Gostaríamos de agradecer Ying Yu para APC Min / + camundongos genotipagem. Este estudo foi apoiado por fundos do INSERM e subvenções (CA057621 e AI053194) do National Institutes of Health.

NOTA: Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC), UCSF. Todos os experimentos com imagens eram procedimentos não-sobrevivência e os animais foram sacrificados imediatamente após o final da aquisição da imagem. 1. geração de camundongos NOTA: Apc Min / +, ratinhos portadores de uma mutação no gene APC, desenvolvem espontaneamente 50-100 adenomas do intestino delgado. <ol><li> Cruz Apc Min / + ratinhos com a linha de ACTB-ECFP, ECFP que expressa sob o promotor de actina, e ainda com a linha de c-fms-EGFP, que expressa EGFP sob o promotor de c-fms para detectar as células mielóides. Animais heterozigóticos para ACTB-ECFP e c-fms-EGFP são utilizados para detectar a fluorescência. </li><li> Use camundongos em 3-4 meses de idade a imagem adenomas claramente detectáveis. </li></ol> 2: Preparação de Materiais antes da cirurgia NOTA: Os detalhes do microscópio set-up ter sido anteriormente descrito 6,7. <ol><li> Microscópio <ol><li> Ative o cobertor térmico. Ligue o laser de argônio para 488 nm de excitação e de estado sólido de 405 nm, 561 nm e 640 nm lasers. Ligue o microscópio, a unidade de controlo de disco giratório, a AOTF, a unidade de controlo do laser, e do controlador da câmara. </li><li> Abra o obturador microscópio, que transforma o LED vermelho. Ligue o computador e câmera de software. </li></ol></li><li> Plataforma de Imagem <ol><li> Certifique-se de que a inserção palco é limpo. Caso contrário, limpe com água e sabão e depois seque. </li><li> Tome duas lamelas e usar fita laboratório para fixá-los na inserção. Coloque a inserção no palco e limpe-o com algodão embebido em álcool. </li><li> Usando fita laboratório, anexar a manta de aquecimento para o lado direito do palco. </li><li> Verificar a integridade da membrana de borracha sobre o cone de nariz e que se mudam necessary. Posição e fixar o cone do nariz para entrega anestesia isoflurano ao animal usando gaze e fita de laboratório. </li></ol></li><li> O isoflurano anestesia Sistema <ol><li> Encher o tanque de isoflurano. </li><li> Ligar o vácuo e ajustar para 1,2 L / min. </li><li> Adicione água destilada até o nebulizador e ligar o nebulizador para o sistema de isoflurano. </li><li> Ligue o analisador de oxigênio e conectá-lo ao sistema de isoflurano. Ligue o tanque de oxigênio e garantir que o analisador de oxigênio mostra 100%. Ajustar o fluxo de O 2 a 0,2 L / min. </li><li> Ligue o tanque de nitrogênio e ajustar o fluxo de 0,8 L / min. Verifique se o analisador de oxigênio mostra 21%. </li></ol></li><li> Preparação de Ferramentas de Cirurgia e Plataforma <ol><li> Limpe duas pinças e tesouras de dissecação com água e sabão. </li><li> Ligue o esterilizador talão quente e deixá-lo chegar a 250 ° C. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos para 30 seg. Deixe-os esfriar. </li><li> Coloque uma imersão laboratório no banco cirurgia. </li><li> Use uma tampa de isopor como uma plataforma cirúrgica. Cubra com um pedaço de laboratório de imersão. Prepare um segundo pedaço de laboratório giratória para mudar após o barbear o mouse. </li><li> Coloque o cone do nariz com a linha de anestesia na tampa de isopor coberto, e anexá-lo para a tampa de isopor (não no laboratório de imersão) com alguma fita e usar duas agulhas em ambos os lados do cone do nariz para mantê-lo no lugar. </li><li> Montar betadine, toalhetes com álcool, gaze estéril, super cola, lâminas de microscópio, barbeador elétrico, e quatro pedaços de fita de laboratório. </li></ol></li></ol> 3 Preparação de Injeções <ol><li> Sob o capô, preparar uma seringa de insulina (28 G x ½ cm), com 7 ul de estoque AF647 conjugado Ly-6G (Gr1) anticorpo (1 mg / ml) em 100 ul de 2000 kDa rodamina-dextrano (4 mg / ml ) para injecção retro-orbital. Injeção retro-orbital é recomendado na APC min / + camundongos desde anemia que se desenvolve nesses animais faz com que o difficu veias da caudalt para detectar através da pele. </li><li> Prepara-se uma segunda seringa de insulina com 1 mg / kg de atropina diluído em 150 ul de PBS por via subcutânea (sc) de injecção antes de imagem para amortecer movimentos peristálticos do intestino. </li></ol> 4 Preparação do Intestino for Imaging <ol><li> Verifique se a linha de anestesia para a câmara de indução está aberto, e as linhas para a mesa cirúrgica e microscópio estão fechados. </li><li> Transferir o animal à câmara de anestesia. Fechar a câmara de anestesia e ligar o isoflurano a 4% (com O 2 21%). </li><li> Quando o mouse respira profundamente e lentamente (após 5-6 min), transferi-lo para o estágio cirúrgico no seu flanco e injetar a solução de anticorpos Gr1 e / ou solução de dextrano retro-orbital. </li><li> Abrir o tubo de anestesia ligada à plataforma cirúrgica. Feche a linha para a câmara de anestesia e coloque o mouse sobre a sua volta com seu nariz no cone anestesia. </li><li> Reduzir o isofluranoconcentração de 4% a 2,5%. </li><li> Verifique se o mouse é bem anestesiados por beliscar a sua pata e teste do reflexo corneal. </li><li> Adicionar oftálmica pomada lubrificante nos olhos para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Prenda os membros do mouse para o estágio cirúrgico, acrescentando fita laboratório. </li><li> Remover os pêlos da superfície ventral usando um barbeador elétrico. Também remova o cabelo da pata traseira esquerda para posicionar o oxímetro antes da aquisição. Retire a imersão laboratório a partir da fase cirúrgica e substituir por uma limpa para evitar a contaminação de cabelo. </li><li> Desinfetar a superfície ventral com algodão embebido em álcool e betadine. </li><li> Injectar a solução de atropina (de 3,2) sc em um flanco do mouse. </li><li> Adicione de 1 cm ventral incisão na linha média através da pele e do peritoneu com uma tesoura e por um par de pinças. Retire cuidadosamente 3-4 cm de intestino e identificar um ou vários tumores de imagem. </li><li> Tome um copo de MICRoscope corrediça e a posição de uma linha de assinante do intestino em que com um tumor no topo. </li><li> Adicione um pouco de super cola para alguns locais ao longo do intestino para anexá-lo ao slide. Esperar um minuto para a cola secar. Usar um marcador para desenhar uma linha sobre a lâmina apontando para o tumor de modo a facilitar a sua localização com o confocal. </li></ol> 5. posicionar o mouse no Palco e Preparação para Aquisição de Imagem <ol><li> Retire a fita de laboratório de membros. </li><li> Abrir o tubo de anestesia para a fase de microscópio e fechar a uma plataforma para o cirúrgico. </li><li> Transferir o mouse com cuidado para o estágio do microscópio com o lado ventral para baixo e seu nariz no nariz do avião. Prenda a linha de anestesia com alguma fita laboratório. </li><li> Re-posicione o mouse e / ou o slide, a fim de ter o intestino no centro de uma das janelas caiu de cobertura. Gentilmente fita para baixo o slide com fita laboratório. </li><li> Fixe a sonda oxímetro no membro esquerdo do mouse parasiga seu coração e níveis de taxas e de saturação de oxigênio arterial respiratórias. </li><li> Cubra o mouse com a manta de aquecimento para evitar a hipotermia. </li><li> Diminuir a concentração de isoflurano de 2,5% para 1-1,5% para exames. </li></ol> 6 Aquisição de imagens usando o μManager Software <ol><li> Aumente a velocidade CSUX a 2.500 rpm para melhorar a qualidade da imagem nas definições de configuração. </li><li> Use o menu suspenso para escolher Objetivo 10X 0,5 NA ou 20X 0,75 NA Fluar da lente objetiva. </li><li> Escolha o laser de 405 nm menu dropdown Color. </li><li> Clique na Live e ajustar o foco com o microscópio. </li><li> Clique em Auto para ajustar automaticamente intensidades máximas e mínimas de pixel da imagem de exibição com base nos valores de pixels extremos da imagem. Um histograma de intensidade dos pixels da imagem da tela é apresentada no gráfico na parte inferior da janela principal. </li><li> Ajuste a exposição da câmera na janela do Painel de Controle Piper poralterando o número de relógios (um relógio é 33,333 ms). </li><li> Se o sinal estiver muito brilhante com a menor exposição, diminuir a intensidade do laser, usando a unidade de controle do microscópio. </li><li> Verifique a intensidade do sinal para 488 nm, 561 nm e 640 nm linhas de laser. Ajustar a intensidade do laser com a sua própria unidade de controlo do laser de (488 nm e 561 nm) ou a unidade de controlo do microscópio. </li><li> Na janela de multi D Aquisição, marque a caixa pontos Tempo e digitar o número de pontos de tempo e intervalo de tempo desejado. </li><li> Verifique a caixa de Z-pilhas, escolha &quot;Z relativa&quot; e definir Z-start e Z-final em relação à posição atual. NOTA: Para 10X ou 20X objetivo, comece com 3 planos Z, 8 m ou 4 mm para além respectivamente. </li><li> Marque a caixa Várias posições (XY) para geração de imagens de vários locais, em seguida, clique em Editar lista de posição, marcar 4-6 posições diferentes. </li><li> Verifique a caixa de Canais e adicionar canais de Novo e selecione lasers linhas do menu suspenso e tipe em exposição para cada canal (em múltiplos de 33,333 ms). </li><li> Verifique Salvar imagens na janela &quot;aquisição multi D&quot;. </li><li> Selecione uma pasta e todas as imagens adquiridas serão automaticamente salvos nesta pasta com o prefixo do nome dado. NOTA: Cada aquisição contínua será salvo em uma subpasta separada, como arquivos TIFF individuais para cada fatia Z em cada cor em cada ponto de tempo. </li><li> Salve todas as configurações clicando em Salvar configurações na janela de multi D Aquisição. </li><li> Clique em Obter na janela de aquisição do Multi-dimensional para começar a aquisição. </li><li> Se a sonda oxímetro não é usado ou pára de funcionar bem (quando pulso não é estável ou difíceis de detectar), verificar a eficiência da anestesia a cada 15 minutos durante o procedimento de imagem por beliscar a pata e verificar o reflexo corneal. Ajuste as anestesia se o mouse é sensível a estes estímulos. </li><li> Após a aquisição, a eutanásia o mouse, aumentando a concent isofluranoração de 5%. Quando há movimentos respiratórios são detectáveis, retire o mouse do palco e realizar um deslocamento cervical. </li></ol> 7 Análise de imagens usando o Imaris Software <ol><li> Conversão para .IMS Arquivos (Recurso Figura 1A) <ol><li> Abra o software da câmera, clique em Arquivo, em seguida, o conversor de grupo. </li><li> Clique em Adicionar arquivos e escolha o primeiro arquivo da primeira posição. Repita o procedimento para cada posição. </li><li> Para cada arquivo carregado, clique em Configurações e verifique se as configurações de &quot;t&quot; para o tempo, &quot;c&quot; para os canais e &quot;z&quot; para Z-stacks aparecem nessa ordem. </li><li> Salve na pasta desejada. Navegar e criar um novo arquivo convertido. </li><li> Clique em Set para todos e Start. </li></ol></li><li> Ajustes (Recurso Figura 1B) <ol><li> Vá para a pasta convertido específico e abrir o primeiro arquivo. </li><li> Na janela de Ajuste Display, ajustar o fundosinal de corte, modificando o número mínimo para cada canal, se necessário. </li><li> Se necessário, ajustar a intensidade do sinal através da modificação do número máx (quanto menor o número máximo, maior é a intensidade do sinal). NOTA: Os ajustes do sinal de intensidade / contraste permitir o destaque de um comportamento de célula ou um compartimento para ter uma visualização mais agradável. Isso não muda o resultado em si. </li><li> Clique em Editar e Imagem em Propriedades. </li><li> Mudar as x, y, e z (valores para uma objectiva 10X, x e y = 0,712, z = 8 um, por uma objectiva 20X: x e y = 0,36, z = 4 mm). </li><li> Clique em Todos os Eqüidistante para ajustar pontos de tempo. Adicione a data de início ea hora de início da aquisição. Adicione a data final e hora final da aquisição (Figura 1C Suplementar). </li><li> Clique no botão Play para assistir ao filme. </li><li> Clique em Editar e excluir pontos de tempo para apagar as imagens borradas. </li><li> Para juntar duas aquisições separadas together em um filme, ir para o último instante do primeiro filme e clique em Editar&gt; Adicionar pontos de tempo para adicionar o segundo arquivo. </li></ol></li><li> Salvando como um filme (Figura 1D Suplementar) <ol><li> Clique na Record, escolha a extensão mov e um factor de compressão de 0. </li><li> Clique em Salvar. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Neste trabalho, um protocolo detalhado é descrito por disco giratório de imagem confocal da dinâmica de células mielóides em tumores intestinais por várias horas em um animal vivo, fotografada do lado da serosa do intestino. Para evitar a inflamação e a ter condições fisiológicas óptimas, a imagiologia do intestino tem que ser feito no órgão intacto. No entanto, a imagem do lado da serosa do intestino é difícil, uma vez que a luz tem de passar através de diferentes camadas d...

