The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + Matar Seleção <ol><li> As linhas celulares <ol><li> Estavelmente NHE-transfectar células deficientes (por exemplo, a linha celular derivada de CCL39 PS120 16) usando qualquer combinação de vector de expressão de mamífero e transfecção método que produza rendimentos eficientes de transfecção e selecção numa linha de células de fibroblastos. NOTA: Para muitos anos de Fosfato de Cálcio precipitação 19 foi utilizado com bons rendimentos de transfecção. Este foi substituída mais recentemente por reagentes comerciais, tais como Lipofectamine2000, as transfecções ser realizadas seguindo as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Soluções <ol><li> Preparar três soluções estéreis descritos como abaixo. Esteriliza-se estas soluções por meio de filtração (0,22 um). <ol><li> Prepara-se uma NH4 + Carregando solução (pH 7,4) composto por 50 mM de NH4Cl, 70 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glucose e 15 mM de MOPS a pH 7,4. </li><li> Prepara-se uma solução de lavagem (pH 7,0) composta por 120 mM de cloreto de colina, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,0. </li><li> Prepara-se uma solução de recuperação (pH 7,4) composto por NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4. </li></ol></li></ol></li><li> Antes de iniciar a selecção, obter uma incubadora de cultura de células que pode ser utilizado a 37 ° C sem adicional de CO 2 a partir do tanque externo (denominado CO 2 - incubadora &quot;livre&quot;), como 5% de CO 2 resultará na memória intermédia que pode prejudicar o acidificação. Amplificar a linha celular que expressa o NHE de interesse até cerca de 2 x 10 8 células (tipicamente cerca de 20 100 placas confluentes mm). </li><li> H + matando procedimento: <ol><li> Incubar as células que expressam o NHE intracelular de interesse durante 1 hora em solução a carregar, em 37 ° C na incubadora de CO 2 -livre. </li><li> Aspirar a solução de carga e, em seguida, lave-os duas vezes na solução descrita-rinse acima. Executar esta etapa eficiente para eliminar o residual extracelular NH4Cl que prejudicaria a criação de um gradiente de NH 4 + íngreme que irá gerar a acidificação. </li><li> Elimine o meio por aspiração e lavagem incubar as células durante uma hora em solução de recuperação de novo a 37 ° C na incubadora de CO 2 livre. </li><li> Substituir o meio de recuperação com meio de cultura normal (tipicamente DMEM com 7,5% de FCS) e as células crescer em condições de cultura padrão (37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 e 95% de ar). </li></ol></li><li> Repetir este ciclo de selecção, duas vezes por semana, até surgir clones estáveis. NOTA: Tome especial cuidado relativo à cultura de células e condições de seleção. Meses de trabalho pode ser arruinada por qualquer contaminação que é mais propenso a oCCur após um longo período de cultura de células e manipulações repetidas. <ol><li> Aqui, escolha se deseja ampliar os clones e caracterizá-los individualmente conforme descrito nas seções 2-3, ou reuni-los em conjunto para gerar uma população celular antes de caracterização. </li></ol></li><li> Aplicar a selecção ocasional (cerca de uma vez a cada duas semanas) para reter as células resistentes à acidificação por contra-selecionar aqueles que podem ter revertido para o sensível ao ácido fenótipo parental (Figura 1B). </li></ol> 2. As medições de pH intracelular 2.1) Imagem de Fluorescência pH <ol><li> Use a ratiometric sensíveis ao pH de corante fluorescente BCECF / AM, que é sensível ao pH quando excitado a 490 nm e possui uma nm ponto isosbestic 445, seguindo os protocolos do fabricante. <ol><li> Em alternativa, utilizar outras sondas sensíveis ao pH, seguindo os protocolos do fabricante. </li></ol></li><li> Use um con imagem definidasisting de um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo de alta sensibilidade. Equipar este conjunto com 450 nm e 490 nm filtros de interferência de banda estreita emparelhados com quartzo adequado filtros de densidade neutra para a excitação. <ol><li> Se possível, use o conjunto adequado de filtros e condições de iluminação para configuração valores de fluorescência comparáveis ​​para λ1 e λ2 para que a relação se aproxima de 1. Além disso, evite valores de fluorescência basais que são definidas quer saturar ou muito baixa, tanto para λ1 e / ou λ2. Isso pode produzir artefatos importantes como então a relação pode não foi detectável embora pH intracelular está mudando. NOTA: Este sistema deve habilitar perfusão rápida, a excitação de lapso de tempo para os dois comprimentos de onda acima mencionados e aquisição no comprimento de onda de emissão própria (535 nm para BCECF). Equipar o sistema com software que permite a aquisição de dados automática e armazenamento. </li></ol></li></ol> 2.2) A medição do NHE Atacante Atividade (Extrusão dePrótons do citosol) <ol><li> Acidifica-se as células por uma incubação de 1 h na solução de NH 4 + Carregando (ver passo 1.4), na ausência de CO 2. </li><li> Adicionar BCECF-AM (5 mM concentração final) para a solução para os últimos cinco minutos e, em seguida, lave-o com NH 4 + solução de carga para eliminar a sonda extracelular. </li><li> Montar as células no microscópio e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável. Perfundir a solução de lavagem (ver acima). Isto resulta numa queda da fluorescência correspondente à acidificação. </li><li> Após a estabilização do pH, perfuse qualquer uma das soluções a seguir para medir as taxas de recuperação de pH mediadas por Li + / H +, Na + / H + ou K + / H + câmbio. Cada solução contém um potencial catião de acoplamento para ser testado para a troca de H +. Se um desses é transportado, isto irá resultar em um aumento de fluorescência a 495 nm que correspgundo a um aumento no pH intracelular: LiCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 KCl 125 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 </li></ol> 2.3) A medição do NHE Atividade Reversa NOTA: O princípio aqui é inverter os gradientes iônicos transmembrana. <ol><li> Antes da medição, carregar as células com o catião intracelular de interesse (ver abaixo). </li><li> Incubar-los por 5 min com BCECF / AM (veja o passo 2.2.2); lavá-los, montá-los no microscópio vídeo. </li><li> Perfundir a solução de carga e tomar várias imagens para gravar uma linha de base estável. </li><li> Depois da estabilização da linha de base, a imagem das variações de pH quando as células são perfundidos com um meio ácido extracelular contendo 120 mCloreto de colina M, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, CaCl 2 2 mM, 5 mM de glicose e 15 mM de MES a pH 6,5. </li><li> Para LiCl carregamento, as células incubar durante 2 horas em uma solução composta de LiCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1 mM, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4. Lítio intracelular medido por espectroscopia de absorção atómica gera um valor de cerca de 60 mM. </li><li> Para carregamento de Na +, incubar as células durante duas horas numa solução composta por 120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl 2, 5 mM de glicose e 15 mM de HEPES a pH 7,4 na presença de 1 mM de ouabaina para bloquear a bomba de Na / K ATPase. Nestas condições, a concentração intracelular de Na + está na gama de 40 mM. NOTA: K + de carga não é necessário, como K + citosólico concentração está na gama de 140 mM e um gradiente dirigido exteriormente-K +, por conseguinte, é fácil de conseguir. </li></ol> 2.4) Tratamento e calibração de dados: NOTA: Este passo é válido tanto para as medições frente e verso. <ol><li> No final de cada experiência, perfundir as células com uma solução de KCl 140 mM, HEPES 20 mM e 5 uM nigericina ajustado a valores de pH entre 6,5 e 7,4. </li><li> Coletar dados como medições de fluorescência a partir das imagens (níveis de cinza que representam os níveis de intensidade) e exportação nos termos do formato de texto e tratar como explicado abaixo usando um programa de planilha. </li><li> Calcular os valores de pH intracelular para cada célula ou região de interesse utilizando a seguinte equação individual: pH = pKa + (Log (R-R min) / (R max -R)) x F min (λ2) / F max (λ2) </li><li> Utilizar a min F (λ2) / F x ma (λ2) proporção, se houver fuga de branqueamento ou sonda, resultando numa diminuição na fluorescência a 450 nm ao longo das experiências. Esta é no entanto muito raramente observada nas condições utilizadas no desexperimentos crita. </li><li> À medida que os dados de calibração estão presentes no final de cada medição de pH, verificar se os valores calculados que correspondem diferentes dos valores de pH utilizados para a calibração. Se for o caso, em seguida, ajustar todos os valores de pH experimentalmente-determinados para a calibração utilizando o seguinte procedimento: <ol><li> Calcula-se o seguinte quociente (Q, a diferença entre os valores medidos / diferença entre os valores de calibração). Multiplique todo o conjunto de dados por Q. fazer o ajuste final por adição ou subtração de modo que os valores calculados serão iguais aos valores de calibração correspondentes. </li></ol></li></ol> 3. Medidas de taxas iniciais do NHE7 pelo FAST Li + Captação <ol><li> Semear as células em placas de múltiplos poços (6 a 24 poços) e acidificam-los usando a técnica de NH 4 + carregamento descrito acima ou, alternativamente, o / albumina de soro bovino (BSA) a acidificação nigericina descrito em 20. </li><li&gt; placas de enxaguamento duas vezes rapidamente com a solução de lavagem acima descrito e, em seguida, incubar as células em soluções de absorção que contêm 1-10 mM de lítio (ligeiramente abaixo) os valores Km e as concentrações desejadas dos catiões e / ou inibidores de interesse para a quantidade desejada de tempo. </li><li> Manter durações de captação de curto e consistentes (tipicamente um minuto ou abaixo) para garantir que o transporte opera em condições de taxas iniciais. Também certifique-se de que todas as soluções utilizadas para a captação são isotônicas. </li><li> No final do tempo de absorção, eliminar cuidadosamente a forma absorção e lavar as células quatro vezes com solução salina de fosfato gelada tamponada (PBS). Realizar estas lavagens tão rápido quanto possível (menos de 10 seg para os quatro deles é ideal) para evitar o efluxo de lítio. </li><li> Lisar as células em 25% de ácido nítrico. Aplicar 250 ul por poço de 25% de ácido nítrico e deixá-lo assentar durante pelo menos 1 h, em seguida, cada poço de sucata com a extremidade da ponta da pipeta e transferir toda a suspensão bem em um novo mitubo crocentrifuge. </li><li> Transferir o lisado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar-los durante 5 minutos a 15.000 x g (temperatura ambiente), para remover os detritos celulares. </li><li> Medir a quantidade de lítio do sobrenadante por espectroscopia de absorção atômica 21. NOTA: Diferentes empresas fornecem espectrometria de absorção atômica, que têm de ser equipado com uma lâmpada de cátodo oco de lítio. Siga as instruções do fabricante como essas máquinas são muito precisos, mas também bastante delicado. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este protocolo descreve como para seleccionar células que expressam intracelular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática, sem alterar a sua sequência primária por mutagénese dirigida ao local. Estes trocadores de agora pode ser caracterizado. Este método baseia-se na toxicidade celular de protões intracelulares para seleccionar linhas celulares que expressam vesicular de Na + / H + permutadores na membrana plasmática. Pode ser pos...

