Name: applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

NOTA: Todos os protocolos que envolvam animais foram seguidos de acordo com as orientações de cuidados de animais de The Pennsylvania State University, IACUC # 44057 1. Lentivírus Produção NOTA: O dia antes da transfecção, LentiX-293 deve ser a 80% de confluência. <ol><li> Lavar as células com DMEM apenas antes da transfecção e incubar em 10 ml de DMEM / 10% de FBS com penicilina (100 UI / ml) e estreptomicina (100 ug / ml) durante 5 min à TA. </li><li> Dilui-se o ADN e polietilenimina (PEI) (1 mg / ml) em 1: 3 de proporção (1 ug de ADN: 3 ul de PEI) em 1 ml de DMEM e vortex durante 1 min. O volume de ADN adicionada é dependente da concentração do DNA. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. <ol><li> Por exemplo, utilizar 20 ug de plasmídeo ADN, composta por 10 ug de vector de plasmídeo, 5 ug de plasmídeo psPax2 14, 5 ug de vírus da estomatite vesicular (VSV) com 60 ul de PEI por prato. </li></ol></li><li&gt; Misturar a solução de DNA e de PEI de novo com vortex durante 1 min. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Adicionar 1/10 total de volume de meio de cultura de DMEM (isto é, 1 ml para 10 ml de meio de cultura numa placa de 100 mm). Adicionar 1 ml de ADN-PEI mistura gota a gota para o prato e o prato de rodar em volta até ao meio de cultura é bem misturado com o ADN. </li><li> Incuba-se durante 6 horas à temperatura ambiente e remover o sobrenadante. Adicionar 5 ml de meio de cultura. </li><li> 48 h após a transfecção, recolher o sobrenadante viral e girar a 627 xg durante 5 min a 4 ° C em um tubo de 50 ml. Filtro de 30 ml de sobrenadante viral através de um filtro de seringa de 0,45 um para um tubo de ultracentrífuga. </li><li> Adicionar água estéril para equilibrar os tubos, e cobrir os tubos com pequeno pedaço de parafilme. Tubos giram a 11.249 xg durante 120 min a 4 ° C. Remover o líquido utilizando uma ponta de vácuo. </li><li> Adicione 100 ml de PBS frio do tubo. Agite suavemente o tubo a 4 ° CO / N. </li><li> Para voltar a suspender o vírus, pipeta tele PBS adicionado no passo 1,8 ao longo dos pellets 10 vezes, tomando cuidado para não tocar a pelota com a ponta. O pellet não será re-suspenso até que este esteja completo. </li><li> Alíquota o vírus em 10-20 ul por tubo, flash-congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 2. injeção estereotáxica 2.1) Preparação de Instrumentos <ol><li> Coloque um par de tesouras, pinças blunt-end, um porta-agulhas, bisturi, cotonetes, e um pano em um pacote selado com um indicador de esterilização e autoclave antes da cirurgia. Além disso, obter 10% de iodo povidona, álcool etílico 70%, suturas absorvíveis, uma almofada de aquecimento, lágrimas artificiais, um talão de vidro esterilizador, broca, uma broca, duas seringas descartáveis, uma seringa de injeção, barbeador elétrico, analgésico (cetoprofeno), anestésico (Avertin), luvas, e um aparelho de estereotaxia com bomba de injecção. </li><li> Faça solução 1,25% avertin fresco naquele dia, filtro em uma capa estéril usando um 0,2 &amp;# 181; m filtro de seringa estéril, e coloque em um frasco de soro estéril. Misture 2,5 g de álcool 2,2,2-tribromoetilo em 5 ml de álcool terc-amílico, em seguida, dissolvem-se em 200 ml de água. Manter o pH abaixo de 5. 15 </li></ol> 2.2) Preparação do Rato <ol><li> Administrar Avertin com base no peso do rato (375 mg / kg). 15 Injectar o rato com o avertina através de uma injecção intraperitoneal (IP) de injecção, e, em seguida, colocar volta para a sua gaiola até estar completamente anestesiado. </li><li> Dê um analgésico via injeção IP (ketaprofen, 5 mg / kg), e lugar de lágrimas artificiais sobre os olhos do mouse para evitar a secagem. </li><li> Certifique-se de que o mouse é totalmente adormecido por beliscar seu pé. Se o rato responde ao pé de aperto, em seguida, dar mais anestésico (em doses de 50 uL). Raspar a cabeça do rato usando um barbeador elétrico. Raspar a área a ser operada (tipicamente de apenas atrás das orelhas, a parte superior do focinho), e a área circundante. </li><li> Coloque o rato into do aparelho estereotáxica. Trava os dentes da frente para a braçadeira anterior, e abaixe a braçadeira e aperte-o de modo que a mandíbula é totalmente seguro. </li><li> Coloque as barras de ouvido no canal do ouvido para estabilizar completamente a cabeça. Tenha cuidado para não inserir as barras de ouvido demasiado para dentro, o que poderia danificar o ouvido interno. Uma vez terminado, o corpo do rato deverá ser capaz de ser movido ligeiramente sem interromper a posição da cabeça. </li><li> Coloque uma almofada de aquecimento sob o rato a fim de regular a temperatura do corpo do rato ao longo do procedimento. </li><li> Limpe a área cirúrgica completamente. Usando um cotonete, esfregar 10% de iodopovidona em um movimento circular, a partir do meio do local cirúrgico e movendo-se para o exterior. Em seguida, utilizando um pano de algodão para esfregar o álcool etílico a 70% no local da cirurgia da mesma maneira. Repita mais duas vezes. </li></ol> 2.3) A primeira incisão <ol><li> Uma vez que o rato está preparado, abra o saco de equipamento estéril. Mudar de luvas antes touching os instrumentos. Retire o pano estéril e coloque os instrumentos sobre o pano. Se qualquer instrumento toca uma superfície não-estéril, utilize o talão esterilizador de vidro por 15 segundos para esterilizar. </li><li> Tome o bisturi na mão e blunt-end fórceps dominantes na mão não-dominante. Use a pinça blunt-end para suavemente aderência da pele do rato, e fazer uma incisão usando o bisturi. Comece a incisão cerca de 1,5 cm acima das orelhas (em direção ao nariz) e se estendem até cerca de 0,5 cm abaixo das orelhas. Estender a incisão vertical no meio da cabeça do rato para expor bregma (Figura 1). </li><li> Uma vez bregma é visualizada, dê uma ponta de algodão estéril para remover suavemente todo o sangue cobrindo a superfície do crânio. Use duas pontas de algodão para empurrar a pele em direcção ao lado da cabeça. </li></ol> 2.4) Configuração de Equipamento <ol><li> Depois de todo o sangue é removido a partir da superfície do crânio, e é claramente visualizada bregma, preparar a seringa (CONcentração de 8 a 10 TU / ml, volume de 1 mL). Na hotte, encher a seringa com o vírus a ser injectado. Certifique-se que não há bolhas estão no interior. Coloque a seringa no aparelho estereotáxico, certificando-se de que está plenamente assegurada. </li><li> Lentamente inferior da seringa até que esteja bem acima da superfície do crânio, de modo que a ponta da agulha da seringa estéril é definido como a intersecção da bregma e a linha interaural. Definir este ponto como zero, e determinar as coordenadas a partir deste ponto. </li><li> Dependendo da área de cérebro de interesse, variar as coordenadas estereotáxicas. Determinar essas coordenadas, utilizando um atlas do cérebro 4. Uma vez que as coordenadas são determinados, mover a agulha da seringa para combinar essas coordenadas. Alvo do giro dentado usando as coordenadas: M / L = +/- 1 mm, de A / P = -1,82 mm. Abaixe a agulha para a direita acima do crânio para visualizar onde o buraco tem de ser perfurados. </li><li> Levante a seringa um pouco, tomar a broca e coloque a broca bit logo acima do local de perfuração alvo em cerca de um ângulo de 45 ° com o crânio. Começar a perfurar, e manter a perfuração até que o crânio dá lugar. Quando o crânio dá forma, uma queda na resistência pode ser detectada. Seja o cuidado de não perfurar o cérebro, de modo a evitar danos cortical. </li><li> Pegue um cotonete estéril e limpar qualquer sangue do buraco. </li><li> Abaixe a seringa de modo que a ponta fica na superfície do cérebro (não o crânio). Definir a coordenada D / V (profundidade) a 0. inferior a seringa para a profundidade desejada, com base nas coordenadas do atlas do cérebro. Para atingir o giro dentado, definida D / V para -1,79 mm. </li><li> Iniciar a injecção a uma velocidade de 0,2 ul / min. Relógio para garantir que a seringa não escorregar mais baixa do que a profundidade desejada. Se isto ocorrer, levantar suavemente a seringa para a profundidade desejada de novo. </li><li> Após a injecção está terminada, esperar cerca de 2 minutos para assegurar que qualquer vírus residual foi absorvido. Lentamente levantar a seringa e use um cotonete para remover qualquer lilibras a partir do local de injecção. </li><li> Repita para o outro hemisfério. </li></ol> 2.5) Sutura <ol><li> Retirar o fio de sutura e agulha estéril da embalagem e prender a agulha usando os suportes da agulha. Enfrentar a borda afiada da agulha longe de suporte da agulha. Segure a pinça blunt-end na mão não dominante, e usá-lo para agarrar a pele do rato. Comece com a mão dominante. </li><li> Empurrar suavemente o fio de sutura através da pele e utilizam a pinça de extremidade romba para agarrar a pele do outro lado da incisão. Puxe o material de sutura através de até cerca de 0,75 polegadas permanece. </li><li> Deixe de lado a agulha, e usar a pinça blunt-end para envolver a sutura em torno do suporte de agulha uma vez, em seguida, pegue a sutura restantes 0,75 polegadas com suporte de agulha e puxe o fio de sutura através, de modo que o suporte da agulha e agulhas acabar no lado oposto da cabeça para que eles foram originalmente no. Isso deve formar um nó. </li><li> Repita este passomais três vezes, alternando o lado da cabeça de retenção da agulha termina-se em cada tempo. </li><li> Cortar o fio de sutura e repita os passos 2.5.1-2.5.3 até que a incisão é fechada. </li></ol> 2.6) cuidados pós-operatórios <ol><li> Remova cuidadosamente as barras de ouvido do rato, e remover a mandíbula da braçadeira anterior. </li><li> Mantenha o mouse sobre a almofada de aquecimento até que ele acorda e se move em torno de seu próprio. Monitorar o mouse diariamente, e manter e olho para fora para sinais de dor, como não preparação, comer ou beber. Dê analgésico adicional quando julgar necessário. </li></ol> 3. Abra Campo de Provas 3.1) Configurar <ol><li> Obter um quadrado vazio, arena de plástico com dimensões 50 centímetros x 50 cm, com 50 cm de altura paredes (mas pode ser um pouco maior). Limpar a arena com 70% de álcool etílico antes do início da experiência. Verifique se o álcool etílico esteja totalmente seca antes de colocar um mouse para a arena. </li><li> Coloque a arena nachão, e tentar garantir a iluminação está definido para minimizar sombras e reflexos. </li><li> Se estiver usando o software de rastreamento, posicione a câmera diretamente acima do campo aberto, cerca de 1,5 pés acima do campo aberto (longe o suficiente para abranger completo toda a arena, mas perto o suficiente para ter uma visão clara do mouse). </li><li> Configurar uma zona no centro da caixa (aproximadamente uma área de 30 cm x 30 cm). 16 Para definir uma zona, clique na guia zona 1 no painel lateral. <ol><li> Escolher um contorno da forma do painel superior, e o contorno do perímetro da zona central. Selecione adicionar a zona e clique no interior da zona centro. Usando as instruções do programa, nome da zona (isto vai ser referido como &quot;centro&quot; para este procedimento). Se o teste comportamental serão marcados com a mão, certifique-se o fundo do campo é dividido em 10 cm x 10 cm quadrados, marcado com fita. </li></ol></li><li> Configure o software para que as configurações estão corretas, eo mouse é facilmente visible na tela. Conseguir isso, ajustando as configurações de detecção na máquina para ser compatível com a arena de testes (iluminação) e cor mouse. NOTA: Quando as configurações estiverem corretas, o sistema deve rastrear apenas o mouse, e não quaisquer sombras ou urina / matéria fecal. As definições do software específicos dependem da iluminação da arena, e a cor do rato. </li></ol> 3.2) aclimatação e de ensaio <ol><li> Mova camundongos experimentais para o comportamental sala 1 hora antes do ensaio, a fim de aclimatar-los para os seus arredores. Deixe os ratos em sua gaiola para a aclimatação. </li><li> Ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental e coloque o mouse em direção à frente meio da arena, para que o rato está virado para a parede. </li><li> Ajustar o cronômetro para 5 min, e afastar-se da arena. Se possível, deixe o quarto para não acidentalmente influenciar o mouse. </li><li> Uma vez que 5 min estão em alta, remover o mouse e colocá-los em sua gaiola. </li><li> Use álcool etílico 70% a limpeza profunda de todo o campo antes de prosseguir para a próxima mouse. Verifique se o álcool etílico esteja totalmente seca. </li></ol> 3.3) Scoring <ol><li> Considere o rato como estando no centro do campo quando todas as quatro patas estão dentro do meio de 30 cm x 30 cm. </li><li> Quantificar a quantidade de tempo que o rato gasta no centro. Alternativamente, determinar desta vez usando software de monitoramento (como Noldus ethovison). <ol><li> Para fazer isso, vá até a guia análise e clique em &quot;movimento&quot; em perfis de análise. Excluir as categorias definidas atualmente, e em seguida, selecione &quot;na zona&quot; sob a guia de localização. Selecione a zona centro. Em seguida, selecione &quot;saída da análise&quot; (na guia resultados) para ver os resultados. Uma tabela listando o tempo gasto imóvel para cada ensaio deve aparecer. </li></ol></li><li> Caso contrário, marcar o OFT à mão. O campo aberto deve ter 25 10 cm x 10 cm quadrados descritas na parte inferior da abercampo n (conforme descrito no passo 3.1.3). Quantificar a quantidade de tempo que o rato gasta no centro, para além do número de entradas para o centro da arena. 16 NOTA: O centro de 30 cm x 30 cm área é considerada o centro do campo aberto. Um rato é considerado como habitando a região do centro, se todas as quatro patas estão dentro da área cm a 30 x 30. </li></ol> 4. Teste de Natação Forçada NOTA: Permitir que um mínimo de cinco dias entre tarefas comportamentais. 4.1) Configurar <ol><li> Obter um balde de 2 L claro, e preencha com 22 ° C de água. Coloque o balde sobre uma mesa, e tentar garantir a iluminação está definido para minimizar sombras e reflexos. </li><li> Se estiver usando o software de rastreamento, posicione a câmera diretamente em cima do balde. </li><li> Configurar o seu software de modo que o mouse é facilmente visível no ecrã. </li></ol> 4.2) aclimatação e de ensaio <ol><li> Mova camundongos experimental no ro comportamentalom 1 hora antes do teste para aclimatar os arredores. Deixe os ratos em sua gaiola para a aclimatação. </li><li> Ligue a câmera para gravar a tarefa comportamental. Delicadamente, coloque o mouse no meio do balde de água. Certifique-se de não deixar cair o mouse em. Lentamente, abaixe o mouse, para que seus pés dianteiros tocar a água em primeiro lugar. Tome cuidado para evitar a sua cabeça fique submerso. </li><li> Ajustar o cronômetro para 6 min, e afastar-se da área comportamental. </li><li> Uma vez que 6 min são para cima, remova o mouse do balde, e limpe o excesso de água antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola. </li></ol> 4.3) Scoring <ol><li> Se você estiver usando software de monitoramento, definir por cento imobilidade a 11%, como sugerido por Noldus (esta deve ser a configuração padrão), para quantificar o tempo flutuante vs. natação. </li><li> Para quantificar usando o sistema de rastreamento, vá para a aba análise, e clique em circulação em regime de perfis de análise. Excluir as categorias definidas atualmente, e em seguida, selecione Estado da mobilidade, emo painel do lado esquerdo (em comportamento individual). Definir a imobilidade até 11%. </li><li> Selecione a visualização da trilha, sob a guia resultados. Selecione saída de análise (na guia resultados) para ver os resultados. Uma tabela listando o tempo gasto imóvel para cada ensaio deve aparecer. </li><li> Se marcar lado, medir o tempo passa o mouse natação ou escalada, ea quantidade de tempo gasta o mouse imóvel. Além disso, medir a latência para o primeiro tempo de imobilidade. Veja a Figura 2 em resultado secção. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Injecções estereotáxicas de sucesso dependem de três fatores: manter o rato vivo, definindo o ponto zero correto para coordenadas (ponta da agulha na intersecção de bregma ea linha interaural), e definir a profundidade direito ao ponto zero (ponta da agulha apenas a tocar o exterior do tecido cerebral). A viabilidade dos murganhos é importante. Sobrevivência cirurgia pode ser auxiliada por certificando-se de que o mouse está devidamente anestesiados e recebe analgésica adequada. A dor é conhecido por ser uma ...

O rato tem sido amplamente utilizada em neurobiologia, porque é fácil de manipular geneticamente. Técnicas gene knockout permitir que os investigadores para investigar como cada fator genético molda comportamentos do mouse. Além disso, o sistema cre-loxP fornece uma ferramenta valiosa para Tecido e célula de tipo nocaute de genes específicos em camundongos, o que permite aos pesquisadores para estudar a função de genes em diferentes tecidos. 1 Contudo, na prática, os padrões de promotores cre de expressão são difíceis de controlar , e até agora muitos condutores cre estabelecidas não ter alcançado uma expressão específica da região 2,3. Em alternativa, a injecção estereotáxica é um método que tem como alvo regiões específicas do cérebro de rato adulto o. Por injecção de vírus geneticamente modificadas que expressam ADNc ou shRNA, a modulação da expressão génica específica da região pode ser alcançado. Embora o tamanho do cérebro de cada ratinho varia, a localização de regiões específicas do cérebro pode ser determinada utilizando coor estereotáxicanates definir a partir de pontos de referência no crânio do cérebro do rato. Os marcos mais comumente usados ​​são bregma, lambda, ea linha interaural. Utilizando as coordenadas obtidas a partir de um atlas cerebrais, 4 a localização exacta de cada área do cérebro pode ser identificado pela ântero-posterior (A / P), medial-lateral (H / L), e dorso-ventral (D / V) de eixos bregma / intersecção linha interaural. Tipicamente os vírus injectado no cérebro de ratos são marcados com qualquer proteína fluorescente vermelha ou verde (GFP ou RFP), de modo que as injecções pode ser confirmada por microscopia de fluorescência. Avaliações comportamentais dos ratos são especialmente necessários para a investigação básica de transtornos psiquiátricos. Os sintomas de transtornos psiquiátricos em pacientes tipicamente envolvem comportamentos anormais. Alguns destes comportamentos humanos são evolutivamente conservada e pode ser directamente imitou e observadas no rato. Por exemplo, a depressão pode ser modelada no rato medindo desespero comportamental. Pessoas com depressão often sentir como se nada fazem sempre vai ajudar, um sintoma que pode eventualmente levar ao suicídio. Em roedores, este pode ser modelado utilizando o Teste de Natação Forçada (FST), que mede a quantidade de tempo que um rato nadando contra flutuando em uma piscina de água (vistos como desistir). Este paradigma é validada por resgatar o fenótipo com anti-depressivos. 7,8,9 ratos que receberam anti-depressivos vai gastar muito menos tempo imóvel comparação com os controlos não tratados. Outro teste comportamental, o teste de campo aberto (OFT) é concebido para avaliar a locomoção em ratinhos, e, adicionalmente, pode ser utilizada para analisar o fenótipo ansiedade em ratos. 5,6 Este teste baseia-se na premissa de que os ratos se sentir mais segura quando estão perto para a parede em um romance campo aberto. Camundongos selvagens acabará por explorar o novo ambiente, pois são animais curiosos. No entanto, passar menos tempo no centro do campo indica ansiedade no rato, como o rato não irá ser capaz de superar a INITIAl medo causado por um ambiente de romance. A ansiedade do rato, como quantificado pela quantidade de tempo despendido no centro de um campo aberto, pode ser comparada a ansiedade clínica em seres humanos, o qual está presente em muitos distúrbios psiquiátricos. A combinação de injecções estereotáxicas com os paradigmas comportamentais é uma nova maneira de alterar a expressão de um gene específico em uma área alvo do cérebro. O efeito da expressão do gene modulado em comportamentos de ratos pode então ser determinada. Em contraste com nocaute do cérebro inteiro, este método é particularmente útil uma vez que tem como alvo apenas áreas específicas do cérebro. Além disso, as injecções estereotáxicas são tipicamente realizadas no tipo selvagem do rato adulto, por conseguinte, a expressão do gene endógeno foi mantida ao longo das etapas de desenvolvimento. Este método vai evitar o efeito confundem, se o gene é necessária para a sobrevivência durante o estágio embrionário ou pós-natal do desenvolvimento. Uma grande limitação é que os camundongos experimentais precisa ir through uma cirurgia invasiva, em que os crânios dos murganhos têm de ser abertos. Além disso, o grau de modulação do gene é determinada por titulação e a eficiência do vírus. O vírus tem de ser injectado na região correcta através de coordenadas estereotáxicas, que requer instrumentos especiais. Verificação do local de injecção correcta só pode ser concluído post mortem. Este método tem sido utilizado para testar o envolvimento de um gene específico em várias doenças neurológicas. Por exemplo, viral mediada por ARNi do gene alvo Th (que permite a dopamina a ser sintetizado) foi injectada na substância negra compacta, e a análise do comportamento locomotor foi conduzido. 10 Outro estudo utilizou injecção estereotáxica de um Disc1 silenciamento lentivírus para avaliar o comportamento do rato em relação a esquizofrenia. Knockdown de Disc1 levaram a um aumento da locomoção em resposta a novidade (paralelos sintomas positivos em esquizofrenia), e maior na imobilidadeFST. 11 De forma semelhante, um estudo adicional descobriu que 5-HT 1B superexpressão levou a um comportamento exploratório aumentado no OFT, consistente com um fenótipo anti-ansiedade usando este método. 12 injecções estereotáxicas pode entregar vírus para induzir a recombinação cre em ratinhos cre-loxP . Este método foi utilizado para eliminar selectivamente o receptor Y2 na amígdala e o núcleo da estria terminal. Após a análise comportamental, estes ratos foram encontrados para um fenótipo anti-depressivo quando o gene foi eliminado na amígdala central, mas não fenótipo quando o gene foi eliminado na amígdala basolateral ou do núcleo do leito do stria terminalis. 13 Assim, esta técnica fornece uma ferramenta única para estudar o efeito genético sobre os comportamentos dos animais.

<table><tbody><tr><td>Stereotactic Apparatus item 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential stereotaxic pump&amp;nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Injection Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td><td>with pedal</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Inotech&amp;nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures&amp;nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbable, reverse cutting</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves&amp;nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin or other anesthetic</td><td>see recipe citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen or other analgesic</td><td>see veternarian&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Camera</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

Injecção estereotáxica é uma técnica útil para entregar lentivírus de título elevado para as áreas do cérebro em ratos segmentados. Os lentivírus podem ou sobre-expressar ou a expressão do gene knockdown numa região centrada relativamente sem danos significativos para o tecido do cérebro. Após a recuperação, o rato injetado pode ser testado em várias tarefas comportamentais, tais como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). O OFT é concebido para avaliar o fenótipo locomoção e ansioso em ratos, medindo a quantidade de tempo que um rato passa no centro de um novo campo aberto. Um rato mais ansiosos vai gastar muito menos tempo no centro do romance campo em comparação aos controles. O FST avalia o fenótipo anti-depressivo por quantificação da quantidade de tempo que os ratos passam imóvel quando colocada num balde de água. Um rato com um fenótipo anti-depressivo vai gastar muito menos tempo imóvel comparado ao grupo controle. O objetivo deste protocolo é usar o stereotactic injeção de um lentivírus em conjunto com testes comportamentais para avaliar como fatores genéticos modular comportamentos animais.

<html> Injeção estereotáxica precisas depende fortemente de definir as coordenadas corretas. A ponta da agulha utilizada para injectar o vírus deve ser definido directamente na intersecção da bregma e a linha interaural (Figura 1). É útil a utilização de um microscópio estereoscópico para determinar se ou não a agulha está correctamente colocado. Ao olhar através do microscópio, a agulha deve ser posicionado de modo que, se o vírus foram injectados, seria aterrar directamente na intersec...

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Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).

Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K visualizações.  The Pennsylvania State University.  Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST). 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Comportamento

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

Modelando metástases cerebrais através de injeção intracraniana e ressonância magnética

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

Pesquisa do câncer

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Neurociência

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In vivo intracerebral injeções Estereotaxicas para estimulação Optogenética de entradas de longo alcance em fatias de cérebro de rato

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

Otimizando a precisão da microinjeção estereotáxica em camundongos

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

Autor em destaque: Acelerando a pesquisa de comprometimento cognitivo em camundongos por meio de injeção estereotáxica e corantes econômicos

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.

Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...