We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1. Dissecção de tecido e fixação (60 min) <ol><li> Para cérebros de Drosophila, colocar larvas 3rdin uma gota de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato). Escolha grande larvas 3º que estão rastreando ativamente de frascos ou garrafas que não estão superlotadas. <ol><li> Use um par ultrafine pinça para agarrar os ganchos na boca e outro par de pinça para agarrar 2/3 para baixo o comprimento do corpo (Figura 1A, B). Puxe delicadamente sobre os ganchos na boca para expor o cérebro, os gânglios ventral, glândulas salivares e parte do trato digestivo das larvas. Use as pinças para separar o cérebro e gânglios ventral (Figura 1A, B) a partir de outros tecidos e introduzi-lo numa gotícula de 1x PBT (salino tamponado com fosfato com Tween) numa placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para Nasonia dissecções testículo, escolha do sexo masculino pupas 3 dias de idade (corpos amarelos com olhos vermelhos). Masculino Nasonia têm comprimentos pequenos almofada asa em relação à females durante a fase de pupa (Figura 1C). <ol><li> Segure a pupa, na parte superior do abdômen, perto da região torácica, com um par de pinça, e usando o outro par de pinça, pegue a ponta muito distal do abdômen e retirar os testículos lágrima em forma de gota (que será cercado por gordura corpo que pode ser abalado suavemente; Figura 1D). Retire qualquer parte do corpo exteriores dos testículos, o que evitará esmagamento adequada, e coloque em uma gota de 1x PBT em uma placa de Petri de plástico. </li></ol></li><li> Para cada slide, dissecar um total de quatro ou cinco amostras de tecido (ie., Drosophila cérebros larval ou testículos Nasonia). NOTA: Mais de cinco amostras levará a núcleos superlotadas e cromossomos. </li><li> Opcionalmente, para conseguir alguma separação de cromátides irmãs em regiões eucromáticos de cromossomos mitóticos, tratar o tecido com uma solução hipotônica: transferir cérebros de 1x PBT para uma gota de citrato de sódio a 0,5% para 5-10 (não mais do que 10) min. NOTA: A colchicina (um inibidor da mitose) pode ser útil para aumentar o número de figuras de mitose na metáfase 11. No entanto, o seu uso é desnecessário se muito grande larvas saudáveis ​​são usados, e até mesmo indesejável, pois pode afetar negativamente a resolução cromossomo, espalhando e morfologia. </li><li> Coloque uma gota (~ 20 ul) de solução fixadora (2,5% de paraformaldeído em ácido acético 45%) sobre a superfície de uma lamela de cobertura tratadas com Sigmacote limpo. NOTA: Certifique solução fixadora nova para cada dia de uso. Soluções fixadoras que variam 1,8-3,7% de paraformaldeído em ácido acético 45% produzir os melhores resultados para os peixes. Usando diferentes do cérebro ou testículos tecidos, ou adaptar este protocolo de imuno-FISH pode exigir experimentando com diferentes fixadores (para uma lista de diferentes fixadores, ver 12). </li><li> Transferir cuidadosamente cada amostra de tecido a partir do tampão de dissecação (1x PBT) na gotícula fixador com pinças ultrafinas, minimizing a transferência de tampão de dissecação para a solução fixadora. Colocar as amostras de tecido de modo a que eles estão uniformemente espaçados uns dos outros no interior da gotícula de fixador. Incubar os tecidos em fixador durante 4 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Com cuidado, coloque um slide rosto poli-revestido de lisina para baixo para o deslizamento de tecido e tampa. Não pressione a este ponto, mas sim permitir que os dois entrar em contato com levemente para que a lamínula varas para o lado de baixo do slide. Inverter o slide para que o deslizamento tampa está no topo. </li><li> Sanduíche do deslizamento slide / tecido / cobertura dentro de um pedaço dobrado de papel de filtro. Em uma superfície estável, usando o polegar, pressione muito firmemente em linha reta para baixo para a posição diretamente acima da lamela. Tenha cuidado para evitar deslizamento lateral da lamela (isso irá provocar manchas do tecido). </li><li> Mergulhe o slide / tecido / tampa de deslizamento em nitrogênio líquido (ver aparelho na Figura 1E, F), e deixe descansar até que o nitrogênio pára fervente (não é fINE). Remover o slide e encaixe imediatamente a lamínula com uma lâmina de barbear fresco sacudindo um canto da lamínula em um sentido ascendente (evitar riscar o tecido fixado com a lâmina de barbear). <ol><li> O pré-resfriamento do slide / tecido / lamela em um bloco de gelo seco, tampa escorregar, por 1-2 min antes de submergir em nitrogênio líquido vai ajudar a prevenir os slides de rachar. </li></ol></li><li> Colocar imediatamente o diapositivo com o tecido em um frasco Coplin preenchido com etanol a 100% à temperatura ambiente e deixar em repouso durante pelo menos 5 minutos (este tempo pode ser mais longo, se necessário). NOTA: etanol a 100% frio também poderia ser utilizado. </li><li> Remover o slide com o tecido, pavio fora excesso de etanol com uma Kimwipe (sem tocar no tecido fixo), e deixar o slide ao ar seco por 1 hora. <ol><li> Prossiga diretamente para a etapa 2 ou manter lâminas secas em baixa umidade do ar ou em uma câmara de dessecação por semanas a até meses antes de realizar a hibridação. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) A 3 rd instar Drosophila larva (à direita), com posições indicadas por onde pegar os ganchos na boca (indicado com *) e 2/3 do caminho para baixo as larvas para dissecar cérebros; (À esquerda) uma vista esquemática de uma larva de uma mesma fase de desenvolvimento, que descreve a posição relativa do cérebro no interior da cabeça de larvas. (B) O cérebro e gânglios dissecados a partir de uma ventral 3 Drosophila larva de terceiro instar (direita) e uma representação esquemática do presente tecido (à esquerda). pupa Nasonia (C) 3 dias de idade, em fase de olhos vermelhos corpo-amarelo. (D) Um par testis dissecado a partir de um velho pupa macho Nasonia 3 dia (à direita) com posições indicando onde pegar a pupa no posterior do abdómen (denotado com *) e a meio caminho no corpo; (À esquerda) esquemático masculino que descreve e feminino foip pupas; pupas macho pode ser distinguido pelas asas que não se estendem passado o perfil sagital (seta preta), em contraste com as fêmeas, que têm asas que se estendem para além do perfil; a posição relativa do par de testículo é mostrado na pupa de macho. (E) O aparelho de uma sequência de clipes-e método (F) utilizadas para mergulhar as lâminas em um vaso de azoto líquido. Várias cordas paperclip pode ser utilizado para a imersão simultânea de múltiplas lâminas. 2. A hibridação in situ (30 minutos no dia 1; 1 hr-2,5 h para sondas longas-no dia 2) <ol><li> Adicionar 1 ul (100 ng) de cada sonda de 20 ul de tampão de hibridação de 1,1x. Pipetar sonda / tampão de hibridação sobre a superfície do tecido fixado (evitar tocar no tecido). </li><li> Com cuidado, coloque uma lamela diretamente sobre o tampão sonda / hibridação, certificando-se de que a tampa de deslizamento é centrado diretamente sobre o tecido. O tampão deve migrar para poenviar um e borda externa da tampa de deslizamento, sem deixar bolhas de ar. Nota: Pequenas bolhas que não contactam tecido não colocam quaisquer problemas para o procedimento. Remover grandes bolhas com cuidado levantando um canto da lamela e cuidadosamente soltando-o de volta para o slide. </li><li> Coloque o deslizamento slide / tecido / cobertura sobre a superfície de um bloco pré-aquecido a 95 ° C (cover escorregar). Cubra com um pedaço grande de papel alumínio para evitar a exposição à luz. Com o deslizar incubar a 95 ° C durante 5 min. NOTA: Um bloco de calor típico com furos para tubos podem ser viradas para proporcionar uma superfície plana para colocar o slide / tecido / lamela. </li><li> Retire o slide, deixando-a esfriar um pouco até que esteja quente ao toque. Cuidadosamente enrole um pedaço de Parafilm esticada ao redor da lamínula para selar o líquido abaixo dela. </li><li> Colocar a lâmina selada dentro de uma câmara de humidade e colocar a câmara numa incubadora com uma pré-aquecido a 30 ° C. Incubar a 30 ° C durante 4 h até durante a noite.<ol><li> Criar uma câmara de umidade a partir de uma caixa de ponta vazio ou recipiente Tupperware pálpebras com Kimwipes umedecidas ou toalhas de papel colocadas na parte inferior. NOTA: As sondas de oligo de ADN de cadeia simples foram concebidos para ser 28-33 bases para alcançar uma temperatura de fusão teórica (T m) dos 45-47 ° C. Estes m varia de comprimento e T refletir o fato de que muitas seqüências repetitivas que estudamos são AT-ricos e, portanto, têm baixo teor de GC. Sondas maiores, provavelmente, têm valores maiores M T; isto pode resultar em maior fundo de hibridação à temperatura de hibridação padrão de 30 ° C. Assim, resolução de alguns problemas com as temperaturas de hibridação podem ser necessários para obter os melhores resultados. Para encontrar a melhor temperatura de hibridização, aumento (ou redução) a temperatura de 5 ° C, de forma incremental. </li></ol></li><li> Retire cuidadosamente o Parafilm do slide e, em seguida, retire cuidadosamente a cobertura de vidro, levantando lentamente um canto. Wash o slide três vezes para 15 min cada lavagem em tampão SSC 0,1x. Cubra o recipiente Coplin com folha de alumínio durante as lavagens para minimizar a exposição à luz. </li><li> Se não estiver usando uma sonda biotinilado longa, vá para o passo 2.8. <ol><li> Se estiver usando uma sonda longa biotinilado, secar a área em volta do tecido com um Kimwipe, tomando cuidado para não tocar no próprio tecido. Coloque 100 ml de solução sobre o tecido bloqueio e cobrir suavemente com uma lamela, tomando cuidado para evitar bolhas de armadilhagem. Enrole a deslizar sobre a lamela com Parafilm e lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela e secar ao redor do tecido com um Kimwipe. Pipet 100 l de rhodamine-avidina diluído 1: 1.000 em cuidados SBT sobre o tecido e cubra delicadamente com uma lamela, tomando para evitar a captura de bolhas. Enrole a deslizar sobre a lamela com Parafilm e lugar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remova cuidadosamente a lamela e lavar o slide 3 vezes por 5 minutos cada em 4x SSCT e depois3 vezes por 5 minutos cada em 0,1x SSC. NOTA: As lâminas podem ser lavadas por longos períodos de tempo. </li></ol></li><li> Remover o slide e secar ao redor do tecido com um Kimwipe seco para remover o excesso de tampão (evite tocar no tecido). Coloque o lado do tecido slide-up em um local escuro durante 10-15 minutos ou até que a umidade se dissipa completamente. </li><li> Pipetar 11 ul de meio de montagem Vectashield (com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole-DAPI) sobre o tecido. Com cuidado, coloque uma lamela limpa (não tratados com Sigmacote) diretamente sobre o centro do meio de montagem e tecido. O meio de montagem deve migrar lentamente para fora, para as bordas da lamínula. NOTA: Se o meio de montagem não conseguir atingir a extremidade da lamela em todos os lados, em seguida, um adicional de 1-2 uL de meio de montagem pode ser aplicada a uma posição na borda da lâmina de cobertura para preencher o volume necessário. Neste caso, certifique-se de limpar qualquer excesso médio da superfície do slide antesvedação. </li><li> Selar as bordas da lamínula com unha polonês. Evite pintar a unha polonês sobre a amostra de tecido. </li><li> Coloque o slide na posição vertical em um local escuro e deixar a unha seca polonês até que esteja completamente rígido (normalmente, 30 min ou mais). Neste ponto, a imagem do tecido ou armazenar a -20 ° C durante até 1 semana mais tarde para a imagiologia. </li></ol> Buffer / Receitas Solution 10x PBS <ul><li> 80 g de NaCl </li><li> 2,0 g de KCl </li><li> 14,4 g de Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g de KH 2 PO 4 </li><li> pH para 7,4, H2O a 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml de PBS 10x </li><li> 45 ml de H2O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g de NaCl </li><li> 88,2 g de Na Citrato </li><li> em 800 ml de H2O </li><li> pH a 7, H2O a 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml de 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% de Tween 20 </li></ul> 0,1x SSC <ul><li> 5 ml de 20x SSC </li><li> 995 ml de H2O </li></ul> Mistura de hibridação (20 ul; modificado a partir do 11) <ul><li> 10 ul de formamida </li><li> 4 ul de 50% de sulfato de dextrano </li><li> 2 ul de 20x SSC </li><li> 4 ul de H2O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 0,01 g de Albumina de Soro Bovino (BSA) </li><li> 10 ul de Tween 20 </li><li> 7,9 ml de H2O </li></ul> A solução de bloqueio 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g de BSA </li><li> 10 ul de Tween 20 </li><li> 2 ml de 20x SSC </li><li> 8 ml de H2O </li></ul> Solução fixadora com paraformaldeído (1 ml) <ul><li> 393,75 ul H 2 O (adicione água primeiro) </li><li> 450 ácido acético glacial ul </li><li> 156,25 ul 16% de paraformaldeído </li></ul>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISH é freqüentemente usado para mapear sequências específicas para os cromossomas. Nós descrevemos um método simples para o ADN ISH optimizado para elevado número de cópias, sequências de heterocromatina. Em vez de utilizar lavagens numa solução de formamida, que é um requisito em outros protocolos ISH ADN existentes, colocamos lâminas montadas-tecido directamente sobre um bloco de pré-aquecida para desnaturar o ADN. Este método evita o uso de grandes quantidades de formamida. Um passo fundamental par...

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Sondas para regiões de cópia única dentro euchromatin pode ser gerado através de um punhado de abordagens, incluindo nick-tradução ou de fim-de rotulagem dos produtos de ADN longas 1,2 ea incorporação de deoxygenin (DIG) nucleotídeos -attached e seu reconhecimento através de uma ampla variedade de anticorpos conjugados do grupo 1-3. Visualização das sequências eucromáticos em poucos ou número único de cópia requer a utilização quer de sondas individuais grandes, com uma actividade específica elevada ou um cocktail de sondas múltiplas mais pequenas, que aumentam colectivamente sinal. Em contraste, as sequências altamente repetitivas encontradas na heterocromatina, tais como DNAs satélite, são alvos mais fáceis para DNA ISH porque normalmente existe como dezenas de milhares de repetições agrupados em regiões cromossômicas únicos conhecidos como blocos. Elementos de transposição também pode serencontrado em altos números de cópia na distinta loci cromossômica 2. Nestes casos, as sondas individuais com baixa actividade específica pode rotular eficazmente sequências de heterocromatina, devido à sua hibridação em múltiplos locais. Sondas para seqüências repetitivas podem ser sintetizados oligonucleotídeos comercialmente como curtos (30-50 pb) e quimicamente conjugado com qualquer um dos vários grupos fluorescentes diferentes. Mapeando seqüências repetitivas dentro heterochromatin por meio de tecnologias de sequenciamento do genoma-se difícil devido aos desafios enfrentados em andaimes de construção dentro de blocos de satélite altamente repetitivas 4-6,7. Atualmente, ISH se destaca como a forma mais eficaz de mapear essas seqüências ao nível sub-cromossomo. Essa estratégia é importante para o mapeamento de um grande número de sequências repetitivas que estão sendo descobertos por estudos de genoma e transcriptoma de sequenciamento em curso. A eficiência e facilidade de mapeamento de seqüências repetitivas nos cromossomos-montado slides seria greatly reforçada por um protocolo simplificado de DNA ISH. Por exemplo, os protocolos existentes para ADN ISH envolver múltiplas lavagens de tecidos hibridados em solução de formamida a 2,8, adicionando assim substancialmente para o tempo requerido para as sequências de mapeamento e também a produção de grandes quantidades de resíduos químicos para este reagente dispendioso. Aqui nós descrevemos um método DNA ISH revista que contorna a necessidade de lavagens formamida e utiliza equipamentos básicos de laboratório e reagentes. Este método foi originalmente projetado para o rápido mapeamento de seqüências de DNA altamente repetitivos em regiões heterocromáticas de neuroblastos de larvas de Drosophila usando oligos sintetizados no mercado que são conjugados com corantes fluorescentes. No entanto, este método também funciona para o mapeamento de seqüências repetitivas usando sondas maiores sintetizados através de outros meios 9,10 e em vários tipos de tecidos e de cromossomos diferentes. Além disso, este método pode ser utilizado para mapear sequências eucromáticos utilizando mais ou multiple, sondas curtas dentro da sequência euchromatic de interesse.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

ADN de hibridação in situ (ISH ADN) é um método vulgarmente utilizado para mapeamento de sequências para as regiões cromossómicas específicas. Esta abordagem é particularmente eficaz em mapeamento de sequências altamente repetitivas para regiões heterocromáticas, onde abordagens computacionais enfrentam desafios proibitivos. Aqui nós descrevemos um protocolo simplificado para DNA ISH que contorna lavagens formamida que são etapas padrão em outros protocolos de DNA ISH. Nosso protocolo é otimizado para a hibridação com sondas de DNA vertente individuais curtas que levam corantes fluorescentes, o que efetivamente marcam sequências de DNA repetitivas dentro de regiões cromossômicas heterocromáticos através de um número de diferentes tipos de tecidos do inseto. No entanto, os pedidos podem ser estendido para usar com sondas maiores e visualização de sequências de DNA única cópia (não repetitivo). Demonstramos esse método mapeando várias sequências repetitivas diferentes de cromossomos esmagados de Drosophila melanogaster células neurais e Nasoniavitripennis espermatócitos. Mostramos padrões de hibridização, quer para pequenas sondas, sintetizados comercialmente e para uma sonda maior para comparação. Este procedimento utiliza material de laboratório simples e reagentes, e é ideal para os investigadores que têm pouca experiência com a realização de DNA ISH.

Para demonstrar este método, que hibridou um conjunto de pequenos oligonucleótidos sintetizados comercialmente que foram quimicamente modificados com conjugados fluorescentes (Figura 2) e uma sonda mais longa biotinilado (feita através de tradução por cortes de um produto de PCR; Figura 2B), a partir de vários tecidos cromossomas diferente tipos (ver Tabela 1). As sequências alvo incluídas repete satélite localizadas em regiões (pericentroméricas heterocromá...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.0K visualizações.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Vídeo: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genética

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação em cromossomos mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Imunologia e Infecção

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Biologia

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biologia do Desenvolvimento

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

Hibridização in situ fluorescente em preparações de halo de DNA para revelar cromossomos inteiros, telômeros e loci gênicos

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH: Uma técnica de hibridização in situ de fluorescência para detectar DNA viral em células infectadas

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

Método simples para DNA de Fluorescência

Resumo

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