A maioria dos compartimentos intracelulares exibir um pH luminal ácida, o que é um parâmetro essencial para a maturação, o tráfico, a reciclagem de proteínas ou hormônios e neurotransmissores que carregam. Tem sido demonstrado que o gradiente de pH entre o teor de citosol e vesicular é gerado por vacuolar H + ATPase 1, acoplado aos transportadores vesiculares cloreto clc 2. Tanto em camundongos knock-out (KO) e pacientes humanos, a importância desses transportadores tem sido destacada pelos fenótipos pesados ​​causadas por mutações em seus genes 3-6. Os membros da família SLC9A permutadores de sódio a hidrogénio, também denominado por NHE de Na + / H + permutadores, demonstraram ser importantes efectores no pH intracelular e regulação do volume celular, bem como no transporte vectorial de equivalentes de ácido-base entre epitélios . Além dos NHE da membrana plasmática, três altamente conservada de Na + / H + permutadores de NHE 6, 7e 9 são fixados em rede trans-Golgi e no início endosomes 7. As mutações em seus genes têm sido associados com Angelman-like ou Christianson Síndromes 8-9, autismo base familiar 10 e Attention Deficit Disorder Hiperatividade 11-12. Estes trocadores também foram envolvidos em problemas neurodegenerativas, como Alzheimer susceptibilidade à doença 13 e retardo mental genes contíguos X-ligados síndromes 14. Tomados em conjunto, estes estudos destacam a importância desses NHEs intracelulares no desenvolvimento e / ou a função cerebral. A localização intracelular destes trocadores impede medições precisas de sua seletividade ion, direcção de transporte, parâmetros cinéticos, e regulamentação. Como é o caso para todos os transportadores expressos em compartimentos intracelulares, que é extremamente difícil de avaliar as suas actividades bioquímicas e, consequentemente, para compreender totalmente os seus papéis fisiológicos e o mechanismos subjacente suas implicações patológicas. Para a concentração de K + cytosolic alta, a hipótese mais comumente aceita era de que eles estavam trabalhando como K + acoplados transportadores de efluxo de prótons. A existência de uma tal fuga de protões tinham sido implicado, como pode contrabalançar bombeamento de protões pelos V-ATPase, a fim de manter um pH vesicular estado estacionário. O objectivo deste artigo visual é (i) para demonstrar um método que permite a selecção genética de linhas celulares que expressam estes transportadores vesiculares na sua membrana plasmática, e (ii) mostram duas abordagens independentes para medir as funções destes transportadores. Três décadas atrás, Pouysségur e Franchi foram pioneiras na abordagem genética que permitiu a clonagem molecular e caracterização dos membros da família NHE 15. Este baseou-se na toxicidade de protões intracelulares, como um método de rastreio. O primeiro passo foi a obtenção de linhas celulares deficientesem qualquer troca + / H + Na expresso na membrana plasmática, usando a reversibilidade deste transportador. Os fibroblastos (linha celular CCL39) foram pré-carregado com Na + ou Li + e, em seguida, colocado num meio extracelular ácida (pH 6,5) durante 2 h. Isto levou à morte de células que expressam um funcional de Na + / H + e para a troca de selecção de células antiportador-deficiente (linha celular PS120 16). Quando cultivado em meio isento de bicarbonato, estas células são muito sensíveis à acidificação intracelular aguda. Por conseguinte, a expressão de qualquer mecanismo de efluxo de protões funcional na membrana de plasma vai ser seleccionadas positivamente (ver 17), se tais células são submetidas a acidifications intracelulares agudas. Tais técnicas de acidificação pode ser utilizado para isolar as linhas celulares com defeitos tráfico que permitam a expressão forçada de NHE intracelulares WT na membrana plasmática. Como eucariota Na + / H+ Trocadores são electroneutral, eles não são mensuráveis ​​pelas abordagens eletrofisiológicos que têm sido utilizados com grande sucesso para medir canais. Assim, o presente artigo propõe demonstrar como medir a atividade desta trocador por medições de pH intracelulares e rápida cinética de absorção de lítio. Como os conceitos subjacentes são o mesmo, é interessante notar que muitos dos processos desenvolvidos para a secção de selecção, também são utilizados directamente para medições funcionais. Curiosamente, observou-se que o defeito tráfico presentes nas linhas de células seleccionadas utilizando a abordagem descrita neste manuscrito conduz a uma maior expressão de outras proteínas vesiculares na membrana do plasma, tais como o canal de potássio vesicular TWIK1 18. Isso aponta para a seleção de um mecanismo geral defeito de retenção de proteínas transmembrana vesiculares. Assim, este processo de selecção e as células que gera Maioconstituem uma ferramenta promissora para a comunidade científica que trabalha em proteínas da membrana de compartimentos intracelulares. Como bem as técnicas de medição apresentados aqui podem ser aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores não-electrogénico.

<table><tbody><tr><td>Standard cell culture equipement</td><td></td><td></td><td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Incubator with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sanyo</td><td>MCO15A</td><td></td></tr><tr><td>Incubator without CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Heraeus instrument</td><td>BB6220</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood PSM1200NF</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>52010120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 10x</td><td>PAA</td><td>L11-003</td><td></td></tr><tr><td>Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td><td>Thermo Scientific</td><td>ICE 3500 GFZ</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>sigma</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence videomicroscopy set</td><td>Leica</td><td></td><td>Composed of many devices with different catalog numbers</td></tr><tr><td>Inverted automated microscope</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>microscope stand</td><td>leica</td><td>11888906</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888911</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888377</td><td></td></tr><tr><td>incident fluorescence</td><td>leica</td><td>11888901</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11504166</td><td></td></tr><tr><td>motor bracket</td><td>leica</td><td>11888379</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11505234</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521505</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11522106</td><td></td></tr><tr><td>LED transmission light&amp;nbsp;</td><td>leica</td><td>8097321</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>8102034</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521580</td><td></td></tr><tr><td>motorized plate</td><td>leica</td><td>11522068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11531172</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521734</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11521719</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888423</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888424</td><td></td></tr><tr><td>camera output</td><td>leica</td><td>11888373</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11507807</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888393</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888259</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11888258</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11541510</td><td></td></tr><tr><td>images acquisition/analysis software</td><td>leica</td><td>11888375</td><td></td></tr><tr><td>optics</td><td>leica</td><td>11506507</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506243</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11506203</td><td></td></tr><tr><td>fluorescence Xenon lamp</td><td>leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>camera</td><td>hamamatsu</td><td>8100601</td><td></td></tr><tr><td>metafluor/Mmfluor software</td><td></td><td>11640905</td><td></td></tr><tr><td>pH sensitive probe, BCECF-AM</td><td>life technologies</td><td>B1170</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma</td><td>N7143</td><td></td></tr></tbody></table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

Acidificação endossomal é crítica para uma vasta gama de processos, tais como a reciclagem e degradação de proteínas, dessensibilização do receptor e neurotransmissor em vesículas sinápticas carregamento. Esta acidificação é descrito para ser mediada por ATPases de protões, acoplados a transportadores de cloreto clc. Altamente conservada prótons electroneutral transportadores, do Na + / H + trocadores (NHE) 6, 7 e 9 também são expressos nestes compartimentos. As mutações nos seus genes foram ligados com doenças cognitivas e doenças neurodegenerativas humanas. Paradoxalmente, seus papéis são ainda imperceptíveis, como a sua localização intracelular impediu a caracterização funcional detalhado. Este manuscrito apresenta um método para resolver este problema. Esta consiste na selecção de linhas de células mutantes, capazes de sobreviver a acidificação citosólica aguda retendo NHE intracelular na membrana plasmática. Em seguida, ele mostra dois protocolos complementares para medir a seletividade e atividade iondestes permutadores de: (i) uma base em medições de pH intracelular por meio de microscopia de fluorescência de vídeo, e (ii) uma base na cinética de absorção rápida de lítio. Esses protocolos podem ser extrapolados para medir outros transportadores não-electrogénico. Além disso, o processo de selecção aqui apresentada gera células com um fenótipo de retenção intracelular defeituosa. Por conseguinte, estas células expressam também outras proteínas da membrana vesicular na membrana plasmática. A estratégia experimental descrito aqui pode, portanto, constituir um instrumento potencialmente poderoso para estudar outras proteínas intracelulares que será, então, expressa na membrana plasmática vesicular, juntamente com o Na + / H + permutadores utilizados para a selecção.

Seleção: A selecção H + matando baseia-se na difusão da amónio base fraca, tal como representado na Figura 1A. O efeito de bases fracas e ácidos difusão no pH intracelular foi iniciada por Walter Boron e colaboradores 22. A idéia elegante para usar este fenômeno para produzir uma acidificação letal para a seleção genética positiva foi então desenvolvido por Jacques Pouysségur 17. De acordo com um protocolo deste tipo, o pH in...

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Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K visualizações.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

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Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Bioquímica

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologia

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined lipid composition. We are studying the lipid-dependent gating effects in a prototype voltage-gated potassium (Kv) channel, and have worked out detailed procedures to reconstitute the channels into different membrane systems. Our reconstitution procedures take consideration of both detergent-induced fusion of vesicles and the fusion of protein/detergent micelles with the lipid/detergent mixed micelles as well as the importance of reaching an equilibrium distribution of lipids among the protein/detergent/lipid and the detergent/lipid mixed micelles. Our data suggested that the insertion of the channels in the lipid vesicles is relatively random in orientations, and the reconstitution efficiency is so high that no detectable protein aggregates were seen in fractionation experiments. We have utilized the reconstituted channels to determine the conformational states of the channels in different lipids, record electrical activities of a small number of channels incorporated in planar lipid bilayers, screen for conformation-specific ligands from a phage-displayed peptide library, and support the growth of 2D crystals of the channels in membranes. The reconstitution procedures described here may be adapted for studying other membrane proteins in lipid bilayers, especially for the investigation of the lipid effects on the eukaryotic voltage-gated ion channels.

Procedures for complete reconstitution of a prototype voltage-gated potassium channel into lipid membranes are described. The reconstituted channels are suitable for biochemical assays, electrical recordings, ligand screening and electron crystallographic studies. These methods may have general applications to the structural and functional studies of other membrane proteins.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canais e Transportadores

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Membrane Transport Processes Analyzed by a Highly Parallel Nanopore Chip System at Single Protein Resolution

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable efforts have been made in this field, but techniques enabling automated high-throughput transport analysis in combination with solvent-free lipid bilayer techniques required for the analysis of membrane transporters are rare. This class of transporters however is crucial in cell homeostasis and therefore a key target in drug development and methodologies to gain new insights desperately needed.
The here presented manuscript describes the establishment and handling of a novel biochip for the analysis of membrane protein mediated transport processes at single transporter resolution. The biochip is composed of microcavities enclosed by nanopores that is highly parallel in its design and can be produced in industrial grade and quantity. Protein-harboring liposomes can directly be applied to the chip surface forming self-assembled pore-spanning lipid bilayers using SSM-techniques (solid supported lipid membranes). Pore-spanning parts of the membrane are freestanding, providing the interface for substrate translocation into or out of the cavity space, which can be followed by multi-spectral fluorescent readout in real-time. The establishment of standard operating procedures (SOPs) allows the straightforward establishment of protein-harboring lipid bilayers on the chip surface of virtually every membrane protein that can be reconstituted functionally. The sole prerequisite is the establishment of a fluorescent read-out system for non-electrogenic transport substrates.
High-content screening applications are accomplishable by the use of automated inverted fluorescent microscopes recording multiple chips in parallel. Large data sets can be analyzed using the freely available custom-designed analysis software. Three-color multi spectral fluorescent read-out furthermore allows for unbiased data discrimination into different event classes, eliminating false positive results.
The chip technology is currently based on SiO2 surfaces, but further functionalization using gold-coated chip surfaces is also possible.

The presented protocol describes the analysis of membrane protein mediated transport on the single transporter level using pore-spanning solvent-free lipid bilayers. This is achieved by the creation of bulk produced nanopore array chips, combined with highly parallel data acquisition and analysis, enabling the future establishment of membrane protein effector screenings.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Membrane protein transport on the single protein level still evades detailed analysis, if the substrate translocated is non-electrogenic. Considerable ...

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. These transport mechanisms are mediated by the activities of specialized transporter proteins. Specifically,pH dynamics are finely controlled by plasma membrane proton (H+) extrusion systems, such as the Na+/H+ exchanger (NHE) protein family. Despite extensive efforts to study the mechanisms underlying NHE regulation, our current understanding of the biophysical and molecular properties of the NHE family is inadequate because of the limited availability of methods to effectively measure NHE activity. In this manuscript, we used H+-selective electrodes during whole-cell patch clamping recording to measure NHE-induced H+ flux. We proposed this approach to overcome some limitations of typically used methods to measure NHE activity, such as radioactive uptake and fluorescent membrane permeants. Measurement of NHE activity using the described method enables high sensitivity and time resolution and more efficient control of intracellular H+ concentrations. H+-selective electrodes are based on the fact that transporter activity creates an ion gradient in close proximity to the cell membrane. An H+-selective electrode moving up to and away from the cell membrane in a repetitive, oscillatory fashion records a voltage difference that is dependent on H+ flux. While H+-selective electrodes are used to detect H+ flux moving out of the cell, the patch clamp method in the whole-cell configuration is used to control the intracellular ion composition. Moreover, application of the giant patch clamp technique allows modification of the intracellular composition of not only ions but also lipids. The transporter activity of NHE isoform 3 (NHE3) was measured using this technical approach to study the molecular basis of NHE3 regulation by phosphoinositides.

This manuscript describes the applications of proton-selective electrodes and patch clamping methods to measure the activity of proton transport systems. These methods overcome some limitations of techniques commonly used to study proton transport activity, such as moderate sensitivity, time resolution and insufficient intracellular milieu control.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Caracterização funcional de Na

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

Seleção de nanomá corpos inibitórios direcionados ao transporte por eletrofisiologia baseada em membrana sólida (SSM)

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl

Membrane Transport processos analisados por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

Caracterização funcional de Na

Resumo

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Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

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Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em

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A proteolipossoma-Based Efluxo Ensaio para determinar as propriedades de uma única molécula de Cl

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

Membrane Transport processos analisados por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual