We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex's Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children's Cancer Foundation.

NOTA: Todos os estudos de peixe-zebra e manutenção dos animais foram feitas de acordo com a Mayo Clinic Institute IACUC-aprovado protocolo # A41213. 1. As construções de ADN para Transgénese <ol><li> Amplificar uma região do promotor de 5,2 kb da dopamina-beta-hidroxilase (d βh) 8, utilizando o clone de BAC CH211-270H11 (BacPac centro de recursos (BPRC)) como um molde de ADN. Usar um adequado sistema de PCR para a amplificação por PCR de comprimento e precisos de modelos longos de ADN e os seguintes programas do ciclo de PCR: 94 ° C durante 2 min, 10 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 50 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), seguido por 30 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 53 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (iniciador directo 5&#39;-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 &#39; e iniciador inverso 5&#39;-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 &#39;). </li><li> Crie o d βh -pDONRP4-P1r clo entradane 8, utilizando sistema de clonagem recombinante comercial, como a porta de entrada de vários sites. Misture 1 ml de dβh purificada produto de PCR (172 ng / mL), 1 ml (150 ng / mL) pDONRP4-P1r doador vector (juntamente com outros vetores de gateway são generosas doações de Dr. Chi-Bin Chien, Univ. De Utah) , 4 ul de tampão TE (pH 8,0) com 2 ul de mistura de enzimas BP clonase, incubar durante 1 hora a 25 ° C e, em seguida, transformar a One Shot TOP10 competente E. coli de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Gerar o d βh: transgênica EGFP-MYCN construir 8, utilizando sistema de clonagem recombinante mencionado na etapa 1.2. Misture 1 ml de cada clone de entrada (150 ng / L), incluindo um 5.2-kb dβh promotor (dβh -pDONR P4-P1r construção), EGFP faltando um códon de parada (PME-EGFP construção), e humano MYCN cDNA (uma oferta generosa do Dr. Hogarty no Hospital Infantil da Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 construção), 1 ml (150 ng / mL) do vector destino modificado contendo sítios de reconhecimento I-SCEI (uma oferta generosa do Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Alemanha), 4 jul de tampão TE ( pH 8,0) com 2 ul de mistura de enzimas clonase LR, incubar durante 1 hora a 25 ° C e, em seguida, transformar a E. quimicamente competente coli, tais como Um tiro top 10 e seguir o protocolo do fabricante. </li><li> Adicione MITF: transgénico MITF construir 8 por digestão do vector de PNP-MITF com NotI e SalI enzimas de restrição durante 2 h à temperatura ambiente, e o libertado por subclonagem 2.65-kb (uma generosa oferta do Dr. D. Raible, University of Washington). fragmento de ADN que contém o promotor MITF e a sequência de codificação do gene do peixe-zebra MITF nos locais de um vector pBluescript modificado contendo flanqueiam locais de reconhecimento de I-Scel NotI e MluI (uma oferta generosa do Dr. Hui Feng, Universidade de Boston), utilizando ADN-ligase de T4 de acordo com o protocolo do fabricante. NOTA: Para aumentar a eficiência das linhas geradoras MYCN -expressing estáveis, d βh: EGFP-MYCN eo MITF:. Construções de DNA MITF são co-injectado em uma das células de embriões em estágio de nácar Nacre designa um tipo de peixe mutante sem uma crista neural derivado melanï¿½oro 36 durante o desenvolvimento. Assim, o aparecimento de células de pigmento em embriões injectados sugere a integração de MITF: ADN MITF construções no genoma. Demonstrou-se que dois ou três construções de ADN podem ser co-injectado cointegrados no genoma de peixe 31. Assim, a pigmentação causada pela expressão MITF pode servir como um marcador para a integração do dβh: transgene EGFP-MYCN e para facilitar a identificação de MYCN linhagem transgênica estável. </li><li> Misturar o d βh: EGFP-MYCN e MITF: ADN MITFconstruções na proporção de 3: 1 num volume total de 15 ul de uma reacção com 1 ml de enzima I-Scel e 0,75 ul de tampão. Certifique-se que a quantidade total de DNA na reação não exceda 750 ng. </li><li> Efectua-se a digestão I-Scel à TA durante 4 h ou O / N. No segundo dia, o I-SceI- ADNs digeridos estão prontos para microinjecção ou pode ser armazenado