Compatível com o Instituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant &#39;Linfopoiese&#39;), a REVIVE Programa de Investimento e Futuro &quot;La Ligue contre le Cancer&quot;.

Declaração de ética: todos os experimentos foram realizados de acordo com a Carta Ética Instituto Pasteur, aprovado pelo Ministério da Agricultura francês, e com as orientações da UE. Um manipulador com formação em cirurgia pequeno roedor, certificado pelo Ministério da Agricultura francês, executa todas as intervenções cirúrgicas. NOTA: Ver em anexo Quadro 1 mostra o procedimento plano de 5 passos. 1. Selecção dos embriões <ol><li> Use 36 fêmeas C57BL / 6 CD45.2, 12 fêmeas CD45.1, 12 C57BL / 6 do sexo masculino e 12 CD45.1 C57BL / 6 machos CD45.2. Cruzando os fêmeas com qualquer genótipo masculino irá produzir embriões CD45.1 / 2 e CD45.1 usado como uma fonte de TSP CD45.2 ou usado como uma fonte de receptores lóbulos do timo. Casa todos os machos individualmente. </li><li> Para obter embriões para E18 TSP isolamento, coloque 2 fêmeas em uma gaiola com um macho CD45.1 às 6 da tarde, 21 dias antes do experimento enxertia. Verifique a presença de um tampão vaginal no dia seguinte, antes do meio-dia. Sepaavaliar as fêmeas conectados. </li><li> Para obter embriões E14 a ser colonizada por TSP, repita o procedimento acima (1.2), utilizando machos CD45.2, 17 dias antes do experimento enxertia. </li><li> Para obter embriões para isolar E13 TSP, repita o procedimento acima (1.2), utilizando machos C57BL / 6 CD45.1, 16 dias antes do experimento enxertia. </li></ol> 2. Dissecção da Embriões Sob um Horizontal capela de fluxo laminar NOTA: Dois dias antes do experimento enxertia. <ol><li> Sacrificar as fêmeas prenhes por deslocamento cervical ou por administração progressiva de gás CO2 durante pelo menos 5 minutos, numa câmara fechada saturação. Certifique-se de morte por prisão definitiva dos movimentos cardio-respiratória. Molhar o abdômen com etanol 70%. </li><li> Adicione uma incisão longitudinal na pele na linha média do abdómen e abri-lo por puxar a pele separados. Abra o peritoneu com fórceps e tesouras, sem tocar no tracto digestivo. Puxe o uter bífidanos e separá-lo da vagina com a tesoura. </li><li> Inserir o útero num prato de 90 x 15 mm de Petri contendo 40-50 ml de DPBS e cortar transversalmente entre decídua de cada embrião. </li><li> Com a tesoura de ponta fina e uma pinça fina remover a membrana muscular do útero, tirar os embriões cortando entre a placenta eo saco vitelino, e remover os amnios, que está retendo os embriões. </li><li> Colocar os embriões numa placa de Petri de 90 x 15 mm contendo HBSS + 1% de soro fetal de vitelo (FCS). Para os embriões mais velhos do que E15, retire as cabeças com um par de tesouras antes de qualquer outra dissecação. </li></ol> 3. Isolamento do timo <ol><li> Sob a lupa binocular, coloque o embrião, deitado em decúbito dorsal (vista ventral), em uma cama gaze molhada. </li><li> Insira um fórceps longitudinalmente ao longo da cartilagem do esterno, beliscar e abrir a grade torácica. Com uma pinça curva, puxe a parede torácica de lado para visualizar o thymic lóbulos de cada lado da traqueia. </li><li> Segure cuidadosamente cada lobo por beliscar por baixo com uma pinça fina e colocá-los em uma placa de Petri contendo 1 ml de HBSS + FCS a 1%. Isolar os lobos e remover o tecido conjuntivo adjacente com duas seringas de 1 ml + 26 G ⅜ &quot;agulhas, sem danificar a cápsula. </li><li> Lavar os lóbulos em 3 mL de HBSS + FCS a 1% para eliminar as células do sangue. NOTA: Antes E15, lóbulos tímicos estão localizados em cada lado da traqueia e depois fusível no meio para constituir um órgão de bi-lobar. </li></ol> 4. As suspensões celulares <ol><li> Separar os lóbulos sob a lupa binocular, com duas agulhas 26 G montados em seringas de 1 ml, em HBSS + FCS a 1%. Filtra-se a suspensão de células através de uma malha de nylon. </li></ol> 5. Coloração com anticorpos fluorescentes e Seleção celular NOTA: Todos os anticorpos são previamente titulado para obter definição óptima das populações (o titratde iões pode variar de acordo com o lote de anticorpo). <ol><li> Incubar os timócitos (E13 ou E18) durante 15-30 min a 4 ° C com 100 uL de um cocktail de anticorpos biotinilados para corar as células de linhagem positivos (anti-CD19, anti-Gr1, anti-Ter119, anti-NK1.1 , anti-CD11c, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25). </li><li> Para lavar o excesso de anticorpos girar