Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência CARREIRA Prêmio Nacional (0953583) e do Instituto Nacional de Saúde NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.

Neste protocolo, um oligonucleotídeo (RBMB1) foi marcado em sua extremidade 5 &#39;com um corante repórter CF640R e tem a sequência: 5&#39;-mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mamama mCmAmC mAmAmC mUmCmC mU mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC Mumu-3&#39;. Domínios auto-complementares, que levam à formação da estrutura em grampo, estão em negrito. O segundo oligonucleótido (RBMB2) foi marcado na extremidade 3 &#39;com um agente de extinção de Iowa Preto RQ-Sp e tem a sequência: 5&#39;-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3&#39;. 1 Preparação de RBMBs <ol><li> Executar uma rotação rápida dos tubos contendo as RBMB1 e RBMB2 oligonucleótidos, para assegurar o oligonucleótido seca está na parte inferior do tubo, e ressuspender em água DNase e RNase para uma concentração final de 100 uM. Por exemplo, uma amostra de 10 nmol de oligonucleótido deverá ser ressuspenso em 100 ul de água. </li><li> Measure a concentração exacta de amostras e RBMB1 banco RBMB2 por espectroscopia de UV-vis. <ol><li> Misturar 3 ul da amostra RBMB com 117 ul (DPBS sem cálcio e magnésio) em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Em branco o espectrofotômetro com DPBS e medir a absorvância 200-800 nm. Nota: Pico se as absorvâncias a 260 nm e 650 nm deve ser visível. </li><li> Calcula-se a concentração de estoque de amostras RBMB base na absorvância a 260 nm (ou 650 nm para RBMB1), usando a equação: Da concentração (M) = 260 * Um coeficiente de factor de diluição / extinção em que A é a absorvância de 260 a 260 nm, e o factor de diluição é de 40. Nota: O coeficiente de extinção para a RBMB pode ser encontrado na folha especificação fornecida pelo fabricante do oligonucleótido. O coeficiente de extinção a 650 nm CF640R é 103.000. </li></ol></li><li> Misturar 20 ul de 100 uM RBMB1, 30 ul de 100 uM RBMB2, 6 ul 10x; Tampão fosfato (10x tampão fosfato: 480 mM de K 2 HPO 4, 45 mM de KH 2 PO 4, 140 mM de NaH 2 PO 4, pH 7,2) e 4 mL de água e de DNase isenta de RNase. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min. Nota: Este é normalmente suficiente para cerca de 50 estudos. </li><li> Prepara-se uma coluna de cromatografia líquida utilizando 75 grau prep Superdex para remover quaisquer oligonucleótidos RBMB2 não hibridizadas. Usar um 8 mL (0,7 x 20 cm) de coluna de cromatografia líquida com um volume de leito ~ 4 ml para purificar o pequeno volume de sondas mistas. </li><li> Lavar e equilibrar o Superdex com ~ 50 ml de tampão de fosfato de 1x usando uma bomba de seringa, rodando a um fluxo a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min. Antes de todo o fluido entra no volume de leito, parar a bomba de seringa, separá-lo e deixar o líquido restante através da coluna vai por gravidade. </li><li> Carregar a mistura RBMB (60 uL) na coluna de cromatografia. <ol><li> Depois a amostra foi completamente RBMBentrou na cama, adicionar lentamente mais 250 ul de 1x tampão de fosfato para o topo do leito para assegurar que toda a amostra entrou completamente a coluna. </li><li> Encher a coluna até a borda com tampão de fosfato de 1x. Feche o topo, e ligar a bomba de seringa - a seringa deve ser preenchido com ~ 50 ml de PBS 1x e correr a uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min. </li><li> Uma vez que o RBMB se aproxima da parte inferior da coluna - a amostra RBMB pode tipicamente ser prontamente visualizado devido à cor do corante incorporado na sonda - recolher o fluxo de passagem em duas gotas por tubo de microcentrifugação (1,5 ml). Pare de coletar a amostra uma vez que a cor dentro dos microtubos se torna claro. </li></ol></li><li> Combine os tubos contendo a amostra RBMB cor - geralmente 5-6 tubos - e carregar em um dispositivo de filtro centrífugo (10.000 MW de corte). Centrifuga-se a amostra a 10000 RCF durante 20 minutos ou até que o volume desejado. Nota: Estas velocidades e tempos normalmenteoriginar um volume final de ~ 30 mL. </li><li> Medir a concentração exacta da amostra RBMB purificado por espectroscopia de UV-Vis. <ol><li> Tomar 3 mL da amostra concentrada RBMB e misturar com 117 DPBS ul em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Em branco o espectrofotômetro com DPBS e medir a absorvância 200-800 nm. Nota: Pico se as absorvâncias a 260 nm e 650 nm deve ser visível. </li><li> Calcular a concentração do estoque RBMB hibridado com base na absorvância a 650 nm, utilizando a equação: Da concentração (M) = 650 * Um factor de diluição / coeficiente extinta 650 onde A é a absorvância a 650 nm, o factor de diluição é de 40. Nota: O coeficiente de extinção a 650 nm para CF640R é 103.000 e o coeficiente de extinção para Iowa Preto RQ é ~ 20.000. Os coeficientes de extinção são aditivas e não são sensíveis à hibridização. Portanto, a amostra de estoque RBMB tem um coeficiente de extinção combinada de approximately 123 mil a 650 nm. </li></ol></li><li> Rotular o tubo de forma adequada com o nome e concentração e armazenar a -20 ° C para uso futuro. </li></ol> 2: Preparação de poli-d-lisina de 8 poços revestidos ALOJADO lamela <ol><li> Prepara-se uma solução de 0,2 mg / ml de poli-D-lisina por dissolução de 5 mg de poli-D-lisina (pó liofilizado, g-irradiado) em 25 ml de água esterilizada em ambiente estéril. </li><li> Adicionar 200 ul da / ml de solução de poli-D-lisina a 0,2 mg a cada poço de uma lamela 8 poços compartimentado, em um ambiente estéril. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 16-18 horas na capa de cultura de células. </li><li> Aspirar a Poli-D-lisina e lavar bem a 3 vezes com água destilada estéril. Nota: As lâminas com câmara revestidas podem ser armazenadas a 4 ° C. </li></ol> 3. Probe Entrega Nota: O sistema celular utilizado deve conter uma construção de um gene que expressa ARN integrado com, pelo menos, 4-sequencial ligaming sítios para a RBMB na região 3 &#39;não-traduzida (UTR). O alvo deve ser complementar à linha do RBMB. Aconselha-se que, como um controlo negativo, a mesma linha de células ser manipulada para expressar a mesma construção do gene, mas sem as repetições em tandem. Neste protocolo, uma linha de células de fibrossarcoma humano, HT1080, foi manipulada para expressar a GFP de ARN com 96 repetições em tandem da sequência alvo RBMB na 3&#39;-UTR. A linha de células de controlo foi concebido para expressar a GFP de ARN de tipo selvagem. <ol><li> Células da placa em um frasco de T25 a 40-50% de confluência um dia antes da entrega da sonda. Cultura das células com meio DMEM suplementado com 1% de pen / strep e 10% de soro fetal bovino (FBS), e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, ligue o microporos e configurar os parâmetros de formação de microporos para 950 V, 2 pulsos, 25 ms. Nota: Estes parâmetros foram otimizados para as células HT1080, mas eles são do tipo celular dependente e pode ser adjusted para outros tipos de células, tal como descrito nas instruções do fabricante. </li><li> Encha o tubo de microporos com 4 ml de tampão eletrolítico e colocá-lo na estação de formação de microporos. </li><li> Retire a amostra estoque de RBMB purificado e descongelar. Diluir vários microlitros para uma concentração final de 12 uM com tampão de fosfato de 1x. 1 ml é necessária para cada formação de microporos. </li><li> Pipete 1 mL de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos para um tubo de microcentrífuga. Nota: Este será usado para suspender as células imediatamente depois de microporos e pode ser posta de lado, perto do dispositivo de formação de microporos, por enquanto. A inclusão de antibióticos no meio de cultura diminui a viabilidade celular após a formação de microporos. </li><li> Remover o meio de cultura celular das células HT1080 modificadas (60-80% confluentes), lavar as células com 1 ml de Ca 2 + e Mg 2 + DPBS -free uma vez, e incuba-se com 1 ml de tripsina durante 1-2 min. </li><li> Pare o trypsinization adicionando 1 ml de meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino sem antibióticos, e vermelho de fenol, e transferência das células para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Girar as células no tubo de microcentrífuga a 200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender combinar as pelotas de células, num volume final de 1 ml de DPBS. </li><li> Tomar 10 ul a partir da suspensão de células, bem misturada, e contar as células. </li><li> Pipeta as células para cima e para baixo várias vezes para se certificar de que eles estão bem dispersas e transferir 300 mil células com DPBS em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e girar a 200 xg por 5 min. </li><li> Retirar o sobrenadante, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento celular. Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão e 11 ul pipeta cima e para baixo várias vezes, para assegurar que as células são bem dispersa. Cuidado para não gerar eventuais bolhas de ar. Nota: As bolhas de ar fará com que uma faísca durante a formação de microporos e resultar em má entrega RBMB e morte celular. </li><li> Adicionar 1 mL do RBMB diluído (12 mM) e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. Novamente tome cuidado para não gerar as bolhas de ar. </li><li> Aspirar 10 ul da mistura de células RBMB, utilizando a pipeta de formação de microporos, e inserir a pipeta dentro do tubo de formação de microporos. Pressione o botão Iniciar para iniciar a formação de microporos. Nota: Não deve haver bolhas de ar visíveis na ponta. </li><li> Quando o ecrã do microporos mostra conclusão, remover a pipeta da estação, expelir a mistura de 10 uL para dentro do tubo de microcentrífuga que foi preparado anteriormente, com 1 ml de meio de cultura com FBS, mas sem antibióticos. Misture delicadamente balançando os tubos de lado-a-lado várias vezes. </li><li> Rodar as células a 200 xg durante 5 min e lava-se as células mais duas vezes, em 1 ml de meio de cultura sem fenol vermelho com FBS, mas sem antibióticos, para remover quaisquer RBMBs que não foram transferidos para as células. Ressuspender com 400 mL de meio de cultura de fenol vermelho livre com FBS, mas semantibióticos. </li><li> Placa as células microporated para a poli-D-lisina revestido lamela 8 poços compartimentado em 200 ul por poço ou na confluência desejado. </li><li> Opcional: Se for desejável a imagem do núcleo, adicionar Hoescht 33342 para as células a uma concentração final de 0,01 mg / ml. </li><li> Coloque as câmaras lamela numa incubadora de cultura de células. Incubar as células durante 1-2 horas antes da imagem, de modo que as células tenham tempo suficiente para assentar sobre a superfície da lamela. Nota: Imagem pode ser realizada assim que 30 min pós-formação de microporos. </li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Ligar o sistema de fase celular de incubação superior ao vivo e equilibrar até que atinja 37 ° C, 5% de CO 2, e 75% de humidade. </li><li> Ligue a fonte de luz do microscópio e fluorescente e abrir o software Metamorph. Nota: Outros pacotes de software similares para controle de microscópio e de aquisição de imagem também pode ser usado. </li><li> Aplique óleo Immersol aoobjectivo. </li><li> Transfira a lamela câmaras com células microporated ao estágio de células do sistema superior de incubação ao vivo. Incubar a fase superior do sistema até que a temperatura e os níveis de CO2 estão estabilizados. </li><li> Abra a guia Adquirir, em software Metamorph. Clique no botão Show Live para encontrar o campo, ajustar o foco de luz branca e clique no botão Parar ao vivo. </li><li> Sob a guia Adquirir, clique e abrir o botão pop-up aquisição fluxo, e configurar os parâmetros de aquisição filme desejado. Adquirir 150 quadros usando o filtro Cy5 / CF640R e salvar as imagens para o disco rígido. </li></ol>

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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanine+fluorophore+derivatives+with+enhanced+photostability.">Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability.</a> Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).</li><li>Kumaraswamy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-conjugated+polymer+superquenching+facilitates+highly+sensitive+detection+of+proteases.">Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).</li><li>Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+synthesis+of+an+oligonucleotide-poly(phenylene+ethynylene)+conjugate+with+a+precise+one-to-one+molecular+ratio.">Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).</li><li>Lu, J., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+microRNAs+in+single+mammalian+cells+in+situ.">Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).</li><li>Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).</li></ol>

Dr. Mark Behlke e Dr. Ling Huang são empregados pelo IDT, que oferece oligonucleotídeos para venda semelhante a alguns dos compostos descritos no manuscrito. IDT é, no entanto, não é uma empresa de capital aberto e que, pessoalmente, não possui quaisquer acções / equidade na IDT.

A capacidade de imagens simples transcritos de ARN modificadas em células vivas utilizando um microscópio de campo amplo convencional requer um sinal fluorescente brilhante e fotoestáveis ​​para ser associado com cada transcrição de ARN e um fundo de fluorescência que emana de baixo sondas fluorescentes não ligados. Neste método, um sinal fluorescente brilhante é conseguida por hibridação múltipla (até 96) à base de sondas fluorescentes de oligonucleótidos, ou seja RBMBs, para cada transcriç...

A expressão e regulação dos transcritos de RNA é um processo complexo e dinâmico, que é em grande parte responsável por controlar o comportamento das células e destino. Embora a importância da RNA em função das células ditando tem sido conhecida há algum tempo, muitas vezes é difícil estabelecer ligações claras entre os dois desde que a maioria das ferramentas de análise de RNA não têm a resolução espacial e temporal exigido para capturar eventos regulatórios importantes, tais como a transcrição de ruptura, RNA tráfico e processamento de RNA localizada. Isto levou ao aparecimento de diversas técnicas que permitem que os transcritos de ARN individuais a serem visualizados em células vivas em tempo real 1. Talvez o mais importante destas técnicas utiliza uma proteína de fusão GFP-MS2 de RNA alvo, que tenha sido modificado para conter repetições em série de local de ligação MS2 na 3&#39;-UTR de 2,3. Ao trazer várias moléculas de GFP em estreita proximidade, transcrições de RNA individuais aparecem manchas fluorescentes como brilhantesatravés de microscopia de fluorescência. O sistema de GFP-MS2 forneceu uma visão sem precedentes sobre o comportamento do RNA, incluindo a visualização direta e medidas de transcrição estourando 4,5, detecção de localização sub-celular exclusivo e processamento de 6-9, e imagens em tempo real do transporte de RNA 10. No entanto, apesar do enorme potencial de o sistema de GFP-MS2, proteínas de fusão GFP-MS2 não ligados podem criar um sinal de fluorescência de fundo elevado, que limita a versatilidade e gama dinâmica desta técnica. Várias abordagens foram desenvolvidas para limitar o sinal de fundo, incluindo compartimentalização subcelular de desacoplado GFP-MS2 10, fragmento de proteína complementação 11, e proteínas de ligação de RNA alternativas e tem como alvo 12. No entanto, todas estas abordagens permanecem sensíveis para a expressão relativa e total do alvo de ARN e proteína de fusão GFP-MS2. Como umlternative para os sistemas de GFP-MS2, faróis moleculares também têm sido utilizados para detectar transcritos de ARN modificadas com repetições em tandem de o sítio de ligação complementar na 3&#39;-UTR 13,14. Os faróis moleculares são sondas oligonucleotídicas de formação de gancho que estão marcadas, numa extremidade com um extintor e na outra extremidade com um repórter fluorescente. Quando não está ligado ao RNA alvo do repórter fluorescente e extintor permanecem em estreita proximidade, resultando num estado de baixa fluorescência. Após a hibridação, o repórter fluorescente e extintor ser separadas e a fluorescência é restaurado. Semelhante ao sistema de GFP-MS2, a ligação de vários faróis moleculares para um único transcrito de ARN resulta em uma mancha fluorescente brilhante, que pode ser identificado por meio de microscopia de fluorescência; no entanto, a fluorescência de fundo deverá ser de muito menor, devido à configuração da extinta faróis moleculares não ligados. Infelizmente, apesar de o mecanismo de activação inteligente que é incorporada no mprojeto farol olecular, agora há evidências crescentes de que não hibridizada beacons moleculares não permanecem na conformação hairpin quando introduzido em células vivas. Por conseguinte, eles geram um sinal falso-positivo que reduz significativamente a relação sinal-fundo. Para superar essa deficiência, que recentemente desenvolveu uma nova sonda sintética para RNA de imagem em células vivas, balizas bimoleculares proporcional (RBMBs; Figura 1A) 15,16. RBMBs são compostas de duas cadeias oligonucleotídicas 2&#39;-O-metilo que forma uma estrutura híbrida com as características de ambos os ARN curto hairpin (shRNA) e faróis moleculares. O mecanismo de activação circular e de fluorescência é semelhante ao de farol molecular, enquanto que o domínio de cadeia dupla longo com uma saliência 3&#39;-UU é mais característico dos shRNA. Os recursos shRNA são projetados para conduzir exportação nuclear, o que temos encontrado aumenta vida intracelular de&gt; 24 horas, com a degradação observável mínimo, eimpede a abertura não específico do ciclo. Como um resultado RBMBs apresentam um fundo de sinal-para-significativamente mais elevada do que faróis moleculares. Deve notar-se que RBMBs não pode ser preparado utilizando os oligonucleótidos de ADN, uma vez que sondas baseadas em ADN não possuem as mesmas capacidades de exportação nuclear como sondas baseados no RNA. Estruturalmente, o loop RBMB é tipicamente concebida para estar entre 15 e 21 bases de comprimento, para criar um equilíbrio entre a especificidade e selectividade mediante hibridação de ARN. O curta-tronco que se forma a partir dos dois domínios auto-complementares normalmente é projetado para ser de 4 bases. Se uma haste mais longa for selecionado, a taxa de hibridação entre o loop RBMB e RNA alvo fica lento significativamente 17,18. Por outro lado, quando uma sequência de caule mais curto é seleccionada a temperatura de fusão é frequentemente demasiado baixa para manter a estrutura em ansa pedunculada, a 37 ° C, conduzindo a um sinal de fundo elevado. A especificidade do RBMB também é vermelhouced como o comprimento da haste é encurtado. Como a seqüência do RBMB tronco de loop também pode influenciar o desempenho RBMB, deve ser cuidadosamente selecionados 19. Em particular, as sequências de loop ideal deve ter o mínimo de estrutura secundária, hibridizam com seqüências de RNA com estrutura secundária mínima, evitar locais de ligação de proteínas e evite off-meta vinculativa. Previsões de ambos RBMB e estrutura secundária do RNA pode ser obtida usando softwares como o mfold 20. Complementares locais fora do alvo podem ser identificados através de um trabalho de busca local ferramenta básica de nucleotídeos (BLAST). No entanto, por causa de inconsistências nas previsões do modelo e da dificuldade em identificar sites de licitação de proteínas, a especificidade de todos os RBMBs deve finalmente ser validadas experimentalmente. Se desejável, um corante de referência unquenched que é insensível ao estado de hibridação pode ser adicionado à RBMB 15. A adição de um corante de referência pode prOvide um marcador para entrega sonda e ser usado para geração de imagens ratiometric, se forem necessárias medições mais precisas de fluorescência celular total. Os corantes de referência permite a medição de ser ajustados para as diferenças no fundo, devido às variações de célula-a-célula no parto. No entanto, na obtenção de imagens de ARN transcritos indivíduo o corante de referência não é necessário. Notavelmente, alguns corantes de referência pode interferir com a exportação de RBMBs a partir do núcleo, conduzindo a um sinal de fundo ligeiramente mais elevada no núcleo. Quando concebida adequadamente, RBMBs pode ser utilizado para imagem transcritos de ARN individuais em células vivas individuais, se o RNA alvo é modificado para conter, pelo menos, quatro locais de ligação RBMB (Figura 1B) 16. RBMBs pode ser eficientemente entregues em uma ampla gama de tipos de células, através de formação de microporos, com pouco ou nenhum efeito sobre a viabilidade das células 21, e as medições quantitativas da expressão do gene pode seradquirido dentro de 30 min. Além disso, a metodologia é relativamente insensível a níveis de concentração RBMB e RNA alvo, uma vez que a fluorescência a partir de RBMBs não ligadas é extinta eficientemente. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada da metodologia utilizada para preparar e purificar RBMBs, bem como um procedimento geral para a entrega de RBMBs em células vivas através de microporos ea imagem de transcrições de RNA em tempo real.

<table><tbody><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>AM9932</td><td>no DEPC-treated</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>No Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Cary 100 UV-Vis spectrophotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>S381-500</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>Chromatography column</td><td>Kimble Chase Life Science</td><td>420400-0720</td><td>0.7 x 20 cm</td></tr><tr><td>Superdex 75 prep grade</td><td>GE healthcare</td><td>17-1044-01</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-300</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>301035</td><td>60 ml, Luer-lok tip</td></tr><tr><td>Centrifugal filter units</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>MW 10,000 cutoff</td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td>lyophilized powder, g-irradiated</td></tr><tr><td>8-well chambered coverglass</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>Working volume 0.2-0.5 ml</td></tr><tr><td>HT1080</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td>Human Fibrosarcoma cell line</td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965084</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>DMEM without phenol red</td><td>Life Technologies</td><td>21063029</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penecillin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>0.05% Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>Neon transfection system</td><td>Life Technologies</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon transfection system kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software controlling microscope</td></tr><tr><td>Immersol oil 518F</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66B</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of single engineered rna transcripts in living cells using ratiometric bimolecular beacons

A crescente compreensão de que tanto a regulação temporal e espacial da expressão de genes pode ter consequências importantes para a função da célula levou ao desenvolvimento de diversas técnicas para visualizar os transcritos de ARN individuais em células vivas individuais. Uma técnica promissor que tem sido recentemente descrito utiliza uma sonda baseada no oligonucleótido óptico, raciométrica baliza bimolecular (RBMB), para detectar transcritos de ARN que foram modificados para conter, pelo menos, quatro repetições em tandem da sequência alvo RBMB na região 3 &#39;não traduzida. RBMBs são especificamente concebidos para emitir um sinal fluorescente brilhante após hibridação com o ARN complementar, mas caso contrário, permanecer extinta. O uso de uma sonda sintética nesta abordagem permite fotoestável, vermelho-deslocado, e corantes orgânicos altamente emissiva para ser usado para imagiologia. A ligação de vários RBMBs para os transcritos de ARN modificadas resulta em manchas discretas de fluorescência quando visto sob um microscópio de fluorescência de campo amplo. Por conseguinte, o movimento de transcritos de ARN individuais podem ser facilmente visualizados em tempo real pelo tempo de tomar uma série de imagens fluorescentes. Aqui descreve-se a preparação e purificação de RBMBs, entrega em células de formação de microporos e vive-célula imagiologia de transcritos de ARN.

Pouco tempo após a formação de microporos de células HT1080 na presença de RBMBs, os transcritos de ARN individuais que foram modificados para conter vários locais de ligação RBMB no seu 3&#39;-UTR aparecem como manchas fluorescentes brilhantes quando visualizados por microscopia de fluorescência de todo o campo (Figura 2). Enquanto transcrições de RNA individuais com sítios de ligação de apenas quatro RBMB podem ser visualizados em células vivas, mais sites na 3&#39;-UTR obrigatório RBM...

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Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real.

Imagens em tempo real de uma única Engineered RNA transcritos em células vivas usando raciométrica Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

real-time-imaging-single-engineered-rna-transcripts-living-cells

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K visualizações.  University of Pennsylvania.  Beacons bimoleculares proporcional (RBMBs) pode ser usado para imagens simples transcrições de RNA projetados em células vivas. Aqui, nós descrevemos a preparação e purificação de RBMBs, entrega de RBMBs em células de formação de microporos e de imagem fluorescente de transcritos de ARN em tempo real. 

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An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Bioquímica

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Análise celular única de alelos ativos transcricionralmente por peixe de molécula única

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Marcação final de duas cores e encapsulamento de vesículas de RNAs para estudos smFRET-TIRF

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their conformational changes over time. To monitor RNA dynamics with smFRET, we developed a method to covalently label RNAs at their termini with a FRET pair of fluorophores. This direct end-labeling strategy targets the 5&#39;-phosphate by carbodiimide (EDC)/N-hydroxysuccinimide (NHS) activation and the 3&#39;-ribose by periodate oxidation, which can be adapted to other RNAs regardless of their size and sequence to study them independently of artificial modifications. Furthermore, the 5&#39;-EDC/NHS activation is of general interest to all nucleic acids with a 5&#39;-phosphate. The use of commercially available chemicals eliminates the need to synthesize RNA-specific probes.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy requires the surface-immobilized molecules of interest to be within the evanescent field to be illuminated. A sophisticated way of keeping the RNA molecules within the evanescent field is to encapsulate them in phospholipid vesicles. Encapsulation benefits from the best of both worlds, tethering the molecule to the surface while enabling free diffusion of the molecule. We ensure that each vesicle contains only a single RNA molecule, enabling single-molecule imaging. Upon dual-end labeling and encapsulation of the RNA of interest, smFRET measurements offer a dynamic and detailed view of RNA behavior.

<meta charset="utf8"></head><body>Marcação final fluorescente e encapsulamento de RNAs longos para microscopia FRET-TIRF de molécula única

This article describes the dual-color labeling of long RNAs at termini positions and their surface immobilization via encapsulation in phospholipid vesicles for single-molecule FRET TIRF microscopy applications. Combining these techniques enables precise visualization and analysis of RNA dynamics at the single-molecule level.

Marcação final fluorescente e encapsulamento de RNAs longos para microscopia FRET-TIRF de molécula única

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

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