a -20 ° C durante a injecção no futuro. Armazenar a enzima I-Scel a -80 ° C em pequenas aliquotas para manter a eficácia da enzima. </li><li> Subclonar o ALKF1174L humana e gene ALK-tipo selvagem do vetor pCDNA3 (a oferta generosa do Dr. George no Dana-Farber Cancer Institute) 7 em sites de um vetor pENTRY1A EcoRI e NotI (a oferta generosa do Dr. C. Grabher, Instituto de Tecnologia Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha), utilizando ADN-ligase de T4 de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Gerar o d βh: ALKF1174L &lt;/ Em&gt; ou dβh: construções transgênicas ALKWT que utilizam o sistema recombinante, como mencionado no Protocolo 1.2. Resumidamente, combinar três clones de entrada, dβh -pDONRP4-P1r, ALKF1174L- pENTRY1A (ou ALKWT -pENTRY1A) e P3e-poli, no vector de destino modificado contendo sítios de reconhecimento I-SCEI (uma oferta generosa do Dr. C. Grabher, Karlsruhe Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, Alemanha), utilizando LR clonase enzima Mix, de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Misture o d βh: ALKF1174L (ou dβh: ALKWT) e dβh: DNA mCherry constrói em uma proporção de 3: 1 e linearizar lhes com a enzima I-SCEI como descrito no Protocolo 1,5-1,6. </li></ol> 2. Microinjection <ol><li> Utilize micropipetas de vidro com 1,0 mm de diâmetro para todas as injecções 37. Quebre a ponta dos micropipetas de vidro com uma lâmina de barbear antes da injeção. Calibrar o volume de injeção por injeçãoing H 2 O em uma gota de óleo mineral. Medir o diâmetro das gotículas resultantes e ajustar o microinjector (pressão ou a duração do impulso de pressão) para garantir que o volume da injecção é inferior a 10% do volume total de células de uma célula de embriões de estágio. </li><li> Adicionar mais 0,5 ul de fresco enzima I-Scel (5 unidades / ul) em 5 mL de solução de injecção contendo construções de ADN imediatamente antes da injecção para aumentar a eficiência da transgénese 38. Injectar 50-80 pg de construções de ADN linearizado no citoplasma de embriões de estádio de uma célula. Para garantir o sucesso da injeção, misturar a amostra com 0,25% de fenol vermelho para visualização. Se as células ficam vermelhos após a injecção, isso indica a microinjecção é bem sucedido. Para garantir uma elevada taxa de sucesso para a geração de peixes transgénicos, que normalmente injetar até 500 embriões. </li><li> Para gerar peixes transgénicos que expressam estavelmente MYCN, coinject linearizado d βh: EGFP-MYCN e MITF: construções de ADN MITF (numa proporção de 3: 1) em embriões de peixe-zebra a pigmentação mutante nácar no estádio de uma célula. A expressão de MITF serve como repórter para a integração das construções transgênicas no genoma dos peixes. </li><li> Para a sobre-expressão do mosaico da ALK na de tipo selvagem ou embriões transgénicos MYCN, co-injectar o linearizado d βh: ALK F1174L (ou dβh: ALKWT) com dβh: ADN mCherry constrói (numa proporção de 3: 1) para a célula de um embriões resultantes da criação de F1 heterozigotos Tg (dβh: EGFP-MYCN) peixes transgénicos com o tipo selvagem AB peixes. Assim, metade da prole é transgênica para MCYN e metade são do tipo selvagem. </li></ol> 3. Tela de Peixe Estável ou Mosaic Transgênicos <ol><li> Para aumentar a eficiência de identificação de linhas MYCN -expressing estáveis, anestesiar os embriões injectados nácar principalmente com tricaína (0,02%) det dias 3-5 de pós-fertilização e tela para a pigmentação. Transferir os embriões com pigmentação para uma nova placa de Petri com água ovo fresco e elevá-las a maturidade sexual para posterior triagem para o peixe fundador, que carregam o d βh: transgene EGFP-MYCN nas células germinativas. </li><li> Para identificar o fundador com transmissão germinal de EGFP-MYCN, peixes F0 adulto pigmentada outcross com o tipo selvagem AB peixes e tela de embriões EGFP-positivo em 1-2 dias após a fertilização para posterior genotipagem. Coloque um único embrião F1 EGFP-positivo em um tubo de PCR e retirar todo o líquido. Adicionar 50 ul de tampão de extracção ADNg que contém 12,5 ul de tampão de lise 4x, 35 ul de H2O e 2,5 ul de proteinase K (10 mg / ml) para único embrião. Incubar a mistura reaccional durante 2-3 horas a 55 ° C, seguido de 10 min de incubação a 98 º C para inactivar a proteinase K. Para fazer 50 ml de tampão de lise 4x, adicionar 500 uL de Tris 1M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl tde o, 47 ml de H 2 O. NOTA: Depois de F0 MYCN peixes transgénicos estável são criados com o tipo selvagem AB peixe, todos os filhotes são pigmentadas. Assim, pigmentação não pode servir como marcador para a identificação de peixes MYCN- positivo. Enquanto nos peixes transgénicos MYCN, a proteína de fusão de EGFP-MYCN é expresso na PSNS, incluindo os neurónios simpáticos do gânglio cervical superior e segmentar sequencial gânglio da cadeia simpática e dos não-PSNs neurónios dopaminérgicos, tais como a medula oblonga e gânglios cranianos 8. Assim, a expressão da EGFP pode servir como um marcador para identificação dos embriões transgénicos estáveis ​​MYCN. </li><li> Utilizar 2 ul de ADNg extraídos a partir do embrião F1 pigmentada como molde, iniciadores MYCN -test F1: 5&#39;-CTG CTT AAC GAG GAG CTG TG-3 &#39;; MYCN -R3: 5&#39;-AGG CAT CGT AGG ATC TTG AG-3 &#39;eo seguinte sagacidade programah, a GC-RICH sistema de PCR: 1 ciclo de 95 ° C durante 3 min, 25 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 3 min. Nós normalmente genotipar 14-16 embriões pigmentados a partir de um único acasalamento para confirmar a presença do transgene integrado em MYCN os embriões pigmentadas, mais do que 6 fundador peixe superexpressando MITF e MYCN foram identificados por este método. </li><li> Levante-se o restante dos embriões F1 EGFP-positivo. Clipe Fin e do genótipo-los em 2-3 meses de idade utilizando o protocolo anterior para confirmar ainda mais a integração de MYCN transgene no peixe. Raça F1 MYCN peixes transgénicos estável com o tipo selvagem AB peixe. Co-injetar o d βh linearizado: ALK F1174L (ou dβh: ALKWT) com dβh: DNA mCherry constrói em embriões unicelulares como descrito no Protocolo 2.4. </li><li> Ordenar o MYCN -expressing embriões no experimento descrito no Protocolo 2.4 usando um fluor estereoscópicoescence microscópio e examinar os embriões injetados principalmente nos dias 1-3 de pós-fertilização para a expressão de EGFP-MYCN no PSNS. Em seguida, durante 2-5 dias de pós-fertilização, anestesiar os embriões com tricaína (0,02%) e classificar os embriões MYCN- positivas ou negativas novamente com base na expressão de mCherry nas PSNS usando um microscópio estereoscópico de fluorescência. A expressão de mCherry serve como um marcador para a co-expressão da ALK em tecidos dos animais injectados primário mosaico. NOTA: ~ 600 prole resultante da criação de peixes transgénicos MYCN estável com o tipo selvagem de peixe por grupo foram injectados com as construções de ADN linearizado, incluindo d βh: ALK F1174L e dβh: mCherry, dβh: ALKWT e dβh: mCherry, ou dβh : mCherry sozinho, respectivamente. Mosaico de expressão mCherry pode ser observado em 70-90% dos peixes primeiramente injectado. Um meio para pontualterço dos peixes injetados sobreviveram através do estágio de larva para o relógio tumor. </li><li> Levantar todo o mCherry + MYCN + e + mCherry MYCN - embriões de acordo com os protocolos padrão do livro zebrafish 39 e monitorar início tumor começando às 5 semanas pós-fertilização. </li></ol> 4. Tumor Watch em Mosaic Transgênicos Peixe <ol><li> Monitorar mCherry- positivo peixes injetados principalmente a cada 2 semanas a partir de 5 semanas pós-fertilização para a evidência de aparecimento de tumores. </li><li> Anestesiar peixe com tricaina (0,02%) e tela para a presença de mCherry - e EGFP -expressing tumores nos PSNS sob a Nikon SMZ-1500 fluorescência estereoscópica microscópio equipado com uma mira a câmera digital da DS-U1. </li><li> Para confirmar se os tumores que expressam o transgene são ALK, isolar o mCherry- e massas EGFP-ALK positivo para a genotipagem de PCR. </li><li> Usando PCR, amplificar o ADN genómicoextraiu-se a partir de tumores desenvolvidos com os seguintes iniciadores: ALK P7: 5&#39;-AGG GGT CCA CGG GTC AAT CG-3 &#39;e ALK P18: 5&#39;-TGT CTT CAG GAT GTT GCT GC-3&#39; e a sequência de reacção de PCR: 1 ciclo de 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 60 seg). Em seguida, a sequência do produto de PCR com o iniciador P7 ALK para confirmar ainda mais a existência de mutante ou de tipo selvagem ALK em tumores mCherry-positivos. </li></ol>

<ol>
	<li>Tenesa, A., Dunlop, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+aetiology+of+colorectal+cancer+from+genome-wide+association+studies.">New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies.</a> Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).</li><li>Maher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+takes+centre+stage+in+cancer+profiling.">Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling.</a> Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).</li><li>Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+cancer+genomes+through+second-generation+sequencing.">Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).</li><li>Chung, C. C., Chanock, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genome-wide+association+studies+in+cancer.">Current status of genome-wide association studies in cancer.</a> Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).</li><li>Mosse, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ALK+as+a+major+familial+neuroblastoma+predisposition+gene.">Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene.</a> Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).</li><li>Janoueix-Lerosey, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+and+germline+activating+mutations+of+the+ALK+kinase+receptor+in+neuroblastoma.">Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).</li><li>George, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+mutations+in+ALK+provide+a+therapeutic+target+in+neuroblastoma.">Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+ALK+Collaborates+with+MYCN+in+Neuroblastoma+Pathogenesis.">Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis.</a> Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Amatruda, J. F., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+cancer+in+zebrafish.">Genetic models of cancer in zebrafish.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).</li><li>Konantz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).</li><li>Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice.">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li><li>Kettleborough, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+analysis+of+zebrafish+protein-coding+gene+function.">A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function.</a> Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li><li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphoblastic+lymphoma+cells+express+high+levels+of+BCL2,+S1P1,+and+ICAM1,+leading+to+a+blockade+of+tumor+cell+intravasation.">T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation.</a> Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).</li><li>Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+penetrant+melanoma+in+a+zebrafish+model+is+independent+of+ErbB3b+signaling.">Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).</li><li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing's+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis.">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).</li><li>Le, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock-inducible+Cre/Lox+approaches+to+induce+diverse+types+of+tumors+and+hyperplasia+in+transgenic+zebrafish.">Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+RAS+on+the+genesis+of+embryonal+rhabdomyosarcoma.">Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma.</a> Genes &amp; development. 21 (11), 1382-1395 (2007).</li><li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+KRAS+induces+progenitor+cell+expansion+and+malignant+transformation+in+zebrafish+exocrine+pancreas.">Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas.</a> Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xmrk,+kras+and+myc+transgenic+zebrafish+liver+cancer+models+share+molecular+signatures+with+subsets+of+human+hepatocellular+carcinoma.">Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma.</a> PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).</li><li>Forrester, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NUP98-HOXA9-transgenic+zebrafish+develop+a+myeloproliferative+neoplasm+and+provide+new+insight+into+mechanisms+of+myeloid+leukaemogenesis.">NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis.</a> British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).</li><li>Alghisi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogene+expression+to+endothelial+cells+induces+proliferation+of+the+myelo-erythroid+lineage+by+repressing+the+Notch+pathway.">Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway.</a> Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).</li><li>Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooking+the+big+one:+the+potential+of+zebrafish+xenotransplantation+to+reform+cancer+drug+screening+in+the+genomic+era.">Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).</li><li>Patton, E. E., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+zebrafish.">The art and design of genetic screens: zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cellular+responses+to+exogenous+DNA+in+mammalian+cells+and+its+effect+on+oligonucleotide-directed+gene+modification.">Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification.</a> Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-injection+strategies+to+modify+radiation+sensitivity+and+tumor+initiation+in+transgenic+Zebrafish.">Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish.</a> Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+mutations+of+ALK+kinase+in+neuroblastoma.">Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma.</a> Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).</li><li>Pugh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+high-risk+neuroblastoma.">The genetic landscape of high-risk neuroblastoma.</a> Nature genetics. , (2013).</li><li>Berry, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK(F1174L)+mutation+potentiates+the+oncogenic+activity+of+MYCN+in+neuroblastoma.">The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma.</a> Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).</li><li>Heukamp, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+mutated+ALK+induces+neuroblastoma+in+transgenic+mice.">Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice.</a> Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).</li><li>Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nacre+encodes+a+zebrafish+microphthalmia-related+protein+that+regulates+neural-crest-derived+pigment+cell+fate.">nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate.</a> Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transposition+of+the+Tol2+transposable+element+from+a+single-copy+donor+in+zebrafish.">Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).</li><li>Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+bridges+in+vertebrate+gastrulation.">Intercellular bridges in vertebrate gastrulation.</a> PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).</li><li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+universe+of+transposon+technologies+for+gene+and+cell+engineering.">The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering.</a> Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).</li><li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+cell+transplantation+using+adult+rag2+mutant+zebrafish.">Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish.</a> Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).</li><li>Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+patterns+of+somatic+mutations+in+cancer.">Emerging patterns of somatic mutations in cancer.</a> Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).</li><li>Sander, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+somatic+zebrafish+cells+using+engineered+TALENs.">Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs.</a> Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Neste estudo representativo, foi utilizado co-injecção transiente e co-expressão de LFA activado com o gene repórter mCherry em MYCN -expressing peixes transgénicos para mostrar que estes genes cooperar para acelerar significativamente o aparecimento de neuroblastoma, consistente com a nossa verificação anterior no composto estável coexpressï¿½ peixes transgénicos tanto ALK e MYCN 8 activada. Esta abordagem transgénica mosaico possui várias vantagens ...

Cancros são doenças progressivas marcados pela acumulação de mutações patológicas, exclusões e ganhos de cromossomos ao longo do tempo. Estas anormalidades genéticas pode afectar vários processos celulares que variam do ciclo celular, morte celular, no metabolismo energético e montagem do citoesqueleto de salientar as respostas, tais como a hipoxia. Assim, tumorigenesis reflete as ações coletivas de várias aberrações genéticas em toda uma gama de processos biológicos. Os recentes esforços de integração genômicas de investigação, incluindo a sequenciação do genoma inteiro, exome seqüenciamento, sequenciamento alvejado, o seqüenciamento de profundidade e estudos de associação do genoma, identificaram um número cada vez maior de alterações genéticas novos em praticamente todos os tipos de tumores 1-4. Em muitos casos, as lesões genéticas ocorrem em conjunto de uma maneira não aleatória 5-8, sugerindo a sua cooperação na patogénese da doença. Dissecando os papéis oncogênicos do grande variedade de genes expressos de maneira aberrante resultantes from essas lesões genômicas é necessário elaborar novas estratégias terapêuticas e para entender as respostas das células tumorais para esses agentes, mas isso provou ser uma tarefa difícil, que exige muito robustos sistemas de modelos animais para a realização de análise genômica funcional de alto rendimento em vivo. Apesar de mamíferos, especialmente roedores, são modelos favorecidas em biologia do câncer, o peixe-zebra começou a atrair atenção considerável. O peixe-zebra teleósteos (Dario rerio) tem sido usada como um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento desde os anos 1960 e foi aplicado em primeiro lugar ao estudo da patogénese do tumor, em 1982, 9-11. Facilidade de manutenção, tamanho pequeno corpo, e alta fecundidade fazer o peixe-zebra um modelo robusto para telas genéticos para a frente em larga escala para identificar mutações que conferem fenótipos anormais e patológicas 10. A transparência óptica de embriões de peixes-zebra é outra característica fundamental apoiar uma maior utilização deste modelo de câncer, comoele permite que in vivo de imagens a serem realizadas para localizar o desenvolvimento do tumor em tempo real, 9, um aplicativo que é relativamente difícil em roedores 12. Recente análise genômica comparativa do genoma de referência do peixe-zebra (Zv9) revelou 26.206 genes codificadores de proteínas, com 71% tendo ortï¿½ogos humanos, dos quais 82% são correlacionados com genes associados à doença no Online mendeliana Herança em Man (OMIM) do banco de dados 13, 14. Por conseguinte, o peixe-zebra foi usado para modelar diversos tipos de cancros humanos, incluindo neuroblastoma 8, de células T aguda leucemia linfoblástica (T-ALL), 15,16, 17,18 melanoma, sarcoma de Ewing, 19, 20,21 rabdomiossarcoma, carcinoma pancreático 22, carcinoma hepatocelular e 23 mielóide malignidades 24,25, e foi selecionado como um modelo de câncer para o xenotransplante estuda 11,26. A transgênico estávelabordagem no peixe-zebra é comumente utilizada para estudar o efeito de ganho-de-função de genes no desenvolvimento normal ou patogénese da doença 27,28. Para desenvolver tal um modelo (Figura 1A), um injecta uma construção de ADN contendo o gene de interesse accionado por um promotor específico de tecido para dentro de uma células de embriões de tipo selvagem. Três a quatro meses após a injeção, quando os embriões injetados atingir a maturidade sexual, eles são outcrossed com o tipo selvagem de peixe para a tela para os que apresentaram integração do DNA construir em sua linha germinativa, o que lhes licencia como fundador peixe. Muitos factores, tais como o número de cópias e sítio de integração do transgene, afectar a expressão do transgene em linhas transgénicas estáveis. Assim, para desenvolver um modelo de tumor transgénico, várias linhas transgénicas estáveis ​​que sobre-expressam um único oncogene tem que ser gerada em primeiro lugar e rastreados para a linha de expressar o transgene a um nível que pode levar à indução de tumores. No entanto, se a sobre-expressão de um candidato oncogene é tóxico para as células germinativas, que é difícil gerar uma linha estável por transgénico que sobre-expressam o transgene directamente 29. Assim, esta abordagem pode ser demorado, com um elevado risco de falha para gerar um modelo de cancro adequado. Aqui, ilustramos uma estratégia alternativa com base na transgénese transiente mosaico (Figura 1B) que oferece vantagens únicas sobre a transgénese estável tradicional para estudo genómica funcional in vivo. Nesta abordagem, uma ou mais construções de transgenes são injectados no estádio de uma célula de embriões transgénicos ou de tipo selvagem. As construções de DNA injetado contendo transgenes são então mosaically e aleatoriamente integrado no peixes injetados primário, resultando em genótipos mistos dentro de populações de células em vários peixes individuais 30. Além disso, a co-injecção de ADN múltiplas construções de embriões unicelulares leva à co-integração na mesma célula em locais aleatórios, permitindo que um trace as células com expressão de transgenes e explorar as interações de diferentes genes durante a patogênese da doença nos animais mosaico 31. Como prova de princípio, nós transitoriamente superexpressado ALK mutacionalmente ativado (F1174L) com gene repórter mCherry no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob o controle do hidroxilase dopamina beta (d βh) promotor de tipo selvagem e peixes transgênicos com superexpressão MYCN. ALK, que codifica um receptor da tirosina quinase, é o gene mais frequentemente mutado em alto risco neuroblastoma 5-7,32,33. ALK (F1174L), como uma das mutações somáticas ativadoras mais frequentes e mais potentes, é sobre-representados em MYCN- amplificado pacientes neuroblastoma de alto risco e sinergia com MYCN superexpressão para acelerar neuroblastoma tumorigenesis em ambos os ratinhos transgénicos estáveis ​​e modelos de peixes-zebra transgénicos 8,34,35. Por mosaicosobreexpressão transiente de ALK (F1174L) com mCherry nos peixes transgénicos MYCN, nós recapitulado a aceleração do aparecimento do tumor observada nos peixes transgénicos que sobre-expressam tanto estável ALK (F1174L) e MYCN, sugerindo que a estratégia de transgénese mosaico pode ser utilizado para rapidamente e eficientemente avaliar as contribuições relativas de vários oncogenes na iniciação do tumor in vivo.

<table><tbody><tr><td>Expand Long Template PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>pCR-TOPO vector&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, CA</td><td>451641</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme&lt;br/&gt; Mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;reg; BP Clonase&amp;reg; II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>GC-RICH PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche Applied Science, IN</td><td>12 140 306 001</td><td></td></tr><tr><td>Meganuclease I-SceI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>R0694S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon digital sight DS-U1 camera</td><td>Nikon, NY</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Para investigar se a sobre-expressão de F1174L ALK mutacionalmente activado ou de tipo selvagem ALK pode colaborar com MYCN na indução de neuroblastoma, que sobre-expressa ou activada humana ou ALK-ALK humano do tipo selvagem sob o controlo do promotor d βh no PSNS de peixes transgénicos que sobre-expressam MYCN. Qualquer uma das seguintes construções, dβh - ALKF1174L ou dβh - ALKWT, foram co-injectado com dβh - ...

Watch this Scientific Journal Video about Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis at JoVE.com

Transgênese de peixe-zebra em mosaico para análise genômica funcional de genes candidatos cooperativos na patogênese de tumores | Biologia do Desenvolvimento | Vídeo

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

mosaic-zebrafish-transgenesis-for-functional-genomic-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Genetics

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

11.1K visualizações.  Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine. The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Vídeo: Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

Pesquisa do câncer

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Medicina

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Biologia do Desenvolvimento

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Biologia

Normal and Malignant Muscle Cell Transplantation into Immune Compromised Adult Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have been developed that permit engraftment of normal and malignant cells into irradiated, syngeneic, and immune compromised adult zebrafish. These models when coupled with optimized cell transplantation protocols allow for the rapid assessment of stem cell function, regeneration following injury, and cancer. Here, we present a method for cell transplantation of zebrafish adult skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS), a pediatric sarcoma that shares features with embryonic muscle, into immune compromised adult rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. Importantly, these animals lack T cells and have reduced B cell function, facilitating engraftment of a wide range of tissues from unrelated donor animals. Our optimized protocols show that fluorescently labeled muscle cell preparations from &#945;-actin-RFP transgenic zebrafish engraft robustly when implanted into the dorsal musculature of rag2 homozygous mutant fish. We also demonstrate engraftment of fluorescent-transgenic ERMS where fluorescence is confined to cells based on differentiation status. Specifically, ERMS were created in AB-strain myf5-GFP; mylpfa-mCherry double transgenic animals and tumors injected into the peritoneum of adult immune compromised fish. The utility of these protocols extends to engraftment of a wide range of normal and malignant donor cells that can be implanted into dorsal musculature or peritoneum of adult zebrafish.

Here, we present a protocol for cell transplantation of zebrafish skeletal muscle and embryonal rhabdomyosarcoma (ERMS) into adult immune compromised rag2E450fs homozygous mutant zebrafish. This protocol allows for the efficient analysis of regeneration and malignant transformation of muscle cells.

Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish

Zebrafish have become a powerful tool for assessing development, regeneration, and cancer. More recently, allograft cell transplantation protocols have ...

Imunologia e Infecção

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non coding sequences. One prominent function carried out by the non coding fraction of the genome is to regulate gene transcription; however, there are no effective methods to broadly predict cis-regulatory elements from primary DNA sequence. We have developed an efficient protocol to functionally evaluate potential cis-regulatory elements through zebrafish transgenesis. Our approach offers significant advantages over cell-culture based techniques for developmentally important genes, since it provides information on spatial and temporal gene regulation. Conversely, it is faster and less expensive than similar experiments in transgenic mice, and we routinely apply it to sequences isolated from the human genome. Here we demonstrate our approach to selecting elements for testing based on sequence conservation and our protocol for cloning sequences and microinjecting them into zebrafish embryos.

We demonstrate our approach to finding potential enhancer elements from developmentally regulated genes and evaluating their function through mosaic zebrafish transgenesis.

Transgénese mosaico Zebrafish de Avaliação Sequências Enhancer

The completion of the human genome sequence, along with that of many other species, has highlighted the challenge of ascribing specific function to non ...

Utilizando larvas de peixe-zebra para estudos eficientes de tumores in vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autor em destaque: Avançando na terapêutica do câncer usando xenotransplante tumoral em peixe-zebra

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Transplante de Tumores Cerebrais Pediátricos de Zebrafish em Hospedeiros Imune-competentes para Estudo a Longo Prazo do Comportamento de Células Tumorais e Resposta a Medicamentos

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Modelo de Zebrafish de Metástase neuroblastoma

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish

Transgénese mosaico Zebrafish de Avaliação Sequências Enhancer

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra

Um método simples, rápido e eficaz para análise de xenotransplante tumoral em embriões transparentes de peixe-zebra