The authors would like to acknowledge the University of Lille and the Pasteur Institute of Lille, especially Thierry Chassat and Jean-Pierre Decavel, responsible for animal housing breeding safety and husbandry. This work was supported by the "Soci&#233;t&#233; de Pathologies Infectieuses de Langue Fran&#231;aise" (SPILF).

A ética regionais comitê regional de experimentos com animais aprovou este método, de acordo com atenção nacional e internacional de animais e uso de diretrizes de pesquisa experimentais. Coleção 1. Amostra <ol><li> Armazenamento das amostras <ol><li> Colher todas as amostras e imediatamente armazenar a - 20 ° C ou em gelo até o armazenamento do congelador para evitar a deterioração. Coloque fosfato estéril tamponado salino (PBS) em gelo para melhorar lavagens bronco-alveolar desempenho (BAL). </li></ol></li><li> Cirurgia <ol><li> Esterilizar todos os equipamentos cirúrgico usando um autoclave. NOTA: Se possível, recomenda-se usar dois diferentes conjuntos de instrumentos para as etapas abdominal e torácica para evitar a contaminação cruzada. Equipamento de dissecção necessárias é detalhado na Figura 4A </li></ol></li></ol> 2. Mice, bacterianas e de levedura Estirpes <ol><li> Os ratos domésticos em conformidade com a utilização de animais em locais reDirectrizes do comitê de pesquisa em um rack ventilado sem exceder 5 ratos por gaiola, com comida e água ad lib, em uma instalação de alojamento nível de biossegurança 2 devido ao uso de Nível de Biossegurança 2 microrganismos: P. aeruginosa e C. albicans. </li><li> Manter as estirpes bacterianas a -80 ° C em 40% de meio de glicerol. <ol><li> Adicionar bactérias diretamente do estoque congelado em tubo de cultura contendo 3 ml de caldo de Luria estéril-Bertani usando um loop de inoculação de 10 ul. Deixar O / N a 37 ° C com agitação orbital (400 rpm) no dia antes da instilação. </li><li> Colheita bactérias por centrifugação a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante para uma eliminação de resíduos perigosos fechado apropriado. Observar aderente sedimento branco no fundo do tubo de cultura. </li><li> Lavar e suspender o sedimento utilizando 5 ml de PBS. </li><li> Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem. </li><li> Ressuspender as bactérias sedimentadas utilizando 1 mL de PBSe breve vórtice. </li><li> Determinar a densidade de inoculo usando densitómetro óptica a 600 nm utilizando um medidor de densidade óptica. Uma densidade de 0,9 corresponde a 10 9 CFU / ml para PAO1, dilui-se em conformidade. NOTA: Este resultado tem que ser obtida para cada estirpe utilizada por determinação da densidade de diluições sucessivas de um inoculo calibrado. </li><li> Verifique se o inóculo por diluições logarítmicas em série e placa 100 ul de cada diluição em agar roxo bromocresol (BCP) placas e cultura O / N. Administrar cada ratinho por via intranasal a 50 ul de solução contendo 1 x 10 8 para 2 x10 8 CFU por ml (5 x 10 6 para 1 x 10 7 CFU por ratinho). </li></ol></li><li> Use C. albicans SC5314 como uma estirpe de referência. Conserve a estirpe em 40% de meio de glicerol a -80 ° C. <ol><li> Suplemento caldo de levedura-peptona-Dextrose com 0,015% de amicacina para evitar a contaminação bacteriana e facilitar ainda mais a contagem. </li><li> Adicione o fermento usando 10 &amp;# 181; l laço inoculação em caldo preparado YPD-suplementado com amicacina O / N a 37 ° C. </li><li> Levedura colheita por centrifugação a 2000 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante em uma eliminação de resíduos bioharzard apropriado. Branco aderente sedimento deve ser observado na parte inferior do tubo de cultura. </li><li> Lave e suspender as bactérias peletizadas usando 5 ml de PBS e breve vórtice. </li><li> Repita os passos 2.2.2 a 2.2.3 uma segunda vez para efectuar uma segunda lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento utilizando 1 mL de PBS e breve vórtice. </li><li> Determinar o tamanho do inoculo pela contagem num hematocytometer Mallassez usando um microscópio padrão em ampliação de 40x. NOTA: A concentração (em UFC / ml) é obtido usando a seguinte fórmula: (número de levedura 5 x 10) / (número de rectângulos de grelha contados no hematocytometer Mallassez). </li><li> Verifique por diluição em série logarítmica a 10 -5 e -6 10 para confirmar que a solução contém 2 x 10 6 CFU / mL. </li><li> Placa em placas de YPD-agar suplementado com 0,015% de amicacina. </li></ol></li></ol> 3. Airways Colonização por C. albicans NOTA: Depois de adaptação ambiental, os ratos são pesados ​​duas vezes por dia. <ol><li> Sob um exaustor, para depósito de 500 mL de sevoflurano em um 4 cm x 4 cm de gaze (técnica-drop aberto) 14. <ol><li> Colocar imediatamente a gaze sobre o chão de uma câmara de aproximadamente 750 ml de indução. Imediatamente coloque uma plataforma elevada de malha acima da gaze para evitar o contato direto entre o animal ea gaze. </li><li> Feche tampa hermética e esperar 1-2 min para permitir a difusão do sevoflurano na câmara. </li><li> Transferir o mouse de gaiola em malha plataforma e feche a tampa. Anestesia leve com respiração espontânea conservado deve ser alcançado em 30 a 45 seg. </li><li> Monitor para hipotonia, observando a perda do reflexo de endireitamento altura em que o rato pode ser removido from da caixa e incutiu. </li></ol></li><li> Instilação intranasal (pode ser realizada em 10 segundos por um operador treinado). <ol><li> Segure o mouse com uma mão situado em sua parte traseira em posição vertical (Figura 4B). </li><li> Usando o dedo indicador, o apoio de cabeça e usar o polegar para manter a mandíbula fechada para evitar a expectoração (Figura 4C). </li><li> Conforme descrito no passo 2.3.8, garantir que o preparado C. albicans solução contém 2 x10 6 CFU por ml durante 50 ul incutidos volume. NOTA: O segundo ponto crítico é o volume instilado. Um volume menor do que 50 ul poderia resultar em uma colonização insuficiente ou instilação não homogêneo de vias aéreas, um volume maior pode induzir afogamento / asfixia e morte. </li><li> Incutir o mouse intra-nasal, abordando a pipeta para as narinas. </li><li> Pipetar uma gota de 50 ul a formação de uma bolha contendo a solução sobre as narinas, posteriormente inalada pelo spontaneously do mouse respiração. </li><li> Coloque o rato em uma área de recuperação (por exemplo, uma gaiola grande nu bem arejada com uma lâmpada de aquecimento em cima). Os ratos devem ser monitorizados até despertar completo. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal e reflexo de endireitamento. Neste ponto, o rato pode ser retornado para uma gaiola de habitação normal. </li></ol></li></ol> 4. P. aeruginosa induzida por infecção pulmonar aguda NOTA: Os ratos são pesados ​​durante os quatro dias seguintes. Normalmente, os ratos ganhar peso durante C. colonização das vias aéreas mediada albicans (Figura 2A). <ol><li> Preparar a suspensão contendo P. aeruginosa o dia da instilação depois de O crescimento / N (ponto 2.2). </li><li> Anestesiar brevemente utilizando inalado sevoflurano como descrito acima (seção 3.1). NOTA: Para executar infecção pulmonar aguda, recomenda carga bacteriana são sugeridas emTabela 1. </li><li> Incutir o rato como descrito acima (seção 3.2), com especial atenção à recuperação pós-instilação. </li></ol> 5. Meça do Índice de Lesão Pulmonar <ol><li> Prepara-se uma solução contendo albumina marcado com FITC. Injectar a solução 2 h antes de eutanásia animal. <ol><li> Pesar 0,2 mg de albumina-FITC com o equipamento apropriado. </li><li> Adicionar 0,2 mg em 1 ml de PBS. Vortex brevemente. Se não for utilizado imediatamente, colocar a solução em papel alumínio para evitar a exposição à luz ambiente. </li><li> Injectar intraperitonealmente 200 ul de solução de albumina marcada com FITC a cada rato. </li></ol></li><li> Eutanásia <ol><li> Pesa-se a ratinhos para o último os dados de peso. </li><li> Euthanize um único rato de acordo com o uso local de animais em orientações do comitê de investigação que usam uma injeção intra-peritoneal de uma overdose letal de pentobarbital: 300 ï¿½ de 5,47% pentobarbital. </li><li> Remover rato da gaiola e recebe linjeção Ethal pelo operador. </li><li> Após a injecção, transferir o mouse sozinho para outra gaiola, escondido de todos os outros animais. Observe o mouse até ausência de movimento. Confirmar a morte é por falta de movimento, movimento particularmente respiratória, falta de pulso. </li><li> Realizar a coleta cirúrgica de amostras em animais mortos, portanto, sem anestesia nem analgésicos. </li></ol></li><li> Coleta de amostra cirúrgica: Estágio Torácica. NOTA: Para manter condições estéreis, toda a cirurgia é realizada utilizando equipamento estéril em um ambiente de nível de biossegurança 2. <ol><li> Aplicar etanol para a pele. Realize uma incisão na pele da linha média do esterno até meados abdômen com uma tesoura. De incise linha média ao longo da caixa torácica em ambos os lados. Dobra-se a pele de ambos os lados do tórax para visualizar a caixa torácica. </li><li> Realizar uma incisão vertical da caixa torácica em ambos os lados subindo em direcção ao clavícula, a fim de ser capaz de reclinar a parede torácica anterior com toda a popaUM permitindo a visualização perfeita do coração e pulmões (Figura 5A, 5B). </li><li> Recolha de sangue com uma seringa pré-heparined através de punção do coração próxima à artéria interventricular. Retirar um mínimo de 500 ul para se obter, pelo menos, 100 uL de plasma. Coloque a amostra de sangue no gelo. </li><li> Realize uma incisão cervical na linha média para visualizar a traquéia (Figura 5B e 5C). Dissecar cuidadosamente a fáscia em torno da traquéia. Coloque um sutura atrás da traqueia (Figura 5C e 5D). Posteriormente, a sutura será fechada em torno da agulha canulação para assegurar a lavagem adequada. </li><li> Cateterize a traqueia usando a 20-G modificado agulha de gavagem (Figura 5D e 4A). Dê um nó cirúrgico em torno da traqueia canulada com a sutura previamente colocado. </li><li> Para executar lavagens broncoalveolares (LBA), suavemente e progressivamente injectar e extrair 500 ul de PBS gelado no / do pulmão. Colocar a amostra no ice para evitar a lise celular. </li><li> Repetir o passo 5.3.6, 3 vezes para se obter um total de 1500 ul de fluido BAL e piscina amostras de lavagem para um tubo de centrífuga de 2 ml (Figura 5E). </li><li> Remova os pulmões do peito. Coloque um segmento do pulmão (o tamanho que correspondem à metade de um pulmão ou um lóbulo) em 1,5 ml tubo de centrífuga e armazenar rapidamente a - 80 ° C. </li><li> Coloque um segmento de pulmão em um tubo de hemólise pré-pesado contendo PBS para determinar a carga bacteriana e colocá-lo em gelo. </li></ol></li><li> Coleta de amostra cirúrgica: Estágio abdominal. <ol><li> Execute outra incisão no lado esquerdo do abdômen. Observe o baço através do peritônio. </li><li> Remover o baço e coloque em um segundo tubo de hemólise contendo 1 ml PBS e colocar no gelo. </li></ol></li><li> Lung índice de lesão NOTA: a permeabilidade da membrana alvéolo-capilar é avaliada por medição marcado com FITC-albumina vazamento do compartimento vascular para o alvéolo-interstcompartimento itial. <ol><li> Centrifugar amostra de sangue e fluido BAL durante 10 min a 1.500 x g. Recolher os sobrenadantes para novos tubos de centrífuga. As pelotas de células de plasma correspondem a ou BAL recrutados e deve ser colocado sobre gelo. </li><li> Adiciona-se 100 ul de cada sobrenadante de sangue (plasma, amarelo) ou BAL sobrenadante para uma placa de 96 poços transparentes (300 ul poços). Coloque uma folha sobre a placa se não for usado imediatamente. </li><li> Medir os níveis de fluorescência do plasma e em sobrenadantes de BAL utilizando um leitor de microplacas de fluorescência (excitação, 487 nm; emissão, 520 nm). </li><li> Determinação do índice de lesão pulmonar por meio do cálculo da taxa de fluorescência [(BAL sobrenadante / sangue sobrenadante) x 100]. </li></ol></li><li> Lavagem (BAL) contagem de células broncoalveolares diferencial. NOTA: Use o agregado de células obtidas a partir de centrifugação do LBA no passo 5.5.1. <ol><li> Se necessário, use-tampão de lise de glóbulos vermelhos. Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas no tubo de centrífuga contendo o cell pellet. Resumidamente vórtice e deixar 10 min em gelo. Adicionar 500 mL PBS para parar de lise de células vermelhas. </li><li> Células colheita por centrifugação durante 10 min a 1.500 x g. Remover o sobrenadante e suspender o sedimento de células em 1 ml de PBS estéril. Enumerar as células em um hematocytometer Mallassez. Usando um hemocitômetro para contagem de células. Concentre-se as células em um slide com uma cytospin. </li><li> Células mancha usando kit coloração permitindo a identificação e contagem de células (macrófagos, linfócitos, neutrófilos). </li></ol></li><li> Lung carga bacteriana e disseminação bacteriana NOTA: Para avaliar a carga bacteriana pulmão e disseminação de bactérias, pulmões e baço foram, respectivamente, recolhidos e armazenados em tubos de hemólise pré-pesadas contendo 1 ml de PBS (passo 5.3.9). <ol><li> Pesar tubos de hemólise contendo 1 ml PBS e ou pulmonares ou do baço. Homogeneizar as amostras com um homogeneizador de tecidos para se obter tecidos de pulmão homogeneizados de baço e homogeneizados. </li><li> Deposite 100 l de homo tecidogenates em tubos de centrífuga contendo 900 ul de PBS estéril para obter diluições logarítmicas em série. </li><li> Placa das duas últimas amostras diluídas adequadas (10 -3 e 10 -2) em ambos BCP-agar para P. aeruginosa ou agar YPD-amicacina suplementado para C. albicans pulmão e baço determinação carga. </li><li> Incubar as placas de O / N a 37 ° C. No dia seguinte, enumerar as colónias em placas. </li><li> Índice o resultado ao peso do pulmão para obter uma CFU por grama de pulmão. O tamanho das amostras de pulmão não são os mesmos, os resultados são expressos em CFU por grama de pulmão. Fórmula para o índice é: [UFC] x [peso do tubo de hemólise e de pulmão] - [peso do tubo de hemólise]. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Modelos animais, particularmente mamíferos, são úteis para elucidar os mecanismos complexos de interacção hospedeiro-patogénio nas áreas de imunidade. Claro, a necessidade de informações obtidas somente a partir de modelos animais deve ser essenciais; caso contrário, a utilização de animais devem ser substituídos por modelos in vitro. Este modelo animal ilustra a percepção de que só pode ser fornecida por um modelo animal uma vez que a interacção entre agentes patogénicos é mediada por uma r...

Os modelos animais, especialmente ratinhos, têm sido extensivamente utilizados para explorar as respostas imunitárias contra os agentes patogénicos. Embora a imunidade inata e adquirida diferem entre roedores e humanos 7, a facilidade na criação e no desenvolvimento de nocautes para numerosos genes, fazer camundongos um excelente modelo para estudar as respostas imunes 8. A resposta imune é complexo e resulta da interacção de um agente patogénico, da flora residente microbianas e vários imune (linfócitos, neutrófilos, macrófagos) e não-imune (células epiteliais, células endoteliais) tipos celulares 2. Os estudos in vitro não permitem observar essas interações complexas e centrar-se principalmente nas interações célula-patógeno únicas. Enquanto modelos animais deve ser utilizado com precaução e limitada a questões muito específicas e relevantes, modelos de ratos proporcionam uma boa perspectiva sobre a resposta imune mamífero in vivo e pode dirigir peças de questões clínicas importantes 7. 6. Enquanto que constitui um microbiome &quot;normal&quot; via aérea continua a ser determinado, comunidades residentes são frequentemente polimicrobiana, e originam a partir de diversas fontes ecológicos. Os pacientes com doença crônica supurativa pulmonar (fibrose cística, bronchectasis) ou pacientes sob ventilação mecânica apresentam uma flora especial devido à colonização das vias aéreas por microrganismos ambientalmente adquiridos 9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são ambos problema patógenos 5, freqüentemente isolado em conjunto a partir de amostras traqueobrônquicos , e responsável de infecção oportunista grave nesses pacientes, especialmente na unidade de terapia intensiva (UTI) 4. O isolamento desses microrganismos durante pneumonia aguda em resultados de UTI no tratamento anti-microbiano contra P. b aeruginosaut levedura geralmente não são considerados patogênicos neste local 5. in vitro interações entre P. aeruginosa e C. albicans têm sido amplamente relatado e mostraram que esses microrganismos podem afectar o crescimento e a sobrevivência de outro, mas estudos não foi possível concluir se a presença de C. albicans é prejudicial ou benéfica para o hospedeiro 10. Mouse modelos foram desenvolvidos para abordar esta relevância do P. aeruginosa e C. albicans in vivo, mas a interação entre microrganismos não foi o ponto-chave. De facto, o modelo foi estabelecido para avaliar o envolvimento da C. albicans na resposta imune do hospedeiro, e resultado. Um modelo anterior estabelecida por Roux et ai já utilizada uma colonização inicial com C. albicans seguido de uma infecção pulmonar aguda induzida por P. aeruginosa. Usando seu modelo, os autores encontraram um papel deletério da prior C. albicans colonização 11. No entanto Roux et al utilizaram uma carga elevada de C. albicans em seu modelo com 2 x 10 6 CFU / rato durante 3 dias consecutivos. Nós estabelecemos um modelo de 4 dias de C. colonização das vias aéreas albicans, ou pelo menos persistência sem lesão pulmonar, Neste modelo C. albicans foi recuperado até 4 dias após uma única instilação de 10 5 CFU por ratinho (Figura 2B) 12,13. Após 4 dias, não se observou qualquer evidência de recrutamento de células inflamatórias, a produção de citoquinas inflamatórias, nem dano epitelial. Em 24-48 horas, na presença de pico de C. albicans, apesar de uma resposta imune inata celular e de citoquina foi observada, não houve evidência de lesão pulmonar. Surpreendentemente, os murganhos assim colonizada com C. albicans 48 horas antes da instilação intranasal de P. aeruginosa tinham infecção atenuada em comparação com ratinhos com P. aeruginosa infecção sozinho. Euom efeito, os ratinhos exibiram menor lesão pulmonar e diminuição da carga bacteriana 12,13. Várias hipóteses poderiam explicar o efeito benéfico da colonização prévia com C. albicans em P. aeruginosa mediada por infecção pulmonar aguda. Primeiro, um cross-talk entre espécies envolvendo cada microorganismos sistemas de sensoriamento quorum, o P. baseada homoserinelactone sistema aeruginosa e C.-base de farnesol sistema albicans, foram avaliados. Em segundo lugar, C. foi estudada albicans agindo como um alvo &quot;chamariz&quot; para P. aeruginosa desviar o agente patogénico a partir de células epiteliais do pulmão. Ambas as hipóteses foram invalidados (dados não publicados). A terceira hipótese era a de um &quot;priming&quot; do sistema imune inato por C. albicans responsável por uma resposta inata subsequente reforçada contra P. aeruginosa. Esta última hipótese foi confirmada. Na verdade C. colonização albicans levou a uma iniciação da imunidade inata atraGH IL-22, segregada principalmente pelas células linfóides inatos, resultando num aumento da depuração bacteriana e reduziu a lesão pulmonar 12. Em conclusão, o anfitrião é um ator central na interação entre microrganismos modulação da resposta imune inata e que envolvam diferentes tipos de células inflamatórias. Embora estas interacções imunes complexas podem ser dissecados in vitro as hipóteses iniciais só pode ser fornecida por adequado em modelos in vivo. O protocolo seguinte fornece um exemplo de estudo in vivo de interacção hospedeiro-patogénio mediada que pode ser adaptado a outros microrganismos.

<table><tbody><tr><td>Sevorane, Sevoflurane</td><td>Abott</td><td>05458-02</td><td>250 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>Fluorescence Reader Mithras&amp;nbsp; LB940</td><td>Berthold Technologies</td><td>reference in first column</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Bromo-cresol purple agar</td><td>Biomerieux</td><td>43021</td><td>20x per unit</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodique 5.47%</td><td>CEVA</td><td>6742145</td><td>100 ml plastic bottle</td></tr><tr><td>2-headed valve&amp;nbsp;</td><td>Distrimed</td><td>92831</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Sterile inoculation loop 10 &amp;micro;l</td><td>Dutscher</td><td>10175</td><td>x1,000 conditioning</td></tr><tr><td>Insuline syringes 1 ml</td><td>Dutscher</td><td>30003</td><td>per 100 conditioning</td></tr><tr><td>2 positions Culture tube 8 ml</td><td>Dutscher</td><td>64300</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Ultrospec 10&amp;nbsp;</td><td>General Electric life sciences</td><td>80-2116-30</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Hemolysis tubes 13 x 75 mm&amp;nbsp;</td><td>Gosselin</td><td>W1773X</td><td>per 100</td></tr><tr><td>PBS - Phosphate-Buffered Saline</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td>packaged in 500 ml</td></tr><tr><td>amikacin 1 g</td><td>Mylan</td><td>62516778</td><td>per 10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin 10,000 UI in 2 ml</td><td>Pan pharma</td><td>9128701</td><td>10x per unit</td></tr><tr><td>RAL 555 coloration kit</td><td>RAL Diagnostics</td><td>361550</td><td>3 flacons of 100 mL</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td>x 1000</td></tr><tr><td>Transparent 300 &amp;micro;l 96-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>82 1581500</td><td>no comment</td></tr><tr><td>Yest-peptone-Dextrose Broth</td><td>Sigma</td><td>95763</td><td>in powder</td></tr><tr><td>FITC-albumin</td><td>Sigma</td><td>A9771</td><td>in powder</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>in powder</td></tr><tr><td>25-gauge needle</td><td>Terumo or unisharp</td><td>A231</td><td>x 100 conditioning</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>no comment</td></tr></tbody></table>

studying microbial communities in vivo: a model of host-mediated interaction between candida albicans and pseudomonas aeruginosa in the airways

Estudar interação patógeno-hospedeiro nos permite compreender os mecanismos subjacentes da patogenicidade durante a infecção microbiana. O prognóstico do hospedeiro depende do envolvimento de uma resposta imune contra o patógeno adaptado 1. A resposta imune é complexo e os resultados a partir da interação dos agentes patogénicos e vários tipos celulares imunes ou não imunes 2. Os estudos in vitro não pode caracterizar essas interações e foco em interações celulares-patógeno. Além disso, nas vias aéreas 3, particularmente em doentes com doença pulmonar crônica supurativa ou em pacientes sob ventilação mecânica, comunidades polimicrobianas estão presentes e complicar interação patógeno-hospedeiro. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans são tanto problema patógenos 4, freqüentemente isolado de amostras traqueobrônquicas, e associado a infecções graves, especialmente na unidade de cuidados intensivos 5. Interações microbianas temfoi relatado entre esses patógenos in vitro, mas o impacto clínico destas interações ainda não está claro 6. Para estudar as interações entre C. Albicans e P. aeruginosa, um modelo de murino de C. colonização albicans vias aéreas, seguido de um p infecção pulmonar aguda mediada aeruginosa- foi realizada.

Como visto anteriormente durante a descrição do protocolo, o experimento precisa de cinco dias para ser concluído (Figura 1: Experiência linha do tempo). Um operador é solicitado durante toda a execução do experimento e pode lidar com os processos até um máximo de 10 ratos. Se forem necessários mais animais, duas pessoas são necessários particularmente para coleta de amostras cirúrgico. Na verdade todas as amostras devem ser recolhidos em menos de 2 horas para evitar um aumento da fuga de a...

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Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

8.4K visualizações.  Université Lille. While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

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Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Imunologia e Infecção

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crônica de Longo Prazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infecção das vias aéreas em ratos

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans biofilms have been studied predominantly in vitro but there is a crucial need for better understanding of this dynamic process under in vivo conditions. We developed an in vivo subcutaneous rat model to study C. albicans biofilm formation. In our model, multiple (up to 9) Candida-infected devices are implanted to the back part of the animal. This gives us a major advantage over the central venous catheter model system as it allows us to study several independent biofilms in one animal. Recently, we adapted this model to study C. albicans biofilm development in BALB/c mice. In this model, mature C. albicans biofilms develop within 48 hr and demonstrate the typical three-dimensional biofilm architecture. The quantification of fungal biofilm is traditionally analyzed post mortem and requires host sacrifice. Because this requires the use of many animals to perform kinetic studies, we applied non-invasive bioluminescence imaging (BLI) to longitudinally follow up in vivo mature C. albicans biofilms developing in our subcutaneous model. C. albicans cells were engineered to express the Gaussia princeps luciferase gene (gLuc) attached to the cell wall. The bioluminescence signal is produced by the luciferase that converts the added substrate coelenterazine into light that can be measured. The BLI signal resembled cell counts obtained from explanted catheters. Non-invasive imaging for quantifying in vivo biofilm formation provides immediate applications for the screening and validation of antifungal drugs under in vivo conditions, as well as for studies based on host-pathogen interactions, hereby contributing to a better understanding of the pathogenesis of catheter-associated infections.

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

We present an experimental procedure of Candida albicans biofilm development in a mouse subcutaneous model. Fungal biofilms were quantified by determining the number of colony forming units and by a non-invasive bioluminescence imaging, where the amount of light that is produced corresponds with the number of viable cells.

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Medicina

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Estabelecendo um modelo de camundongo para PJI relacionada ao biofilme de Candida albicans

A Periprosthetic Joint Candida albicans Infection Model in Mouse

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and scientists. Generally, biofilms that can shield C. albicans from antibiotics and immune clearance are formed at the infection site. Surgery involving the removal of the infected implant, debridement, antimicrobial treatment, and reimplantation is the gold standard for the treatment of PJI. Thus, establishing animal PJI models is of great significance for the research and development of new drugs or therapeutics for PJI. In this study, a smooth nickel-titanium alloy wire, a widely used implant in orthopedic clinics, was inserted into the femoral joint of a C57BL/6 mouse before the C. albicans were inoculated into the articular cavity along the wire. After 14 days, mature and thick biofilms were observed on the surface of implants under a scanning electronic microscope (SEM). A significantly reduced bone trabecula was found in the H&amp;E staining of the infected joint specimens. To sum up, a mouse PJI model with the advantages of easy operation, high successful rate, high repeatability, and high clinical correlation was established. This is expected to be an important model for clinical studies of C. albicans biofilm-related PJI prevention.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa sobre infecções articulares protéticas associadas ao biofilme de Candida albicans 

Periprosthetic joint infection (PJI) caused by dangerous pathogens is common in clinical orthopedics. Existing animal models cannot accurately simulate the actual situation of PJI. Here, we established a Candida albicans biofilm-associated PJI mouse model to research and develop new therapeutics for PJI.

Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

Periprosthetic joint infection (PJI) is one of the common infections caused by Candida albicans (C. albicans), which increasingly concerns surgeons and ...

Estabelecendo um modelo de camundongo para infecção relacionada a cateter associada a Candida albicans

A Catheter-Related Candida albicans Infection Model in Mouse

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed on the outer surface of the catheter and lead to disseminated infections, which are fatal to patients. There are no effective prevention and treatment management in clinics. Therefore, it is urgent to establish an animal model of CRI for the preclinical screening of new strategies for its prevention and treatment. In this study, a polyethylene catheter, a widely used medical catheter, was inserted into the back of the BALB/c mice after hair removal. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314) expressing enhanced green fluorescent protein was subsequently inoculated on the skin's surface along the catheter. Intense fluorescence was observed on the surface of the catheter under a fluorescent microscope 3 days later. Mature and thick biofilms were found on the surface of the catheter via scanning electron microscopy. These results indicated the adhesion, colonization, and biofilm formation of candida albicans on the surface of the catheter. The hyperplasia of the epidermis and the infiltration of inflammatory cells in the skin specimens indicated the histopathological changes of the CRI-associated skin. To sum up, a mouse CRI model was successfully established. This model is expected to be helpful in the research and development of therapeutic management for candida albicans associated CRI.

Autor em destaque: Aprimorando a detecção de Candida albicans em infecções por cateter usando marcação de proteína fluorescente 

We establish a mouse model of C.albicans-associated catheter-related infection (CRI), in which biofilm forms on the catheter, and the interaction between C.albicans and host correlates well with the clinical CRI. This model helps screen therapies for C.albicans biofilm-associated CRI, laying a foundation for clinical transformation.

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Catheter-related infection (CRI) is a common nosocomial infection caused by candida albicans during catheter implantation. Typically, biofilms are formed ...

Estudar comunidades microbianas

Resumo

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Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Crônica de Longo Prazo

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Candida albicans biofilme Desenvolvimento on Foreign Bodies medicamente relevantes numa subcutânea modelo do rato Seguido por bioluminescência Imagem

P. aeruginosa Co-Cultura 3D infectada de células epiteliais e macrófagos bronquiais na interface ar-líquida para avaliação pré-clínico de anti-infecciosos

Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

Modelo de Infecção por Candida albicans em Articulação Periprotética em Camundongos

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos

Modelo de Infecção por Candida albicans Relacionada a Cateter em Camundongos