os tubos com 4 mL de HBSS + FCS a 1% a 280 xg durante 7 minutos, para eliminar o sobrenadante e re-suspensão da pelota em HBSS + FCS a 1%. Voltar a centrifugar. </li><li> Incubar as células marcadas com biotina E18 com microesferas de estreptavidina durante 15 min a 4 ° C e lavar as células duas vezes em HBSS 1% de FCS. Re-suspender as células em 2 ml de HBSS + FCS a 1%. A maioria dos timócitos E13 são linhagem negativa e, portanto, não precisa de MACS enriquecimento antes da separação de células. </li><li> Passar as células na coluna LS, de acordo com as instruções do fabricante. Quando toda a suspensão de células entrou na coluna de adicionar 2 mL de HBSS + FCS a 1%. Recuperar o4 ml da coluna de fluxo, através de centrifugação e as células durante 7 minutos a 280 x g. </li><li> Re-suspender o grânulo de qualquer das empobrecido E18 ou E13 total de timócitos em 50 ul da mistura de TSP anticorpo (anti-CD117 APC, anti-CD135 PE, anti-CD127 PECy7, anti-CD24 FITC, anti-CD44 e estreptavidina APCCy7 Pacific Blue ) e incubar durante 20 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Lavam-se as células com 4 mL de HBSS + FCS a 1% e re-suspender as células em 1 mL de HBSS + FCS a 1% com iodeto de propídio. </li><li> Ordenar a TSPs Lin - CD135 + células CD44 + CD117 + CD24 + CD127 baixo em um FACS (com 4 lasers) sobre uma tubos de 1,5 ml contendo 200 ul de meio completo + 20% FCS. Portão primeiro as células de acordo com seu tamanho e granulosidade na FSC e canais ES. Eliminar as células mortas (coloração com iodeto de propídio), porta para fora parelhas e marcar a fluorescência em escalas exponenciais. Cerca de 100 ou 600 TSPs pode ser obtido a partir de um E13 ou E18 um timo, respectivEly. </li></ol> 6. A colonização da E14 Thymic Lobes com Progenitores: Suspensão técnica da gota <ol><li> Irradiar (30 Grays = 30 Gy) E14 lóbulos timo a partir de embriões CD45.2, 3 horas antes da cultura. NOTA: E14 ou E15 lóbulos do timo foram usados ​​com sucesso como receptor de progenitores de células T. Usando receptores de lobos do timo posteriores dias de gestação resulta em necrose prematura devido ao tamanho maior do órgão enquanto lobos do timo nos dias gestacionais mais precoces desenvolver mal, provavelmente devido ao desenvolvimento incompleto das células epiteliais. </li><li> Centrifugar classificados TSP e suspender novamente as células em meio de cultura (meio OPTI-MEM meio completo com 10% de FCS, penicilina (50 unidades / ml), estreptomicina (50 ug / ml) e 2β-mercaptoetanol (50 pM)) de tal modo que 35 ul conter 500 TSP. </li><li> Colocar uma gota de 35 ul de suspensão de células a cada poço de uma outra placa de 60 bem Terasaki. NOTA: 35 gotas ul podem fundir-se se eles são colocados em poços contíguos. </li><li> Inserir um lóbulo irradiado sobre a superfície de cada gota. Feche a placa Terasaki e vire a placa de cabeça para baixo para deixar as células atingem o pólo apical da queda por gravidade. </li><li> Bater suavemente na parte lateral superior da placa invertida para forçar os lóbulos para deslizar para a extremidade apical da gota. Incubar a placa Terasaki invertida numa incubadora humidificada, durante 48 horas a 37 ° C + 5% de CO 2. Após a colonização, ou cultura E14 thymi em FTOC 7, ou enxerto sob a cápsula renal de um rato adulto destinatário 8. </li></ol> 7. Fetal Thymic Órgão Cultura <ol><li> Colocar 3 ml de meio completo numa placa de Petri de 35 mm. Inserir um filtro de membrana isopore flutuante no meio. Colocar os lóbulos reconstituídos na extremidade da membrana com uma pinça (não mais do que oito lóbulos sobre uma membrana). </li><li> Colocar as placas de Petri contendo os lóbulos do timo dentro de um prato de 90 milímetros de Petri, em conjunto com um prato de 35 mm, sem tampa, contendo 2 ml de water, para assegurar a humidade óptima. Incubar 12 dias a 37 ° C + 5% de CO 2. </li></ol> 8. Os enxertos sob a cápsula renal em condições estéreis NOTA: O parênquima renal está rodeado por um tecido conjuntivo que forma uma cápsula. A região sub-capsular é particularmente rica em vasos sanguíneos e linfáticos, proporcionando assim um ambiente adequado para o desenvolvimento de enxertos (por exemplo, lobos do timo, ilhotas pancreáticas ou corações recém-nascidos). Enxertos se realiza no rim esquerdo, porque é mais acessível do que o rim direito. CD3 - / - camundongos machos foram usados ​​como destinatários evitando assim enxerto contra reacção do hospedeiro devido a antígenos de histocompatibilidade menores ligados ao cromossomo Y, porque a determinação do sexo antes de E15 não é feito facilmente. <ol><li> Esterilizar os instrumentos e usa luvas esterilizadas ao longo da cirurgia. Anestesiar o rato por injecção intra-peritoneal de uma solução de cetamina 10 mg / ml + xilazina 1 mg /ml diluído em PBS: (50 a 100 mL por 10 g de peso corporal), utilizando uma seringa de 1 ml. Verifique anestesia, verificando falta de reflexos interdigitais. Coloque uma gota de gel hidro-Optimune em cada olho para prevenir o ressecamento durante a anestesia. NOTA: A solução deve ser preparada extemporaneamente e aquecida à temperatura ambiente antes da injecção. A anestesia dura pelo menos 20 min. O grau de anestesia deve ser controlada ao longo de toda a cirurgia. A anestesia pode ser prolongada por injecção intra-peritoneal de metade da dose a cada 20 min. </li><li> Posicione o mouse sobre o seu lado direito, em uma capela de fluxo lâmina horizontal. Esteriliza-se o campo cirúrgico com etanol a 70% e 10% de solução de iodeto de dérmica. Com uma peça pinça o cabelo do rato ao longo de um comprimento de apenas dois centímetros acima da articulação da perna traseira. Raspar a área cirúrgica. </li><li> Com um bisturi, fazer uma incisão de 1,5 centímetros de comprimento em primeiro lugar, o tecido cutâneo, em seguida, com uma tesoura cortar o tecido muscular. Aplicar uma ligeira pressão a ambos os lados da incisão, O que forçará o rim para fora da cavidade abdominal. </li><li> Aplicar soro fisiológico com um algodão-broto para manter o rim úmido. Se você tiver dificuldades em expor o órgão, use uma pinça planos para retirar o tecido circundante para adipócitos que o rim está ligado. Manter o rim para fora da cavidade retroperitoneal por um cotonete colocado por baixo do órgão. </li><li> Com dois pinça fina, faça um furo 2-3 mm na cápsula (evite tocar no parênquima para evitar sangramento). Durante todo o procedimento cirúrgico manter a cápsula renal exposta continuamente humedecido. </li><li> Insira cuidadosamente os lóbulos sob a cápsula renal, mantendo a parede da cápsula aberta e o enxerto deslize sob a cápsula para o pólo borda. Coloque até 6 lóbulos por rim. </li><li> Substitua o rim na cavidade retro-peritoneal. Suturar as aponeuroses do músculo, em seguida, a pele com nós cirurgião individuais. Molhar a ferida com uma solução de iodeto de povidona 10%. Posicione o mouse em um pa aquecidad a 37 ° C. </li><li> Inquérito sobre o mouse transplantado até a recuperação completa da anestesia pelo controle de cardíacas, respiratórias e suiça movimentos, cores da mucosa até a recuperação total de visto por auto contidos movimentos. NOTA: Recomendamos a injeção de solução analgésica (buprenorfina, 0,1 mg / kg) de músculo intra logo após a cirurgia e os 2 dias após a cirurgia para evitar a dor pós-operatória. </li><li> Mantenha o animal operado em isolamento até que esteja totalmente recuperado. Inspeccionar a cada dois dias os pontos de malha da ferida para verificar e prevenir a infecção. Nunca observada infecção da ferida seguindo este procedimento. NOTA: análise semanal de células de sangue periférico a partir do CD3 - / - murganhos enxertados nos permite detectar o timo populações derivados originado a partir de qualquer E13 ou E18 progenitores usando o marcador CD45 alotípica linhagem de células T e anticorpos específicos (figura 3). </li></ol> 9. Análise da progénie de TSP por Citometria de Fluxo <ol><li&gt; Tease os FTOCs individualmente obter suspensões de células individuais (ver secção protocolo 4). </li><li> Suspensões de células mancha de lobos individuais com uma mistura de anticorpos contendo anticorpos que reconhecem CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE e incubar conforme descrito no capítulo 5. </li><li> Re-suspender as células em HBSS + FCS a 1% + iodeto de propídio e análise de citometria de fluxo (ver resultados na Figura 2). </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Dois ensaios principais podem ser usadas para analisar a diferenciação de células T ex vivo. O mais recentemente relatada é a co-cultura de células progenitoras hematopoiéticas, com células estromais da BM, OP9, expressar os ligandos de Noth1 delta, como 1 ou 4 12. Este ensaio de 2-D é fácil de executar, altamente eficientes e sensíveis, permitindo a análise o nível de uma única célula. No entanto, isso nem apoia o desenvolvimento de células T além da fase de DP nem a geração de γ?...

Linfócitos T, tendo o αβ ou o receptor de células T γδ (TCR), em diferenciar um órgão especializado, o timo. O timo totalmente desenvolvido está organizado em duas regiões distintas: o córtex, onde progenitores timo desenvolver e onde timócitos que produtivamente reorganizar a β TcR e genes da cadeia α são resgatados da morte programada (um processo conhecido como seleção positiva); e da medula, onde selecionado timócitos com demasiado forte reatividade a auto-ligantes são excluídos (seleção negativa) 1,2. O timo tem origem a partir da camada endodérmica do terceiro bolsa faríngea posterior que está rodeado por células mesenquimais 3. Ele é colonizada por células progenitoras hematopoiéticas a partir de dia embrionário E12 e, depois disso, o recrutamento contínua é necessária para o desenvolvimento das células T normais 4. Imigrantes timo evoluir através de sucessivos estágios de desenvolvimento, orquestrada por um programa bem regulamentado, iniciado e maintained pela activação da via de sinalização de Notch em timócitos após interacção com o seu ligando, como Delta 4, expressa em células epiteliais tímicas (TEC) 5. Desenvolvimento de timócitos começa no chamado CD4 - CD8 - (DN) estágios dupla negativos. Timócitos DN pode ser subdividida de acordo com a expressão de CD25 e CD44 em DN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) e DN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) e CD117 (c-Kit) subdivide ainda mais o compartimento DN1 em cinco subconjuntos onde DN1a e b correspondem aos progenitores timo primeiros (PTE). Timócitos reorganizar as δ, β e α cadeias de TCR na fase DN e passam por pré-seleção TcR (estágios DN3-DN4). Eles ainda mais trânsito para o compartimento duplo positivo (DP) CD4 + CD8 +, onde a cadeia α TcR reorganiza antes da sele positivo e negativoction. Nesta fase, a maioria dos timócitos são eliminadas e apenas uma pequena percentagem (3-5%) chegar ao CD4 + ou CD8 + T maduras compartimento da célula. A via de diferenciação linfóide progride através dos estágios de HSCs que geram progenitores multipotentes (MPP) e progenitores multipotentes ferrado-linfóides (LMPP) que perderam o eritrócitos e megakaryocyte potencial 6. LMPP são fenotipicamente definida pela ausência de marcadores celulares no sangue diferenciadas (linhagem negativa, Lin -), a expressão de c-Kit (CD117), Sca-1 e Flt3 / Flk2 (CD135) e a ausência de níveis detectáveis ​​de interleucina ( IL) -7 receptor α cadeia (IL-7rα ou CD127). LMPPs diferenciar ainda mais em progenitores comuns linfóides (CLP) 7 que por essa fase perderam a capacidade de gerar células mielóides. CLP reter de linfócitos (células T e B), células NK, células linfóide e DC inata (ILC) potencial, e diferem de LMPP pela expressão de CD127 e a ausência de níveis elevados de Sca-1. Embora a natureza dos timo resolver progenitores (PTS) tem sido amplamente debatido 8, tornou-se recentemente claro que a mudança TSP fenótipo, potencial e função de diferenciação, ao longo do desenvolvimento 9. Foram realizadas in vitro e in vivo em ensaios para caracterizar o TSP, isolado por separação de células a partir de FACS ou E13 (primeira onda) ou E18 (segundo grupo). Fetais culturas de órgãos timo (FTOC) com lobos do timo irradiados colonizados por um número igual de E13 e E18 progenitores, tendo diferentes marcadores alotípicos, autorizada após sua progênie em um ambiente de desenvolvimento semelhantes e revelou propriedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos os tipos de células progenitoras. Lobos do timo colonizados por qualquer E13 ou E18 TSP permitiu o desenvolvimento sem seleção devido à concorrência entre ambos os progenitores. In vivo transplante dos lobos do timo colonizados revelou ainda que também tele progênie madura de E13 e E18 TSP têm diferentes propriedades biológicas in vivo. TSPs da primeira onda gerar rapidamente as células T, mas dar origem a baixos números de células T γδ e αβ. Entre estes últimos foram detectados Vγ5Vδ1 células epiteliais dendríticas T (DETC), que têm um TcR invariante, migrar para a epiderme onde exercem uma função na cicatrização de feridas e só são produzidos durante o desenvolvimento embrionário 10. Em contraste, TSP a partir da segunda onda demorar mais tempo para gerar números elevados de células T + TcR e são incapazes de gerar DETC.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture Petri dishes.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>26 G &amp;frac38;&quot; 0.45 x 10 mm syringes with needles</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>Cell suspension</td></tr><tr><td>Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>Filtration of cells</td></tr><tr><td>Ethanol 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Iodide Povidone 10% (Betadine)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>Sterility actions</td></tr><tr><td>Ketamine 100 mg/ml (stock solution)</td><td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/ml in PBS (stock solution)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>Anesthesic and muscle relaxant</td></tr><tr><td>Buprenorphin 0.3 mg/ml stock solution</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>Morphinic analgesic</td></tr><tr><td>Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>Eye protection</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>to isolate embryos</td></tr><tr><td>HBSS Hanks&#039; Balanced Salt Solution (+ CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>to wash out the blood and dissect the embryos</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>Medium for cultures</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>Penicilin and streptomycin</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>Antibiotics for cultures</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>31350010</td><td>additive for cultures</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 Dissection microscope</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>Cold lamp source</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 compact</td><td>Two goose neck fibers adapted</td></tr><tr><td>Silicone elastomer</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissecting Pad</td></tr><tr><td>Spoon, round and perforated</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Fine iris scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Forceps: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>2 pairs of fine straight watchmakers&amp;rsquo; forceps Dumont #5 11 cm fine tips.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Needle-holder</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>for sutures</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>To maintain mouse temperature during anesthesy</td></tr><tr><td>Membrane Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>For FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 wells plates</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>For hanging drop technique</td></tr><tr><td>Gauze swabs steriles 7.5 x 7.5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>To apply disinfecting solution</td></tr><tr><td>Fluorescence or biotin labelled antibodies</td><td>BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences&amp;nbsp;</td><td>Clone Number see table below</td><td>Staining cells</td></tr><tr><td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Cell depletion</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&amp;nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td><td>Source of cells and thymic lobes</td></tr><tr><td>Mice</td><td>CDTA Orl&amp;eacute;ans, France</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>Grafting experiment</td></tr></tbody></table>