Evidência esmagadora demonstra agora que o microambiente do tumor, consistindo em populações celulares heterogéneas, incluindo fibroblastos, células endoteliais, células imunitárias e inflamatórias, matriz extracelular e factores solúveis, desempenha um papel crucial na iniciação e progressão de tumores sólidos, contribuindo para quase todos características de câncer 1. Com efeito, durante a progressão do tumor, há interações dinâmicas constantes entre as células cancerosas transformadas e células do estroma que evoluem para gerar um microambiente favorável à malignidade 2. Entre as células do sistema imunológico que se infiltram no microambiente do tumor, as células mielóides são os mais abundantes 3. Consistindo de macrófagos associados a tumores (TAM), células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs), células dendríticas (DC) e de neutrófilos (PMNs), as células mielóides são recrutadas a partir da medula óssea e infiltrar progressivamente tumores, libertando citocinas, factores de crescimento e proteases que pode promovercrescimento do tumor e se espalhar 4. A interferência entre células cancerosas e células mielóides é complexo, mas dinâmico. Assim, a compreensão da natureza de suas interações é crucial para determinar por que essas células promovem a progressão do câncer, em vez de participar de uma resposta imune anti-tumor, e pode ajudar a encontrar novos alvos para controlá-lo. A observação direta por microscopia intravital fornece informações sobre a dinâmica de células dentro dos tecidos de camundongos ao vivo 5. A quatro cores, multi-região, disco giratório com lentes micro-sistema confocal foi projetado para estudar células estromais dentro de tumores mamários 6. Esta abordagem permite a imagiologia contínua a longo prazo e inclui várias vantagens, tais como: (a) de aquisição de imagens rápidas para minimizar artefactos de movimento, (b), a anestesia de longo prazo, (c) quatro aquisição de cor a seguir diferentes tipos de células, (d) marcação fluorescente de diferentes componentes tumorais, e (e) a observação de diferentes microambientes tumorais sagacidadehin o mesmo mouse para evitar mouse para variabilidade rato 7-9. Com esta tecnologia, os diferentes comportamentos de células têm sido relatados no vírus do tumor mamário de modelo (MMTV) polioma meio conduzido pelo promotor T oncogene (Pymt) que mostra as fases progressivas da tumorigénese. Os linfócitos T reguladoras (Treg, visualizadas pelo transgene Foxp3 EGFP) migram preferencialmente na proximidade dos vasos sanguíneos que o DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblastos associada a carcinoma (FSP1 + / + -EGFP) e células mielóides (c-fms -EGFP) exibem maior mobilidade na periferia do tumor do que no interior da massa do tumor. Na condição de hipóxia sistémica aguda, as células migraram de forma diferente: Tregs parar a migração em contraste com as células mielóides que continuam a mover-se 6. Além disso, no mesmo modelo de rato, demonstrou-se que as alterações de sensibilidade com doxorrubicina fase do tumor, a distribuição da droga está relacionada com a resposta a fármacos, e doxorrubicinatratamento conduz ao recrutamento dependente de CCR2 de células mielóides ao tumores. Assim, imagens ao vivo também pode ser usado para obter insights sobre as respostas de drogas no local e na biologia do chemoresistance 10,11. Polipose adenomatosa coli (APC) mutações genéticas ocorrem geralmente em adenomas colorretais humanos e carcinomas 12 e mutação de uma única cópia dos resultados gene APC em polipose adenomatosa familiar (FAP), o que confere um risco extremamente elevado para câncer de cólon 13. A estirpe de ratinhos Apc Min / + carrega uma mutação no códon 850 truncamento do gene APC e desenvolve espontaneamente várias adenomas intestinais em todo o intestino delgado de 14 16. Imagens intravital longo prazo do intestino é difícil por causa da capacidade de invasão do procedimento, uma vez que a abertura da cavidade peritoneal, é necessária para o acesso ao intestino. Imagens ao vivo de curto prazo ruaudies ter sido previamente publicada no intestino saudável 17,18, mas a observação direta de longo prazo de tumores intestinais não foi relatado. Um procedimento cirúrgico foi concebido e aperfeiçoado para visualizar tumores através da superfície serosa do intestino, usando o sistema de microscopia intravital fiação disco previamente utilizado para tumores mamários 6,10 imagem. Neste artigo, é descrito um protocolo que permite que se siga o comportamento de células mielóides no interior dos tumores do intestino delgado, utilizando Apc Min / + mice.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Apc&lt;sup&gt;Min/+&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline Buffer</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td><td>UCSF Monoclonal antibody core</td><td></td><td>Stock 1 mg/ml. Use at 7 &amp;mu;g/mouse</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Use at 1 mg/kg mouse</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 in. insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blanket</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Turn ON 30 min before use</td></tr><tr><td>Cotton tipped apllicators 6-inch</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia system</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Stage insert</td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox oximeter, software and sensors</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Open-source software</td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

Células mielóides são as células do sistema imunológico mais abundantes e dentro de tumores têm sido mostrados para promover a progressão do tumor. Técnicas de imagem intravital modernos permitem a observação do comportamento celular ao vivo dentro do órgão, mas pode ser um desafio em alguns tipos de câncer devido ao órgão e tumor acessibilidade, tais como intestino. A observação direta de tumores intestinais não foi previamente relatado. Um procedimento cirúrgico descrito aqui permite a observação direta da dinâmica de células mielóides dentro dos tumores intestinais em ratos vivos, utilizando camundongos transgênicos repórter fluorescente e traçadores injectáveis ​​ou anticorpos. Para este propósito, um de quatro cores, multi-região, com lentes de micro-disco giratório microscópio confocal que permite imagens contínuo a longo prazo com a aquisição de imagem foi usada rápida. Apc Min / + ratinhos que desenvolvem adenomas múltiplos do intestino delgado são cruzados com ratos c-fms-EGFP para visualizar as células mielóides e com camundongos ACTB-ECFPpara visualizar as células epiteliais do intestino das criptas. Procedimentos para a marcação de diferentes componentes, tais como tumores, vasos sanguíneos e neutrófilos, e o processo para o posicionamento do tumor para a imagiologia por meio a superfície serosa também são descritos. Filmes time-lapse compilados a partir de várias horas de imagens permitem que a análise do comportamento de células mielóides in situ no microambiente intestinal.

Usando fiação de microscopia confocal de disco, tecidos não tumorais e tumorais no intestino delgado de Apc Min / +; ACTB-ECFP; ratinhos c-fms-ECFP pode ser visualizada a partir da superfície serosa. Depois de imagem, software da câmera é usada para analisar e ajustar a aquisição (Figura Complementar 1). Após a administração intravenosa (iv) injecção de 2.000 kDa fluorescente rodamina-dextrano e um anticorpo conjugado Ly-6G 647, vasos sanguíneos e PMN ...

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Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K visualizações.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

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Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Imunologia e Infecção

Imagem pancreática murina usando janela estabilizada implantada

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

Autor em destaque: Revolucionando a compreensão da doença pancreática por meio de imagens intravitais avançadas 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Pesquisa do câncer

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioengenharia

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medicina

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics

Resumo

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Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Janela estabilizada para imagem intravital do pâncreas murino

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine