia de início e &quot;4&quot;, como fatia stop. Para o tipo de projeção, selecione R20; fatias sum &quot;no menu suspenso e escolha&quot; Todos os prazos &quot;. </li></ol></li><li> Definir a região de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar um limite em torno de um corpo celular ou projeção neuronal. Clique na etiqueta &quot;Analisar&quot; e selecione a opção &quot;Gerenciador de ROI&quot; em &quot;Ferramentas&quot;. </li><li> Quantificar a fluorescência do ROI selecionando a opção &quot;Definir medidas&quot;, no menu &quot;Analisar&quot; e marcando as caixas para a densidade integrada, área, valor médio e valor máximo de cinza e etiqueta. Em seguida, selecione a opção &quot;Mais&quot; no menu gerenciador de ROI e selecione ainda a opção &quot;medida Multi&quot;. Nota: Isto vai gerar uma caixa pop-up com valores para cada um dos parâmetros seleccionados. </li><li> Verificar os valores de cinzento máximos para assegurar que nenhum dos pixels ter atingido a saturação (por exemplo, 65535 para uma câmara de 16 bits). NOTA: Para as experiências mostradas na tseus papel, as respostas foram medidas quer a partir de corpos celulares ou projecções neuronais, dependendo de onde foi observado o aumento máximo em Af / F. </li><li> Calcula-se a alteração máxima na fluorescência relativa (Af / F) no ponto de tempo t é o seguinte: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Subtrair o fundo de fluorescência a partir de cada valor de F (célula). Para quantificar a fluorescência de fundo, medir a densidade integrada de uma ROI de tamanho e forma equivalente a partir de uma área da pata dianteira (ou tromba) destituída de neurónios detectáveis. </li><li> Para quantificar a pós-estimulação de fluorescência, F (célula) t, medir a densidade integrada do ROI do corpo da célula ou processo no ponto de tempo &quot;t&quot;, após a estimulação. </li><li> Para quantificar a fluorescência pré-estimulação, F (célula) t = 0, análise de imagens pré-estímulo do corpo da célula ou processo da mesma forma comoo sinal pós-estimulação. Use a densidade integrada média de 3 imagens para determinar F (celular) t = 0. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that there are no competing financial interests.

Descrevemos aqui um método para realizar imagem de cálcio ao vivo de neurônios periféricos Drosophila em 2 órgãos sensoriais diferentes. O Ca 2+ -evoked respostas fluorescentes GCaMP em Gr68a-neurônios induzida pelo ligando feromônio CH503 foram dose-dependentes e quantitativa. Também foi possível discernir diferentes padrões de resposta neural, tais como fásicas e tônicas respostas. Neurônios que mostram respostas fásicas são acreditados para permitir uma...

Animais confiar na informação olfativa e gustativa para mediar decisões essenciais para a sobrevivência e reprodução. Entender como pistas quimio são detectados e processados ​​pelo sistema nervoso exige a identificação do receptor sensorial (s) e os ligandos químicos correspondentes. Drosophila detectar uma variedade impressionante de compostos voláteis e não-voláteis e são um excelente modelo para estudar o fisiológica mecanismos subjacentes chemosensation. Enquanto os órgãos olfactivos perceber moléculas voláteis, os órgãos gustativas são especializados para detectar compostos de baixa volatilidade. Aqui, apresentamos um método para medir diretamente as respostas neuronais dos órgãos gosto de Drosophila melanogaster a baixa volatilidade, ligantes lipofílicos. órgãos gustativos da mosca incluem os anteriores, tromba, e asas. Distribuído sobre a superfície dos órgãos gustativas são estruturas semelhantes a cabelos conhecidos como sensilas que respondem a sugars, bitters, sais, água e feromônios 8. O sensilla foram classificados morfologicamente em cerdas de gosto e sabor pinos 9. Há cerca de 31 cerdas gosto no labelo que são classificados em A longo (tipo L), curto (s-tipo) e morfologias intermediários (-tipo I). Sensilla casa 4 neurônios sensoriais Os &#39;L&#39; e &#39;S&#39; que respondem fisiologicamente ao açúcar (a célula S), baixo teor de sal (a célula L1), alta sal e compostos amargos (a célula L2) e água (a célula W) 10 , 11. O &quot;eu&quot; casa 2 neurônios sensilla sensoriais, uma das quais responde tanto à baixa sal e açúcar, enquanto que outro que responde à elevada de sal 12. Há aproximadamente 41 sensilas sabor em machos e fêmeas em 26 sensilas distribuídos em cada uma das pernas dianteiras. Para ambos os sexos masculino e feminino, há 21 sensilas na midleg, e cerca de 22 sensilas na hindleg 13. Os neurônios gustativos fechados pela sensilla gosto nas pernas também são classified em tipos de L1, L2, W e S. Um método padrão para medir a atividade elétrica dos neurônios individuais utiliza eletrodos extracelulares ou intracelulares para gravar o fluxo de íons. Medições dos eléctrodos permitem função neuronal a ser estudado em organismos não-modelo como as espécies Drosophila, mariposas, abelhas e que não possuem extensas ferramentas genéticas para a rotulagem neural. No entanto, enquanto os métodos eletrofisiológicos têm sido rotineiramente usado para medir a atividade de Drosophila gosto sensilla 4,13,14, aplicando esta abordagem apresenta vários desafios técnicos. Primeiro, gosto cerdas precisam ser identificados com base na morfologia e localização espacial. Após a identificação, medidas eletrofisiológicas pode ser prejudicado pela pequena dimensão do sensilla, limitando a acessibilidade devido à posição e dificuldade em aplicar volumes controladas de um estímulo químico a um gosto de cerdas. Além disso, a estimulação de sensilas podem gerar sinais a partir de mais do que umneuronal tipo 15. Em segundo lugar, a detecção de sinais elétricos podem ser confundidos com o ruído de fundo resultantes das vibrações mecânicas e ruído de equipamentos eletrônicos. Em terceiro lugar, a utilização de um eléctrodo afiado pode danificar a preparação mosca, se utilizado incorrectamente 14. Finalmente, a montagem de uma plataforma de eletrofisiologia requer componentes eletrônicos especializados para a entrega de estímulo, gravação de sinal e análise de dados e pode ser caro. Em D. melanogaster, a disponibilidade de ferramentas geneticamente codificados tem facilitado o desenvolvimento de técnicas de imagiologia que permitem que as respostas de pequenas populações de neurónios a ser estudado. Uma tal abordagem é a utilização do repórter CaLexA 16. Neste método, as sequências de gene que codifica o factor de transcrição VP16-LexA e uma proteína NFAT sensível ao cálcio são fundidos em conjunto. activação de cálcio da calcineurina fosfatase proteína catalisa a fosforilação de de-NFAT e, por sua vez, a FacilitaTES sua importação para o núcleo. No interior do núcleo, o domínio de LexA se liga a um motivo de ligação a DNA-LexAop que dirige a expressão de uma proteína fluorescente verde repórter (GFP), permitindo assim a identificação de neurónios sustentada funcionalmente activado. A abordagem tem sido utilizada com sucesso para medir a resposta de glomérulos olfactiva específica no lobo antenal após a exposição das moscas ao vivo a um odorante 16. Recentemente, as respostas fisiológicas de neurônios receptores gustativos IR52c foram medidos a partir moscas ao vivo usando CaLexA 7. No entanto, para este estudo, foi necessário moscas de idade para até 6 semanas para aumentar a transcrição GFP. Enquanto a imunocoloração com um anticorpo anti-GFP podem ser usadas para aumentar o sinal CaLexA, este método exige a fixação do tecido, evitando, assim, possibilidade de processamento de imagem de células vivas. O cálcio GCaMP proteína indicadora geneticamente codificado também tem sido amplamente utilizado para estudar as respostas neuronais em váriosespécies 17. O GCaMP proteína fluorescente com baixa intensidade antes da estimulação neuronal. Aplicação de um estímulo desencadeia um potencial de acção no neurónio, resultando no influxo de Ca 2+. GCaMP, ligado ao Ca2 +, sofre uma alteração conformacional, fazendo com que a fluorescência com intensidade mais brilhante (Figura 1). Uma abordagem de imagem de cálcio para neurónios único recentemente desenvolvido foi utilizado para identificar a glicose como o ligando para os neurónios pata dianteira gustativos Gr61a específicos 18. Neste estudo, pernas dianteiras dissecados de Drosophila transgênicos expressando GCaMP em neurônios gustativos Gr61a foram cobertos com uma camada de agarose antes da imagem. No entanto, a utilização de tecido dissecado pode causar eventual degradação de expressão GCaMP, limitando, assim, o tempo de medição e detecção de sensibilidade. Além disso, agarose pode limitar a sensibilidade devido aos altos níveis de fundo de fluorescência e suas propriedades de dispersão de luz. To abordar alguns destes inconvenientes, descrevemos o uso de imagem de cálcio GCaMP mediada para gravar as respostas fisiológicas de pata dianteira e tromba neurônios gustativas de animais intactos. Mostramos as respostas fisiológicas de Gr68a e neurónios que expressam ppk23 geneticamente codificado GCaMP5G 19 a uma feromona de lípidos de Drosophila, (3R, 11 Z, 19, Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. respostas neuronais são medidos por quantificação do aumento na fluorescência do sinal GCaMP5G durante a estimulação de feromonas. Neste protocolo, os neurônios são gravadas para uma duração total de 120 segundos, o que é suficiente para diferenciar padrões de ativação neuronal em células individuais.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

Ao contrário dos mamíferos, insetos, como Drosophila têm múltiplos órgãos gustativas. Os neurônios quimio nas pernas, tromba, asas e ovipositor de Drosophila expressam receptores gustativos 1,2, canais iônicos 3-6 e receptores ionotrópicos 7 que estão envolvidos na detecção de sinais sensoriais voláteis e não-voláteis. Esses neurônios contactar directamente tastants, como alimentos, substâncias nocivas e feromonas e, portanto, influenciar muitos comportamentos complexos, tais como alimentação, postura de ovos e acasalamento. gravações dos eléctrodos e imagem de cálcio têm sido largamente utilizados em insectos para quantificar as respostas neuronais evocados por estes saborizantes. No entanto, eletrofisiologia exige equipamento especializado e medições obtenção de um único sensillum gosto pode ser tecnicamente desafiador, dependendo do tipo de célula, tamanho e posição. Além disso, a única resolução neurônio em Drosophila pode ser difícil de alcançar, uma vez hou gosto sensillase mais de um tipo de neurônio quimio. O método de imagem de cálcio ao vivo descrito aqui permite respostas dos neurônios gustativas de solteiro em moscas ao vivo a ser medido. Este método é especialmente adequado para imagiologia de respostas neuronais a feromonas de lípidos e outros tipos de ligandos que têm baixa solubilidade em solventes à base de água.

O indicador de cálcio GCaMP foi geneticamente expressa usando drivers ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 ou. Populações distintas de neurónios e células perna dianteira de suporte não neurais são rotulados por cada controlador (Figura 3A-C). Respostas específicas do ligando ao CH503 feromona lipofílico foram observadas em Gr68a-Gal4 e células expressando Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). A mudança relativa na intensidade de fluorescência do sinal GCaMP5G <...

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Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Medindo respostas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios sensoriais para Lipid feromonas Usando Imagem de cálcio ao vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K visualizações.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

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Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Carregando Drosophila terminais nervosos com indicadores de cálcio

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Biologia

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imagens de cálcio de odor-provocou respostas no Drosophila Lobo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociência

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In vivo Optical cálcio Imaging de aprendizagem induzida por plasticidade sináptica em Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

Source:&#160;<a style='text-decoration:none;' href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57701/ex-vivo-calcium-imaging-for-visualizing-brain-responses-to-endocrine-signaling-in-drosophila'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Ishimoto, H.&#160;et. al.,<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila.&#160;J. Vis. Exp.<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> (2018)</a> &#160;This video demonstrates calcium imaging to study&#160;Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Source:&#160;Ishimoto, H.&#160;et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila.&#160;J. Vis. Exp. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuroimaging

Live Imaging & In Vivo Tracking

Bioluminescence Imaging for Studying Calcium Transients in Drosophila Brain Structures

Source:&#160;Lark, A. R.,&#160;et. al.,&#160; In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin.&#160;J. ...

Synaptic & Cellular Imaging

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Hancock, C. E. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60288">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

in vivo Imagens de cálcio usando sensores de cálcio localizados sinapticamente em Drosophila melanogaster

1. Transgenic fruit flies,&#160;Drosophila melanogaster

	Cross female virgin and male flies (raised at 25 &#176;C in 60% relative humidity on a 12 h ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

Drosophila In Vivo Imagem de cálcio: um método para imagem funcional da atividade neuronal

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
...

Medindo respostas fisiológicas de

Resumo

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