The following agencies provided critical funding support for this study: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), Dana Foundation (A.Y.H.), St. Baldrick&#8217;s Foundation (A.Y.H.), Alex&#8217;s Lemonade Stand Foundation (A.Y.H.), Gabrielle&#8217;s Angel Foundation (A.Y.H.) and Hyundai Hope-on-Wheels Program (A.Y.H.). The authors are thankful for the indispensable help of Jerry Silver and Sarah Busch in learning the Dorsal Column Crush (DCC) injury. The authors are also grateful to Jingquang You, Elisabeth Hare and Hongmei Hu for technical help with genotyping and Ross Anderson for mounting the spinal stabilizing unit.

NOTA: Todos os animais devem ser alojados e utilizados em conformidade com o cuidado com os animais e uso comissão (IACUC) na instituição. Todos os procedimentos aqui descritos são aprovados pela Case Western Reserve University IACUC. 1. Animais Transgénicos <ol><li> Use ratos repórter fluorescentes disponíveis comercialmente para rotular axônios (Thy-1 YFP H) 50 e microglia / monócitos (CX3CR1 GFP / GFP 51; veja a lista de materiais). Estes ratos devem ser entrecruzadas e mantida como colônias de reprodução individuais de acordo com as políticas de cuidados de animais institucionais. </li></ol> 2. Medula Óssea Quimeras <ol><li> Identificar os animais que são, pelo menos, 8 semanas de idade para utilização como animais receptores. </li><li> Coloque animais hospedeiros em uma irradiação segurando gaiola circular projetado para segurar o mouse em uma posição para assegurar mesmo, toda irradiação de corpo. </li><li> Definir o temporizador em um de césio (Cs-137) irradiador para administrar um dos radiação de corpo inteiroidade de 800-1.000 Rads para os animais de acordo com as instruções do fabricante (exemplos aqui apresentados são 980 Rads). </li><li> Animais e volta às suas gaiolas para descansar durante um mínimo de 4 h. </li><li> Escolha animais dadores com o genótipo apropriado (ver Figura 2A) como a fonte de células progenitoras da medula. NOTA: Os doadores adequados são animais que expressam diferentes repórteres fluorescentes de linhagem específica do host para identificar populações de células diferentes, ou um do mesmo genótipo como controles. </li><li> Encha uma placa de Petri com 70% de álcool, e um segundo prato com 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meios de comunicação e um coador de 40 um celular embebido na mídia. Encha um tubo cônico de 15 ml com meio RPMI. Mantenha os pratos e tubo em gelo. </li><li> Sacrifício dos animais dadores por asfixia com CO2 de acordo com as diretrizes institucionais. Limpe a pele e pêlo, mergulhando todo o animal com etanol a 70% até que toda a pele está molhada. </li><li> Remover o ska partir da metade inferior de subprodutos animais de corte em torno da secção média e puxar a pele para baixo sobre as patas traseiras para expor totalmente os músculos da perna. </li><li> Retire a tíbia pelo overextension anterior na articulação do joelho para deslocar o osso, em seguida, usando uma pinça e tesouras estéreis, descasque e corte músculos longe de ambas as extremidades da tíbia. Coloque o osso na placa de Petri com álcool por até 30 segundos, em seguida, transferir para o filtro de células no interior da placa de Petri contendo os meios de comunicação. </li><li> Deslocar a articulação do quadril e descascar as músculos ligados ao fêmur, colocou o brevemente fêmur em álcool e, em seguida, colocá-lo no mesmo filtro de células dentro do prato. </li><li> Num capuz de cultura de tecidos, estéreis utilize uma tesoura para cortar ambas as extremidades dos ossos e inserir uma agulha de calibre 21 numa seringa de 1 ml na extremidade do osso. Lave a medula no cônico de 15 ml com a mídia. Repita os procedimentos para os ossos restantes. </li><li> Usando a parte traseira do êmbolo de uma seringa de 3 ml, osso esmagamento termina na célulafiltro na caixa de Petri para extrair mais células. </li><li> Colocar o filtro no topo de um tubo de 50 ml e transferir meios com células aspiradas a partir do tubo de 15 ml. Utilizar a parte de trás do êmbolo para esmagar a medula, a fim de se obter uma suspensão de célula única. Lave as tubo de 15 ml, fragmentos de ossos e do filtro de células com 30 ml de mídia em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifuga-se as células durante 5 min a 500 xg para sedimentar as células. </li><li> Lisar os glóbulos vermelhos com 2 ml de cloreto de amónio-potássio-(ACK) de tampão de lise durante 2 min. Extingue-se o tampão de lise com 10 ml de meio contendo 10% de soro fetal bovino. Centrifugar a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar. </li><li> Lave as células uma vez em 10 ml de meio RPMI e duas vezes em solução salina, centrifugação a 500 xg durante 5-10 min para sedimentar para cada lavagem. </li><li> Ressuspender as células até uma concentração final de 3 x 10 6 células em 200 ul de solução salina. </li><li> Transferência de 3 x 10 6 células da medula através de injecção na veia da cauda em irradiated ratinhos receptores. </li><li> Coloque água acidificada (pH 3,0) na gaiola destinatário e permitir que os ratos a se recuperar. NOTA: Os ratos que não o transplante vai morrer dentro de 10-14 dias após o procedimento. </li><li> Após 8 semanas, verificar a reconstituição de medula examinando as células imunes do sangue periférico, utilizando citometria de fluxo (Figura 2B-C). </li></ol> 3. Coluna Dorsal lesão por esmagamento NOTA: Escolha animais quimera adequadas ou animais transgénicos duplos para cirurgia com base na experiência desejada. Animais com células derivadas de medula óssea, quer residentes ou marcadas foram criados nas etapas anteriores. <ol><li> Preparar e autoclave instrumentos cirúrgicos, incluindo rongeurs, Dumont # 4 pinças, tesouras, pinças de íris para tecidos que prendem, motoristas de agulhas e grampos de sutura. </li><li> Prepare medicamentos a administrar aos ratos para controle da dor. Bupernex e Marcaine são comumente usados ​​para o controle da dor. Use medicamentos apropriados, como requer and aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC). </li><li> Induzir a anestesia com 4% de isoflurano e manter com 1-2% de isoflurano para alcançar uma taxa de respiração de 60-100 respirações por minuto. Aplique lubrificante ocular para os olhos do animal para evitar a secura sob anestesia e confirmar a ausência de resposta a pé pitada. Manter a temperatura usando uma almofada de aquecimento e monitorar a temperatura através de uma sonda retal. </li><li> Raspar o dorsal do rato, com uma máquina de barbear eléctrica sobre o nível da medula espinal alvo, e, em seguida, limpar a área três vezes com solução de povidona-iodo seguido por duas vezes com 70% de álcool. Colocar o animal em um campo estéril, e cobrir o animal com uma outra cortina estéril com um buraco cortado em um local apropriado para a visualização do local da cirurgia. Manter todas as ferramentas em campos estéreis durante toda a cirurgia. </li><li> Cortar a pele ao longo da linha média da coluna vertebral ao nível desejado com íris tesoura para expor o músculo no dorso do animal. </li><li> Sob uma Dissecting microscópio, cortar os músculos das costas, incluindo o trapézio e os ligamentos do grande dorsal ao longo da linha média, onde eles atribuem aos processos espinhosos dorsais, e expor a coluna vertebral. </li><li> Remover os músculos rotadores entre os processos dorsais e transversais da vértebra para revelar a lâmina da vértebra específico a ser removido (T11, neste caso). Identificar T11 através da inserção da última costela não flutuante para este processo. </li><li> Insira dicas de rongeurs no espaço acima e abaixo do processo a ser removido e levantar um pouco para se certificar de que eles estão bem encaixados em torno da lâmina vertebral, mas não é muito profundo para ferir a coluna vertebral. Fechar rongeurs em um movimento para remover a lâmina. </li><li> Ampliar a laminectomy conforme necessário usando os fórceps para remover pequenas partes da vértebra restante. </li><li> Medida 1 mm a partir das dicas de # 4 pinça segurando-os contra uma régua e marcação com um marcador permanente. Meça a 1 mm de aposta separaçãotre os dois dentes, segurando a pinça contra o governante e corrigir a largura máxima das dicas a 1 mm, deslizando um anel de borracha fórceps no lugar sobre o eixo do fórceps. </li><li> Criar um pequeno orifício através da inserção de uma agulha de calibre 30 através da dura-máter com os dois pontos de inserção para as garras da pinça para aceder a medula espinhal. </li><li> Inserir os dentes fórceps em um ângulo para a dura-máter através dos furos para a profundidade de um milímetro marcados sobre os lados da pinça 90 °, garantindo que a marca está acima da dura-máter. Comprima fechar a pinça e segure por 10 segundos. Release, e repetir forceps espremer mais duas vezes para um total de três detém. Remover fórceps da medula espinhal. </li><li> Molhe um pedaço de gelatina absorvível comprimido esponja em solução salina e coloque sobre o local da lesão. </li><li> Usando um ponto corrido, suturar o músculo no lugar sobre a laminectomia e embebido esponja de gelatina com # 4 suturas de nylon não absorvíveis sintéticos. </li><li> Clipe da pele no local usando cinco milímetros ferida clips. </li><li> Injecte 10 ul Marcaína (1,0 mg / kg) em 490 uL de soro fisiológico por via subcutânea ao redor do local da incisão e 5 ul Bupernex (0,1 mg / kg) por via intramuscular em músculos glúteos. </li><li> Permitir animal recuperar em uma almofada quente e monitorização de quaisquer dificuldades de movimento ou sinais de paralisia nos membros posteriores. Não deixe animais autônoma ou na presença de outros animais até que esteja totalmente recuperado da anestesia. Não use quaisquer animais que exibem déficits motores observáveis. NOTA: Embora esta lesão de esmagamento pode ser realizado em qualquer nível ao longo da medula espinal, praticamente, T10-L4 representar menos desafios técnicos para imagiologia com respeito a respiração e estabilizar o movimento do corpo utilizando grampos. Colocação da braçadeira deve ser modificado em torno da caixa torácica para a imagem em níveis torácicos. </li></ol> 4. Imagem intravital <ol><li> Preparar e autoclave instrumentos cirúrgicos, incluindo Dumont # 4 pinças, tesouras, pinças de íris para a realização de tecido, agulha drios e clips ferida. </li><li> Anestesiar o mouse como antes com isoflurano. Induzir a anestesia em 4-5% e manter em 1-2%, conforme necessário para manter uma taxa de respiração de 60-100 respirações por minuto e uma falta de resposta a pé pitada. Mantenha o mouse aquecida, monitorar taxa de respiração quando não de imagem e monitorar continuamente a temperatura do animal com uma sonda retal. </li><li> Limpar a pele em torno dos agrafos com Betadine e álcool e, em seguida, remover os grampos de sutura de acordo com as instruções do fabricante. Depois que os clipes para feridas são removidos, remover pêlos com Nair, se necessário, e limpar o local de novo com álcool povidona-iodo e 70%. </li><li> Re-abrir a pele com uma tesoura. Remova todas as suturas remanescentes de músculo e puxar muscular apart com uma pinça, o corte com uma tesoura, se necessário. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, criar bolsas para a medula espinhal braçadeiras cortando o músculo com tesoura ao lado dos processos transversais na vértebra um nível vertebral acima e abaixo da laminectomy. </li><li> Coloque grampos em torno de cada um destes vértebra e aperte. Ajuste conforme necessário para permitir espaço para microscópio objetivo de alcançar a medula espinhal. Certifique-se de que a medula é paralelo à plataforma de imagem, e manter a estabilidade do tecido para a imagem latente. Se artefato respiração é visto, reajuste grampos de acordo para minimizar movimento no campo de imagem. </li><li> Cubra os grampos com parafilm. </li><li> Retire a gelatina comprimido esponja absorvível da medula espinhal com uma pinça, delicadamente escolhendo fora de tantas peças quanto possível, também remover o máximo de tecido cicatricial sobre as meninges possível. Capa expostos medula espinhal com solução salina e esponja nova, se necessário. NOTA: Se o sangramento ocorre a partir do músculo circundante, seja firme com esponja ou cauterizar conforme necessário. No entanto, tome cuidado para não tocar a medula espinhal com o cautério. Cubra a medula espinhal ou com um pedaço de tecido umedecido ou gelatina comprimido esponja quando cauterização. </li><li> Criar um well para manter o fluido de imersão, selando primeiro a pele e tecido com Vetbond, e, em seguida, utilizando acrílico dental para construir um poço entre as duas braçadeiras do suporte da medula espinal e os lados do animal. Espere até que as curas de acrílico. </li><li> Encha o bem com fluido cerebrospinal artificial (ACSF) e verifique novamente para qualquer sangramento em torno do local da cirurgia. </li><li> Opcionalmente, neste ponto, injectar corantes fluorescentes vasos intravenosamente por injecção na veia da cauda para realçar os vasos sanguíneos durante o exame. NOTA: dextrano fluorescente acima de 70 kDa é frequentemente utilizado, apesar de pontos quânticos e lectinas marcados com fluorescência também servem como corantes vasos úteis. 50 ul de 150.000 WM TRITC-dextrano é tipicamente injectado por via intravenosa. </li><li> Para obter a motilidade das células imunes fisiologicamente relevante, a temperatura do rato deverá ser mantida a 37 ° C. Mova o rato para um ambiente com temperatura controlada sob o microscópio para a imagem latente e monitorar o animal para anes corretasnível tesia por taxa de respiração e pé pitada. Monitorar o animal com frequência durante o exame para determinar a profundidade da anestesia, com o objetivo de alcançar uma taxa respiratória de 60-100 respirações por minuto. </li><li> Localize o site de imagem através da ocular do microscópio. </li><li> Ajuste a 2 fótons microscópio de varredura a laser para tirar uma imagem de z-stack cada 30-60 segundos para obter dados de imagens dinâmicas. </li><li> Depois de sessão de imagem é concluída remover o animal da caixa aquecida. </li><li> Solte os grampos da coluna vertebral e remover o rato dos grampos. Puxar o acrílico bem longe da pele ao remover os grampos. </li><li> Se o mouse está a ser trabalhada de novo, colocar soro fisiológico embebido gelatina comprimido esponja sobre a medula espinhal. Fechar o músculo e pele sobre o local da cirurgia. Não deixe o animal sozinho ou na presença de outros animais enquanto se recupera da anestesia. Se o animal apresentar sinais de déficit neurológico após a recuperação, o animal deve ser sacrificado. Caso contrário, a eutanásiao mouse em uma câmara de CO 2 antes que emerge da anestesia acordo com o protocolo de eutanásia IACUC-aprovado. </li><li> Analisar imagens fluorescentes usando software de análise de imagem, seguindo as instruções do fabricante. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Interações de imagem de diferentes tipos de células em seus compartimentos de tecido nativas durante seguiu patologia em tempo real tem gerado grande interesse. Dentro da rede densa do SNC, o contacto célula-célula e sinalização com as células adjacentes são essenciais para a função normal e para compreender a patologia do SNC. Aqui, nós descrevemos o uso de microscopia de varrimento de laser 2-fotão para a observação do movimento celular dentro de uma lesão mecânica na medula espinal. Para além da qualidade da preparação de cirurgia e o tecido, a estabilidade mecânica do tecido é primordial para a microscopia de lapso de tempo bem sucedido, em particular o isolamento da medula espinal de respirar artefactos. A estabilidade pode ser avaliada por olhando para o movimento da medula espinal sob um microscópio de dissecação que corresponde à frequência cardíaca ou respiratória do animal. Estabilidade deve ser avaliada tanto durante a realização da cirurgia e também imediatamente antes do início da criação de imagens. Se o animal não é estável, os ajustes devem ser feitos para a colocação e aperto dos grampos na medula espinhal. Modelos fluorescentes específico repórter do rato do tipo celular, juntamente com abordagens quimera da medula óssea têm permitido a identificação de células monocï¿½icas contra microglia e axônios. Estudos anteriores revelaram que o sangue derivada de monócitos e microglia não são responsáveis ​​pela lesão axonal secundária após o trauma usando a metodologia descrita aqui 43. Dye navio conjugado Dextran permite a identificação da embarcação tanto para fornecer pontos de referência e identificar brechas na integridade dos vasos. A escolha do modelo de rato repórter fluorescente apropriado é crítico para permitir a identificação correcta dos tipos de células desejadas para ser trabalhada. O desenvolvimento de modelos de ratinho fluorescentes que são apropriados para os estudos empreendidos também é crítico para o sucesso das experiências. A distinção entre as duas populações fagocíticas de CX3CR1 + / GFP </sup&gt; Células no sistema nervoso central tem sido tradicionalmente difíceis. Como mostrado aqui, uma técnica imunológica comum, quimeras de irradiação, pode ser utilizado para distinguir rádio-resistentes, microglia residentes do SNC de macrófagos derivados da medula óssea. O procedimento de irradiação tem o potencial para danificar a barreira hemato-encefálica e alterar fenótipos celulares, portanto, o uso deste modelo deve ser considerada com cuidado. A extensão dessas alterações é diferente com dose de irradiação, bem como a duração do período de recuperação, e seu impacto sobre os diferentes modelos inflamatórios não foi completamente estudado. Os efeitos da irradiação sobre o SNC barreira hemato-encefálica pode ser minimizado pela blindagem da cabeça durante a irradiação, e isto foi demonstrado para diminuir a infiltração de células na medula espinal após a irradiação, mesmo se a medula espinal não está directamente blindado 52. Aqui observamos que o número de células que se infiltram no SNC, no estado estacionário como um resultado da geração de quimera é insignificante, em contraste com o dormenteer de células que entram na lesão. Outros modelos alternativos a serem considerados incluem quimeras induzidas por drogas 52 ou modelos parabiótico rato 53. Aqui, apresentamos um modelo de lesão pequena específica, simples e reprodutível, que resulta em uma lesão na substância branca dorsal da medula espinhal que é fácil de imagem usando a microscopia de dois fótons. Este método também proporciona uma lesão quantificável para testar o grau de morte das axonal nas colunas dorsais que, na literatura tem sido acoplados com complementar tecido fixado análise 16,18,43,48,54. Neste modelo, os animais exibir apenas déficits mínimos e não necessitam de cuidados especiais após a lesão. Estudos futuros utilizando as técnicas de lesão coluna esmagamento e de imagem dorsais aqui descritas podem ser poderosas ferramentas de triagem para avaliar a eficácia do tratamento para lesão da medula espinhal. Estes tratamentos podem incluir inibidores de moléculas pequenas, fármacos, produtos celulares, enxertos de tecidos e de tratamento combinatórias. A interacção entre macrófagos, microglia e neurónios são também susceptíveis de desempenhar um papel em outros modelos de doenças na espinal medula, incluindo a esclerose múltipla, tumores, meningite e a esclerose lateral amiotrófica, e esta técnica pode ser útil para o estudo destas doenças, bem .

A reação inflamatória a doença ou lesão no sistema nervoso central (SNC) é mal compreendido, especialmente no que diz respeito às interações entre células do sistema imunológico e residentes no interior do tecido. Investigações destas interacções celulares na medula espinal são de particular interesse no animal vivo. O CNS trato de matéria branca só é facilmente acessível nas colunas dorsais da medula espinhal, tornando esta uma área importante em que se concentrar esforços na melhoria da abordagem experimental viável. Estas investigações foram limitadas devido à dificuldade técnica no acesso e na estabilização do CNS para a imagem latente. Imagens ao vivo na medula espinhal tem sido descrita anteriormente movimento celular 1-13, no entanto, poucos estudos têm abordado em uma lesão da medula espinhal além de algumas horas após a agressão inicial. A lesão traumática da medula espinal é um ambiente complexo, com neurónios, astrócitos, fibroblastos, células progenitoras NG2, e células imunitárias including microglia, neutrófilos, macrófagos, células T, células B e células dendríticas 14,15. Os macrófagos são o subconjunto de células imunitárias responsáveis ​​pela fagocitose na lesão, que se infiltram da circulação. O papel destas células fagocíticas foi debatido, com relatórios que indicam que estas células podem assumir dois papéis prejudiciais e de protecção no tecido lesionado. Essas funções vão desde o aumento perecimento axonal secundária após uma lesão e atuando de forma phagocytic 16-22, para assumir uma ferida fenótipo de cura e diminuir déficits funcionais no animal ferido 21,23,24. Anteriormente, as tentativas de distinguir os macrófagos de microglia têm contado principalmente na morfologia do tecido saudável. No entanto, a microglia e macrófagos activados expressam muitos dos mesmos marcadores e exibem morfologia indistinguíveis após lesão 25-29, tornando a separação das diferentes actividades destas células difíceis de estudar based sobre estes fatores sozinhos 30. Estas células podem ser separadas por expressão diferencial de CD45 usando citometria de fluxo 33,34, embora esta abordagem é menos útil para discriminar estes tipos de células in vivo. Utilizando a expressão diferencial de CCR2 e CX3CR1 em microglia e macrófagos também foi explorada, embora as alterações dinâmicas na expressão destes marcadores como os monócitos diferenciam-se em macrófagos pode complicar a análise exacta 35,36. A microglia são as células do sistema imunológico residentes do SNC e surgem a partir de progenitores de saco vitelino fetal durante o desenvolvimento, enquanto que os macrófagos são derivados a partir de progenitores de medula óssea e entrar no sistema nervoso central lesionado após um insulto 31,32. Uma abordagem alternativa ao uso de morfologia de distinguir esses dois tipos de células é a substituição da medula óssea, com células progenitoras a partir de um animal doador expressando um marcador rastreáveis ​​nos macrófagos derivados dos progenitores doadores, preservando ao mesmo tempo a residentes do SNC, recipderivados de tário microglia. Estes modelos quiméricos de medula óssea são habitualmente utilizados em muitas outras aplicações 37-40. Este método tem ressalvas únicos associados com danos para a integridade da barreira sangue-cérebro provocada por irradiação ou fármacos citotóxicos utilizados para a erradicação progenitores de medula no hospedeiro, limitando a sua utilização em certas aplicações. Recentemente, distinções funcionais entre microglia e macrófagos no sistema nervoso central estão começando a ser discernida por meio de citometria de fluxo, análise de matriz gene chip e métodos quimerismo 24,26,41-44, que poderá ser muito útil no futuro. Apesar de separar esses dois tipos de células continua a ser difícil, entendendo suas funções originais é importante em conduzir a tratamentos mais direcionados de distúrbios que envolvem tanto microglia e macrófagos no SNC. Descrição das interações celulares no interior da lesão da medula espinhal veio principalmente de estudos envolvendo modelos de cultura celular. Este é due para os desafios envolvidos em imagiologia tanto a lesão da medula espinal e células imunes em conjunto em um animal vivo. Modelos de roedores atuais de lesão da medula espinhal de distinta natureza e gravidade incluem modelos de contusão 45,46, lesões picar pinos 2, laceração 47, e dorsal lesão coluna crush descrito aqui 16,18,48. A inflamação nas meninges aumenta com a gravidade da lesão e apresenta desafios únicos para a implantação de janelas ou cirurgias para imagens em série. Alguns desses desafios são a infiltração de células fagocíticas, bem como a geração de tecido fibroso sobre o local cirúrgico. Alguns desses problemas podem ser superados através da criação de lesões menores e cobrindo a medula espinal exposta com penso cirúrgico não imunogénica entre a dura-máter e os músculos paraspinous para permitir a subsequente reabertura cirurgia, tal como é feito aqui para estudar a coluna dorsal lesão por esmagamento . A capacidade de imagem apenas a parte dorsal do spincabo al limita também a escolha de lesão, uma vez que os modelos de contusão, inicialmente, causam danos no fio central, muitas vezes, a parte mais poupando dorsal das colunas dorsais, especialmente nos pontos de tempo iniciais após o ferimento 45,49. Portanto, descreve-se um modelo de lesão simples que produz uma lesão em forma limpa repetível,, retangular que é útil tanto para a observação de movimentação das células no interior da lesão e para facilitar a quantificação da posição axonal em relação à lesão.

<table><tbody><tr><td>CX3CR1 GFP mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H mice</td><td>Jackson laboratories</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>Mouse pie cage</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 set</td><td></td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Petri dish</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>Falcon 40 &amp;mu;m cell filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>21 gauge needle</td><td>BD</td><td>305177</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD</td><td>309628</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>ACK lysis buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>RPMI media</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>For bone marrow isolation</td></tr><tr><td>F4/80 antibody</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>For FACS verification of chimeras</td></tr><tr><td>30 gauge insulin syringe</td><td>BD</td><td>328280</td><td>For tail vein injection</td></tr><tr><td>Spinal Cord Clamps</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic powder</td><td>Lang Dental</td><td>REF1320</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Dental Acrylic liquid</td><td>Lang Dental</td><td>REF1404</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>Gelfoam gelatin sponges</td><td>Pfizer</td><td>9034201</td><td>For imaging</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon sutures</td><td>Ethilon</td><td>1667G</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Reflex Clips, 7 mm</td><td>Kent Scientific</td><td>INS750344</td><td>For surgery. Sterilize before use</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>45/5 Forceps, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>30 gauge needle</td><td>BD</td><td>305106</td><td>For making access holes in dura</td></tr><tr><td>Forceps Dumont #4 Biology tips</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Needle Drivers</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Michel Wound Clip Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS700753</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Wound clip remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>O-rings for Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-00</td><td>For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately</td></tr><tr><td>Cordless Rechargable Animal trimmer</td><td>Wahl</td><td>Series 8900</td><td>for surgery</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Nair Hair remover lotion</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc.</td><td>NRSL-22329-05</td><td>For surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery</td></tr><tr><td>Marcaine</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously</td></tr><tr><td>Bupernex</td><td>Henry Schein</td><td>121-7793</td><td>Drugs &amp;ndash; for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>Chemicals from Sigma</td><td>119 mM NaCl&lt;br /&gt;26.2 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;2.5 mM KCl&lt;br /&gt;1 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;1.3 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br /&gt;10 mM glucose</td><td>For surgery&lt;br /&gt;From Cold Spring Harbor Protocols</td></tr><tr><td>TRITC-dextran 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>For intravenous administration to label vasculature</td></tr></tbody></table>

intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Um diagrama esquemático que representa a coluna dorsal lesão de esmagamento é mostrado na Figura 1A. Após a lesão, o animal é preparado e estabilizado para microscopia intravital usando grampos espinhal (Figura 1B). Uma imagem tomada imediatamente após a lesão de coluna dorsal crush mostra uma lesão rectangular claramente visível com pontos de inserção pinça de dentes que são claramente identificáveis. Os axónios no local da lesão são cortadas em toda a extensão de toda a coluna dorsal (Figura 1C). A integridade dos vasos sanguíneos permanece intacta, e nenhuma evidência de infiltração de corante vaso foi detectado por fluorescência. Para realizar imagem de série da mesma lesão ao longo de semanas, os músculos e pele pode ser suturado sobre o laminectomy para posterior re-exposição. Lesão morfologia semelhante é vista em momentos posteriores (Figuras 1D, E). 5 dias após a lesão, os locais de inserção fórceps ainda são visíveis, mas a lesão começou a aumentar de tamanho due a lesão secundária causada por inflamação. Os axónios na extremidade caudal da lesão ter recolhido a partir do local inicial da lesão através de um processo chamado de &quot;colapso axonal&quot;. Os axónios na extremidade rostral da lesão exibiu degeneração Wallerina semelhante (Figura 1D, E). Entre os dias 5 e 22 após a lesão, o tamanho da lesão foi estabilizado. Ao mesmo tempo, um grande influxo de células CX3CR1 + pode ser visto infiltrante e em torno da lesão de esmagamento durante estes intervalos de tempo, embora a identidade destas células microgliais (contra macrófagos) não podem distinguir-se na preparação, como mostrado na Figura 1. A fim de distinguir o comportamento da microglia e macrófagos, no microambiente lesão por esmagamento, um modelo de quimera de radiação foi utilizado (descrito na Figura 2A). Em primeiro lugar, as células progenitoras da medula óssea de um CX3CR1 + / GFP rato são substituídos com cel dador não fluorescentels, portanto, só GFP + microglia CNS residente são visíveis por imagens fluorescentes. A eficiência de reconstituição de medula pode ser confirmada por análise de citometria de fluxo de sangue periférico a 8 semanas após o transplante de medula (Figura 2B, C). Na Figura 2B, F4 / 80 e GFP macrófagos positivos, destacada em azul, são detectados em um CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 do mouse quimérico, em que alguns monócitos positivos negativos, mas F4 / 80 GFP também estão presentes. Na Figura 2C, não F4 positivo duplo / 80 e as células GFP positivas são deixados após a substituição de CX3CR1 + / GFP medula óssea destinatário com tipo selvagem de medula óssea. Antes da lesão, a microglia estão uniformemente distribuídos no interior da medula espinal, exibindo um descanso, morfologia ramificado (Figura 2D). 8 dias após a lesão, apenas alguns microglia pode ser detectado e em torno da lesão. Estes microglia exibir uma morfologia amebóide (Figura 2E). Em segundo lugar, ossoAs células progenitoras da medula em um rato não-fluorescente são substituídas por células da medula de um CX3CR1 + / GFP rato, tornando assim derivadas da medula óssea CX3CR1 + monócitos / macrófagos visíveis por fluorescência de GFP (Figura 2A). Antes da lesão, a única GFP + células detectadas são largamente perivascular, que têm sido referidos como sendo derivadas da medula óssea e sempre revirando numa base regular de 28 (Figura 2F). Depois de uma lesão por esmagamento, CX3CR1 células + / GFP pode ser visto ao longo do interior dos vasos sanguíneos ao redor da lesão (Figura 2H-J), e do centro da lesão é preenchido com infiltração de macrófagos CX3CR1 + / GFP (Figura 2G). Lapso de tempo de imagem das colunas dorsais pode ser realizada durante até 6 h. Na Figura 3, que mostra um CX3CR1 não quimérico + / GFP rato imediatamente após a lesão, em que as células a partir da circulação pode ser vern se deslocam para fora do vaso sanguíneo para o núcleo e se desloca no interior da lesão no local da lesão (Figura 3A, B; Suplementar Filme 1). A análise das imagens utilizando intensidade de fluorescência para identificar as células podem rastrear o caminho percorrido pelos macrófagos (Figura 3A, B; Suplementar Filme 1). Estatísticas derivadas da análise de imagem mostram a motilidade média de macrófagos na lesão é de 3,6 mm / min (Figura 3D). Finalmente, aos 22 dias após a lesão, os axônios, microglia e macrófagos pode ainda ser detectada no interior da lesão demonstrando a área de imagem é estável durante longos períodos de tempo (Filme Suplementar 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: Criação e imagem sequencial da lesão de coluna dorsal esmagamento. (A) O dorsallesões coluna esmagamento é realizado através da remoção do processo dorsal da vértebra ao nível de interesse. Fórceps são inseridos na coluna dorsal da própria medula 1 mm entre si e são, em seguida, fechado 3 vezes para produzir a lesão mostrados no roxo. (B) O animal é então posicionada com medula espinhal grampos para obter a estabilidade de imagens intravital. (C) Imediatamente após a lesão, os sites fórceps de inserção (oval vermelho) eo rectangular volume de lesão por esmagamento (caixa cinza) podem ser claramente identificados. Axónios nas raízes dorsais podem ser vistos (setas brancas), assim como as extremidades dos axónios lesionados no lado caudal da lesão (cabeças de seta a cheio). (D) 5 dias após a lesão, os fórceps locais de inserção (oval vermelho ), e da extensão da lesão (caixa cinza) ainda pode ser facilmente visualizado. A lesão aumentou em tamanho desde o insulto inicial. Os axônios submetidos a degeneração Walleriana-como pode ser visto rostral à lesão (cabeças de seta aberta) em additipara axônios nas raízes dorsais (setas brancas) e as extremidades dos axônios lesionados (setas brancas). (E) 22 dias após a lesão, local da lesão ainda é identificável com dimensões semelhantes à lesão após 5 dias. Observa-se grande número de células CX3CR1 + e em torno do local lesionado. Características marcadas são os mesmos que em (D). Todas as barras de escala = 200 um. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Construção de ratos quiméricos para rastrear CX3CR1 + / GFP expressando macrófagos derivadas da medula óssea ou microglia CNS residentes na lesão de coluna dorsal esmagamento. (A) Um diagrama esquemático de geração de ratos quiméricos com qualquer CX3CR1 + / GFP expressando kmcroglia ou macrófagos. Primeiro, os ratinhos Thy-1 H YFP são irradiadas e a medula óssea é reconstituído com células da medula isolado a partir de uma CX3CR1 + / GFP ratinho, resultando em um rato quimérico cujo macrófagos são GFP +. Em segundo lugar, Thy-1 YFP ratinhos H / CX3CR1 + / GFP são irradiadas e a medula óssea é reconstituído com células da medula isolado a partir de um rato não-fluorescente, produzindo um ratinho quimérico cujo microglia são GFP +. (B) Exemplo de citometria de fluxo de dados com células F4 / 80 + e CX3CR1 para GFP + no sangue de um animal quimérico com um doador de medula óssea + / GFP CX3CR1 transplantadas para um irradiadas C57BL / 6 destinatário. Células derivadas de doadores positivos CX3CR1 que são positivas tanto para GFP e F4 / 80 são mostrados no azul a zona iluminada. (C) Exemplo de citometria de fluxo de dados com 80 células / + F4 e CX3CR1 GFP + em um animal quimérico com uma C57BL6 doador de medula transplantada para um irirradiada CX3CR1 + / GFP destinatário. Note-se a inexistência de dupla positivo CX3CR1 + / GFP e F4 / 80 células dentro da área azul em destaque. (D) Um de dois fótons snapshot microscópica intravital de um rato a partir do primeiro esquema quimérico, mostrando GFP + microglia com morfologia ramificadas dentro do dorsal coluna (cabeça de seta). Estas células são intercaladas entre axónios (amarelo) em raiz dorsal e a coluna dorsal. Barra de escala = 100 mm. (E) imaging Intravital do mesmo mouse em (B) 8 dias após a lesão de coluna dorsal revela alguns CX3CR1 + microglia com corpos celulares grandes e amebóides forma que faltam processos (cabeça de seta). Barra de escala = 100 mm. (F) Snapshot de um rato a partir do segundo esquema quimérico em (A), mostrando pouca GFP + macrófagos, dentro do parênquima CNS. Barra de escala = 100 pm. (L), imagiologia intravital do mesmo rato em (F) 8 dias após a lesão da coluna dorsal revela alarge influxo de macrófagos e em torno da lesão. Barra de escala = 100 mm. (H) A imagem de maior ampliação de CX3CR1 células derivadas + sangue em contato com os vasos em que o animal ileso. Escala da barra = 30 m. (I) A reconstrução de células CX3CR1 em contacto com o recipiente, visto de dentro do vaso. Escala da barra = 30 m. (J) Uma reconstrução de células CX3CR1 em contacto com o vaso, visto do exterior do recipiente. Barra de escala = 20 mm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 3 :. Dados de rastreamento de células representativos numa CX3CR1 não quimérico + / GFP do mouse imediatamente após a coluna dorsal crushlesão. (A) Um instantâneo de CX3CR1 + microglia e macrófagos ao redor dos axônios danificados (amarelo) de Filme Complementar 1, imediatamente após uma lesão na coluna dorsal crush. (B) Os caminhos (cinza), tomada pelas células CX3CR1 + no (A) durante uma 110 min sessão de imagens intravital. (C) A representação codificada tempo das faixas em (B). As faixas são coloridos com base no seu tempo dentro de todo o filme 110 minutos, como mostrado na barra de tempo. (D) Histograma da motilidade global das células CX3CR1 +. Todas as barras de escala são 30 mm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Filme Complementar 1: filme intravital Representante imediatamente após a lesão de coluna dorsal crush no duplo heterozigoto Thy-1 YFP / + <strong&gt; / CX3CR1 GFP / + mouse. imaging espinhal Intravital foi realizada imediatamente após a coluna dorsal lesão por esmagamento, a nível T11. Painel da direita mostra o movimento de CX3CR1 + microglia e macrófagos. Os caminhos do movimento de células são mostrados como faixas brancas no painel da esquerda. A lesão está localizado no canto superior esquerdo. Células CX3CR1 + pode ser visto em movimento no local da lesão ao longo destas faixas. Axônios são mostrados a amarelo. Escala da barra = 40 m. Tempo total: 110 min. A velocidade de reprodução: 300x. Filme Suplementar. 2: filme intravital Representante aos 22 dias após a lesão de coluna dorsal crush no duplo heterozigoto Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + rato aparece aqui é um filme representativo tomada em um mouse de 22 dias após a primeira queda coluna dorsal lesão ao nível da coluna vertebral T11. A injUry está localizado no canto superior direito do quadro. Os axônios (amarelo) ascendente rostralmente são mostrados na parte inferior direita. Os vasos sanguíneos da veia dorsal e são marcados com TRITC-dextrano (vermelho). Células CX3CR1 + dentro do movimento lesão em uma velocidade mais lenta em comparação com aqueles imediatamente após a lesão. Barra de escala = 50 mm. Tempo total: 90 min. A velocidade de reprodução: 600x.

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Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K visualizações.  Case Western Reserve University. Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury. 

Vídeo: Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imagens ao vivo de axônios da raiz dorsal após rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Neurociência

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Medicina

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Um Vivo em Método de dupla-cor de imagem dinâmica Vascular após lesão da medula espinhal Contusive

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Imunologia e Infecção

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Imagem Intravital de axonais Interações com Microglia e macrófagos em um mouse Dorsal Coluna lesão por esmagamento

Resumo

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