characterization of thymic settling progenitors in the mouse embryo using in vivo and in vitro assays

Caracterização do timo resolver progenitores é importante compreender as fases de pré-timo de desenvolvimento de células T, essencial para elaborar estratégias de substituição de células T nos pacientes linfopênicos. Foram estudados timo decantação progenitores de murídeo dia embrionário 13 e 18 por dois timos complementar in vitro e in vivo técnicas, ambos com base no método &quot;gota em suspensão&quot;. Este método permitiu colonizar lobos do timo fetal irradiados com E13 e / ou E18 progenitores timo distinguidos por CD45 marcadores alotípicos e, portanto, após a sua progênie. A colonização com populações mistas permitem analisar as diferenças celulares autônomos em propriedades biológicas dos progenitores enquanto colonização tanto com população remove possíveis pressões seletivas competitivos. Os lobos do timo colonizados também podem ser enxertados em ratos imunodeficientes beneficiários do sexo masculino que permitam a análise da progênie de células T maduras in vivo, tais como a dinâmica populacional de tele periféricos do sistema imunitário e colonização de diferentes tecidos e órgãos. Culturas de órgãos timo fetal revelou que progenitores E13 desenvolveu-se rapidamente a toda a amadurecer células CD3 + e deu origem ao subconjunto de células T γδ canônica, conhecidas como células T epiteliais dendríticas. Em comparação, os progenitores E18 tiver uma diferenciação retardada e não foram capazes de gerar células epiteliais dendríticas T. A monitorização do sangue periférico de enxertados do timo CD3 - / - ratos mostraram também que progenitoras E18 tímico sedimentação gerar, com o tempo, um maior número de células T maduras do que as suas contrapartes E13, uma característica que não pode ser apreciado no timo fetal de curto prazo culturas de órgãos.

A fim de escolher um método para esgotar lobos do timo de timócitos endógenos que permitam o melhor desenvolvimento de células progenitoras colonizadoras, comparamos os níveis de T reconstituição celular nos lobos do timo colonizados após a irradiação ou um desoxi-guanosina 5 dias (d-Gua) tratamento. Os resultados mostram que, enquanto não há nenhuma diferença no dia 9 de cultura, lobos irradiados continham mais células T do que aqueles tratados com d-Gua, no dia 12. Assim, a irradiação é mais apropriad...

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Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

8.2K visualizações.  Institut Cochin. This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny. 

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Biologia do Desenvolvimento

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development. To follow the migration of individuals in a crowd of thymocytes , we generate neonatal chimeras where less than one percent of the thymocytes are derived from a donor that is transgenic for a ubiquitously express fluorescent protein. To generate these partial hematopoetic chimeras, neonatal recipients are injected with bone marrow between 3-7 days of age. After 4-6 weeks, the mouse is sacrificed and the thymus is carefully dissected and bissected preserving the architecture of the tissue that will be imaged. The thymus is glued onto a coverslip in preparation for ex vivo imaging by TPM. During imaging the thymus is kept in DMEM without phenol red that is perfused with 95% oxygen and 5% carbon dioxide and warmed to 37&deg;C. Using this approach, we can study the events required for the generation of a diverse T cell repertoire.

We present step-by-step instructions for the generation of neonatal chimeras as well as the dissection and preparation of the thymus for ex vivo imaging by 2-Photon Microscopy.

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

Biologia

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Imunologia e Infecção

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Pesquisa do câncer

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Derivação de células T<em&gt; In Vitro</em&gt; De Mouse Células-Tronco Embrionárias

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Recriando o microambiente tímico com organoides derivados de iPSC

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avanço das células epiteliais tímicas e pesquisa de células T com organoides tímicos humanos

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando

Resumo

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3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Na imagem situ da Thymus Mouse Usando 2-Photon Microscopia

Imagem intravital da Thymus rato usando 2-Photon Microscopia

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Derivação de células T

Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Formação de organoides do timo humano em hidrogéis de fibrina tridimensionais

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção