Agradecemos Manon Laprise para treinamento em ecocardiografia e Ann Chamberland para tirar as fotos mostradas nas Figuras 1 e 2. Este trabalho foi financiado pela Canadian Institutes of Health Research concessão 44363 MOP e Canadá Presidente 950-216684.

Todos os procedimentos mostrados neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê Animal Care a IRCM. 1. O ultra-som do sistema e estação de preparação <ol><li> Inicie o sistema de imagiologia de ultra-sons e ligar a cabeça da sonda, assim como a unidade controladora da fisiologia de acordo com as instruções do fabricante (Figura 1). Escolha cardíaca Programa de medição e a cabeça da sonda que corresponde ao transdutor 30 MHz. </li><li> Encha o revólver da cabeça da sonda com água deionizada. Evite bolhas de ar como eles interferem com resolução de imagem. Coloque a cabeça da sonda, com o lado da pega para cima no respectivo suporte, perto da plataforma de imagem (Figura 1A). </li><li> Desinfetar a plataforma de imagem e área de trabalho. </li><li> Preencha completamente o frasco de gel de ultra-som para evitar a formação de bolhas e colocá-lo de cabeça para baixo em seu conjunto recipiente pré-aquecimento de 37 ° C (Figura 1B). </li><li> Verifique os níveis de oxigen e isoflurano e do sistema de tubulação para a anestesia. Um experimento com ~ 8 embriões usaria cerca de 15-20 L de oxigênio. </li><li> Colocar os frascos de bálsamo oftálmica, creme depilatório e gel de eléctrodo próximo da plataforma de imagem (Figura 1B). </li><li> Verifique se as funções da lâmpada de calor infravermelho. Durante o treino, definir o nível de temperatura, a posição da luz e da distância da lâmpada para ratinhos, a fim de manter a temperatura corporal constante e frequência cardíaca. Nota: A preparação adequada do sistema e o material é crítica. A morosidade dos processos pode afetar as características fisiológicas e hemodinâmicas de fetos como anestesia longo deprime a função cardíaca, diminuindo a freqüência cardíaca, pressão arterial e nível de sangue-oxigenação. O tempo de processamento para ~ 8 fetos (tamanho médio das ninhadas em C57BL / 6) deve ser de aproximadamente 1 hora. Outras estirpes de ratos pode fornecer um maior número de fetos, possivelmente, com um tamanho maior do sexo feminino. A formação é essencial para otimizar o processitempo ng. </li></ol> 2. Rato Preparação <ol><li> Anestesiar a fêmea grávida numa câmara com o fornecimento contínuo de 2% de isoflurano em oxigénio (200 ml / min) até que se torne não responsivas. </li><li> Posicione o mouse sobre a plataforma de imagem em decúbito dorsal, ajuste o tubo por inalação contínua de 1,5% de isoflurano em oxigênio (200 ml / min), e fixar o tubo de inalação com fita adesiva (Figura 2A). Anestesia suficientes deve ser confirmado durante o procedimento pela postura relaxada do mouse e na ausência de qualquer resposta a cauda e pés beliscões. </li><li> Gel Lugar eletrodo apenas no canto superior esquerdo e inferior direito almofadas de eletrodo (direita antes perna e perna esquerda, também chamada de posição II chumbo) para eletrocardiografia. Chumbo posição II proporciona melhor onda P definido na vertical positivo e complexo QRS para determinar a freqüência cardíaca. Fixar as quatro patas para cada bloco utilizando uma fita (Figura 2A). Para prevenir o ressecamento dos olhos, aplique uma gota debálsamo oftálmica em cada olho. </li><li> Raspar o abdômen do tórax para bexiga com uma máquina de cortar cabelo. Em seguida, aplique o creme depilatório para 2 min e limpe-a com gaze e / ou cotonete para remover cuidadosamente qualquer cabelo restante. Tenha cuidado para não cortar os mamilos. </li><li> Inserir o termómetro pré-lubrificadas com gel de eléctrodo no reto da fêmea para monitorar a temperatura corporal (deve ser mantida a 37 ± 0,5 ° C por ajuste de uma lâmpada de aquecimento de infravermelhos colocados acima da plataforma). A freqüência cardíaca deve ser de 450 ± 50 batimentos / minuto (bpm). Tanto a temperatura e freqüência cardíaca são exibidos na unidade controladora fisiologia (Figura 1B). Nota: Longa anesthetization, perda de cabelo e gel de ultra-som (embora pré-aquecido) pode levar a hipotermia, o que pode afetar a frequência cardíaca do feminino. Se a temperatura do corpo cai abaixo de 36,5 ° C, parar o processo e modificar a posição da lâmpada de aquecimento para regular a temperatura e a frequência cardíaca. Espere alguns minutos befminério de proceder novamente. </li></ol> 3. Embrião de Identificação <ol><li> Pressione levemente para baixo no abdômen nu para localizar os embriões. Lenta e levemente espalhá-los para fora para ter a maioria dos embriões em uma única camada sob a superfície abdominal. Em cada corno uterino, os sacos são linearmente ligados uns aos outros. Tente respeitar essa ordem quando se espalhando. </li><li> Mark cada embrião no abdômen nu da fêmea com um marcador permanente com o seu anterior / posterior e dorsal / ventral direções. Conhecer a orientação facilitará a localização do coração com a sonda. Número de embriões em lados direito e esquerdo a partir de colo do útero (1, 2, 3 ... e 1 &#39;, 2&#39;, 3 &#39;..., respectivamente; Figura 2B). Nota: (i) evitar a propagação da embriões com força excessiva. Desenhe suas localizações em um pedaço de papel de controlá-los (Figura 2C). (Ii) C57BL / 6 fêmeas têm ~ 8 fetos por ninhada. No entanto, 0-2 embriões em cada ninhada são localizado abaixo dos outros, tornando a sua imagem impossível. Excluir esses embriões a partir da análise e avaliação mais ninhadas, se necessário. </li></ol> 4. Medição de freqüência cardíaca <ol><li> Coloque uma pequena quantidade de gel de ultra-som pré-aquecido no abdômen nu e espalhe uniformemente. Evite a formação de bolhas. Adicionar uma quantidade maior de gel (~ 5 ml) sobre a área específica para a imagem. </li><li> Segure a sonda em contato com a camada de gel de espessura (10 mm) e gradualmente mover a sonda em direção à pele ao olhar para o coração batendo. Uma vez que o coração é visualizado no ecrã, ajustar o ângulo da sonda para ter ambos os ventrículos na sua maior dimensão no plano de imagem (Figura 2D). </li><li> Comece a aquisição de imagem. Com o antebraço repousando sobre a estação, coloque o transdutor de ultra-som sobre o gel para obter uma imagem ao vivo na tela de visualização (Figura 2D). Manter o cume do transdutor na parte superior e clique no ORIENTAÇÃO scanheadn marcador (no canto superior esquerdo da imagem) permitem a coordenação do movimento das mãos e área visualizada na tela. </li><li> A partir do colo do útero, passar para o embrião mais próximo marcada (1 ou 1 &#39;no corno uterino direita ou à esquerda, respectivamente) para visualizar o coração batendo na tela. Porque profundidade focal é fixo, mova suavemente a sonda para cima / baixo e para os lados, sem perder contato com gel para obter o plano de imagem desejada. </li><li> Posicionar o coração no centro da tela, no interior da região indicada pela linha a tracejado amarelo representando a zona de contacto para a melhor aquisição de dados. </li><li> Adquirir a gravação ao vivo. Obtenha a imagem de olheiro e retomar a gravação (Figura 3A). Uma vez que um mínimo de 10 segundos de gravação estável é obtido, parar a gravação e salvar. </li><li> Vá para a próxima embrião. </li><li> Uma vez que todos os embriões são analisados, pressione &quot;Browse&quot; no teclado para ver a lista das gravações. Jogue cada gravado em modo M Tracing e executar várias medições (pelo menos 5 por rastreamento) do espaçamento entre picos adjacentes (ciclo de tempo / fluxo) para obter a freqüência cardíaca média (Figura 3B). Nota: Alguns protocolos de sugerir o uso de um suporte fixo para a cabeça da sonda para evitar tremer. No entanto, ela limita o ângulo de análise, fazendo a observação dos embriões laterais difícil. Ele também retarda a análise, como o suporte tem que ser ajustada para cada embrião. Segurando a cabeça da sonda, enquanto a resolução do antebraço na estação eficiente minimiza tremendo. Treinamento com 5-10 fêmeas grávidas é recomendado para otimizar o resultado. </li></ol> 5. Genotipagem <ol><li> Usando uma tesoura cirúrgica limpas e fórceps, inciso longitudinalmente a pele ea camada muscular do abdômen. Localize os sacos em cada trompa do útero e combinar os números. Cortar abrir o saco vitelino para expor o embrião no fim usado acima. Se não estiver em um arranjo linear, o esboço das posições de embriões em um pedaçode papel será essencial uma vez que as marcas na pele não são mais visíveis. </li><li> Cortar apenas a 4 mm de cauda de genotipagem como ADN genómico é extraído de forma muito eficiente a partir de caudas embrionárias. Nota: (i) O procedimento cirúrgico pode ter que ser realizada numa localização separada da sala de imagiologia. No entanto, é importante não mova o mouse e ter o procedimento cirúrgico na plataforma de imagem, a fim de manter o controle dos embriões numeradas. Consulte o gerente da unidade de animais para otimizar o procedimento cirúrgico. (Ii) A fêmea grávida morre rapidamente, devido à perda de sangue, como os fetos são removidos para genotipagem após imagem. Depois de cauda cortada, os fetos são colocados 3 min no gelo para a anestesia por hipotermia e depois decapitado com uma tesoura, conforme recomendado pelo Comitê Animal Care. </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, J. I., Kaplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+incidence+of+congenital+heart+disease.">The incidence of congenital heart disease.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 39, 1890-1900 (2002).</li><li>Miller, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+brain+development+in+newborns+with+congenital+heart+disease.">Abnormal brain development in newborns with congenital heart disease.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1928-1938 (2007).</li><li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease.">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li><li>Wessels, A., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+anatomy+of+the+heart:+a+tale+of+mice+and.">Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and.</a> 15, 165-176 (2003).</li><li>Yu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ENU+induced+mutations+causing+congenital+cardiovascular+anomalies.">ENU induced mutations causing congenital cardiovascular anomalies.</a> Development. 131, 6211-6223 (2004).</li><li>Seidah, N. G., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+therapeutic+targeting+of+the+proprotein+convertases.">The biology and therapeutic targeting of the proprotein convertases.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 367-383 (2012).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin.">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li><li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+redundancy+of+the+proprotein+convertase+furin+in+mouse+liver.">Limited redundancy of the proprotein convertase furin in mouse liver.</a> J. Biol. Chem. 279, 53442-53450 (2004).</li><li>Kisanuki, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tie2-Cre+transgenic+mice:+a+new+model+for+endothelial+cell-lineage+analysis+in+vivo.">Tie2-Cre transgenic mice: a new model for endothelial cell-lineage analysis in vivo.</a> Dev. Biol. 230, 230-242 (2001).</li><li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+endothelial+furin+leads+to+cardiac+malformation+and+early+postnatal+death.">Loss of endothelial furin leads to cardiac malformation and early postnatal death.</a> Mol. Cell Biol. 32, 3382-3391 (2012).</li></ol>

Não há conflito de interesse declarados.

-Ecocardiograma modo M é um método simples e eficaz para medir a freqüência cardíaca útero de embriões de camundongos. Transdutores disponíveis comercialmente fornecer resolução suficiente para visualizar pequenos corações batendo. Assim, eles permitem que a medição da frequência cardíaca de alta precisão, em comparação com outros métodos, como a medição de pulso, e pode substituir a microscopia de vídeo de alta resolução. Contudo, as ferramentas atuais não permitem a análise...

CHD é a causa não infecciosa mais comum de morte no nascimento 1. Várias cirurgias são muitas vezes necessárias para corrigir as deficiências estruturais em indivíduos cuja qualidade de vida pode ficar comprometida 1. Crianças com CHD freqüentemente desenvolvem distúrbios neurológicos, mesmo que não tenham sido submetidos a cirurgia, indicando importante em conseqüências útero em desenvolvimento 2,3. Ambos os fatores genéticos e ambientais, como a exposição a vírus ou produtos químicos (álcool) durante a gravidez, causa CHD. Estudar os contribuintes genéticos ainda está em sua fase inicial, mas crescendo rapidamente. Para identificar esses contribuintes e compreender o seu papel no desenvolvimento do coração, fenotipagem ratos mutantes com uma ferramenta simples e poderosa será altamente benéfico. Mouse é na verdade um modelo animal de escolha para estudar CHD, ea maioria dos casos humanos podem ser reproduzidas em camundongos 4,5. Consequentemente, rato fetal fenotipagem cardíaca tornou-se increasingly importante investigar a etiologia da doença coronária humana e requer ferramentas adequadas. Embora os estudos histológicos em espécimes fixados são de valor inestimável, imagens em tempo real de animais vivos é crucial para compreender a fisiologia do coração. Microscopia de vídeo oferece imagens ao vivo. No entanto, requer laparotomia para expor os embriões, comprometendo assim o seu estado fisiológico e hemodinâmico. Recentemente, tornou-se a ecocardiografia técnica de imagem padrão para as avaliações cardíacas na clínica, bem como em ratinhos. Rato ecocardiografia fetal é realizado com sistemas de ultra-som clínicos padrão, bem como sistemas de ultra-som ultra-alta freqüência. O último fornecer 30 MHz ou transdutores de frequências mais altas que geram imagens bidimensionais e permitem a avaliação das fases embrionárias precoces. Estes transdutores tem uma profundidade de penetração relativamente pobre (~ 13 mm), o que é, no entanto, suficiente para obter planos de imagiologia adequadas e determinar aa medula fundamentaltros, como a frequência cardíaca, o diâmetro interno do ventrículo esquerdo e direito na diástole e sístole e septo e espessura da parede, sem a realização de laparotomia. Em nosso estudo, nós usamos um sistema de ultra-som ultra-alta freqüência para avaliar a freqüência cardíaca de embriões de camundongos em E18.5 dia embrionário. Escolhemos um transdutor de 30 MHz, que proporciona um campo de visão de 20 mm x 20 mm, o que é ideal, dado o tamanho dos fetos, com uma distância focal de 12,7 mm. No entanto, um transdutor de frequência mais elevada pode ser escolhida para analisar as fases precoces do desenvolvimento. O M-modo selecionado permite a visualização de tecidos em movimento, graças a uma alta resolução temporal de 1000 frames / seg. O procedimento completo é simples e deve ser realizado tão rapidamente quanto possível para evitar qualquer perturbação dos estados fisiológicos e hemodinâmicos do feto. A análise de embriões de cerca de 8 exige cerca de 1 hora.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:160px;">Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td style="width:104px;">CP0406v2</td>
			<td style="width:163px;">1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ultrasound gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Aquasonic Clear</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Electrode gel</td>
			<td>Parker Laboratories Inc.</td>
			<td>Spectra 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ophthalmic gel</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>Tear-Gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Depilatory cream</td>
			<td>Church &#38; Dwight Co., Inc.</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Hair clipper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Gauze/cotton swap</td>
			<td>Q-tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Permanent marker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System</td>
			<td style="width:160px;">Visual Sonics</td>
			<td style="width:104px;">Vevo770</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">30 MHz Transducer</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td>RMV707B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">Imaging platform and physiology controller unit</td>
			<td>Visual Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Anesthetic System</td>
			<td>Cyprane North America Inc.</td>
			<td>312462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Infrared heating lamp</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero measurement of heart rate in mouse by noninvasive m-mode echocardiography

A doença cardíaca congênita (DCC) é a causa não infecciosa mais freqüente de morte ao nascer. A incidência de doença coronariana varia de 4 a 50/1, 000 nascimentos (doença e estimativas regionais lesão, Organização Mundial da Saúde, 2004). Cirurgias que muitas vezes comprometem a qualidade de vida são necessárias para corrigir defeitos do coração, lembrando-nos da importância de encontrar as causas da doença coronariana. Modelos de ratos mutantes e tecnologia de imagem ao vivo tornaram-se ferramentas essenciais para o estudo da etiologia da doença. Embora os métodos avançados permitem imagens ao vivo de corações anormais em embriões, os estados fisiológicos e hemodinâmicos destes últimos são muitas vezes comprometida devido a procedimentos cirúrgicos e / ou prolongados. Imagiologia de ultra-sons não-invasivo, no entanto, pode ser usado sem expondo cirurgicamente os embriões, mantendo assim a sua fisiologia. Aqui, nós usamos simples ultrassom modo-M para avaliar a freqüência cardíaca de embriões em E18.5 no útero. A detecção de ritmos cardíacos anormais é realmente uma boa indicator de disfunção do coração e, portanto, constitui uma primeira etapa na identificação de defeitos de desenvolvimento que podem levar a insuficiência cardíaca.

O método acima foi utilizado para avaliar o impacto da presença ou ausência da furina serina-protease em células endoteliais em frequências cardíacas de embriões de ratinho no E18.5 no útero. Furina pertence à família das convertases pró-proteína (PCs) que os precursores de proteína clivam depois de resíduos básicos. Furina e seus substratos são proteínas secretoras e clivagem pode ocorrer no aparelho de Golgi, endossomas ou na superfície da célula. Substratos chave de furina incluem TGFb, e ...

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In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero.

Na medição utero da frequência cardíaca em rato por não invasiva em modo M Ecocardiografia

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

in-utero-measurement-heart-rate-mouse-noninvasive-m-mode

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

11.3K visualizações.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal.  Ultra-alta freqüência ultra-som é uma ferramenta de imagem ao vivo poderoso para examinar anormalidades cardíacas em pequenos animais. Sua noninvasiveness permite manter o estado fisiológico de embriões. Aqui, vamos mostrar o uso do M-modo ultra-som para medir os batimentos cardíacos de embriões em E18.5 no útero. 

Vídeo: In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Transthoracic Echocardiography in Mice

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene expression. Transgenic and gene targeting methods can be used to generate mice with altered cardiac size and function,1-3 and as a result, in vivo techniques are needed to evaluate their cardiac phenotype. Transthoracic echocardiography, pulse wave Doppler (PWD), and tissue Doppler imaging (TDI) can be used to provide dimensional measurements of the mouse heart and to quantify the degree of cardiac systolic and diastolic performance. Two-dimensional imaging is used to detect abnormal anatomy or movements of the left ventricle, whereas M-mode echo is used for quantification of cardiac dimensions and contractility.4,5 In addition, PWD is used to quantify localized velocity of turbulent flow,6 whereas TDI is used to measure the velocity of myocardial motion.7 Thus, transthoracic echocardiography offers a comprehensive method for the noninvasive evaluation of cardiac function in mice.

Transthoracic echocardiography offers a noninvasive method for the evaluation of cardiac function in mice. A combination of ultrasound and Doppler imaging modalities can be used to obtain dimensional measurements of the heart and intracardiac blood flow, which together provide an assessment of cardiac systolic and diastolic performance.

Ecocardiografia transtorácica em Ratos

In recent years, murine models have become the primary avenue for studying the molecular mechanisms of cardiac dysfunction resulting from changes in gene ...

Medicina

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Um modelo do rato de No Utero Transplante

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Avaliação da Estrutura e Função do Ventrículo Direito em modelo de camundongo Pulmonary Artery constrição por Ecocardiografia transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Avaliação não invasiva da Cardiac Anormalidades em Experimental Auto-imune Miocardite por Ressonância Magnética Microscopia de imagem no Rato

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular (LV) filling compared with a continuous linear jet. Vortex ring development is most often quantified with vortex formation time (VFT), a dimensionless parameter based on fluid ejection from a rigid tube. Our group is interested in factors that affect LV filling efficiency during cardiac surgery. In this report, we describe how to use standard two-dimensional (2D) and Doppler transesophageal echocardiography (TEE) to noninvasively derive the variables needed to calculate VFT. We calculate atrial filling fraction (&#946;) from velocity-time integrals of trans-mitral early LV filling and atrial systole blood flow velocity waveforms measured in the mid-esophageal four-chamber TEE view. Stroke volume (SV) is calculated as the product of the diameter of the LV outflow track measured in the mid-esophageal long axis TEE view and the velocity-time integral of blood flow through the outflow track determined in the deep transgastric view using pulse-wave Doppler. Finally, mitral valve diameter (D) is determined as the average of major and minor axis lengths measured in orthogonal mid-esophageal bicommissural and long axis imaging planes, respectively. VFT is then calculated as 4 &#215; (1-&#946;) &#215; SV/(&#960;D3). We have used this technique to analyze VFT in several groups of patients with differing cardiac abnormalities. We discuss our application of this technique and its potential limitations and also review our results to date. Noninvasive measurement of VFT using TEE is straightforward in anesthetized patients undergoing cardiac surgery. The technique may allow cardiac anesthesiologists and surgeons to assess the impact of pathological conditions and surgical interventions on LV filling efficiency in real time.

We describe a protocol to measure vortex formation time, an index of left ventricular filling efficiency, using standard transesophageal echocardiography techniques in patients undergoing cardiac surgery. We apply this technique to analyze vortex formation time in several groups of patients with differing cardiac pathologies.

Determinação não-invasiva de tempo de formação do vórtice usando ecocardiografia transesofágica durante cirurgia cardíaca

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Noninvasive Electrocardiography in the Perinatal Mouse

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both human and animal models of disease. Individual heart rate, rhythm, and regularity, combined with quantitative parameters collected from ECG, serve to assess the integrity of the cardiac conduction system as well as the integrated physiology of the cardiac cycle. This article provides a comprehensive description of the methods and techniques used to perform a noninvasive ECG on perinatal and neonatal mouse pups as early as the first postnatal day, without requiring the use of anesthetics. This protocol was designed to directly address a need for a standardized and repeatable method for obtaining ECG in newborn mice. From a translational perspective, this protocol proves to be entirely effective for characterization of congenital cardiopulmonary defects generated using transgenic mouse lines, and particularly for analysis of defects causing lethality at or during the first postnatal days. This protocol also aims to directly address a gap in the scientific literature to characterize and provide normative data associated with maturation of the early postnatal cardiac conduction system. This method is not limited to a specific postnatal timepoint, but rather allows for ECG data collection in neonatal mouse pups from birth to postnatal day 10 (P10), a window that is of critical importance for modeling human diseases in vivo, with particular emphasis on congenital heart disease (CHD).

Here, we present a noninvasive electrocardiography (ECG) protocol, optimized for early postnatal mice, that does not require the use of anesthetics.

Eletrocardiografia não invasiva no Rato Perinatal

Electrocardiography (ECG) has long been relied upon as an effective and reliable method of assessing cardiovascular (and cardiopulmonary) function in both ...

Morphological and Functional Assessment of the Right Ventricle Using 3D Echocardiography

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ventricular (RV) function has strong diagnostic and prognostic power in various cardiovascular disorders. Due to its complex morphology and function, assessment of the RV by conventional two-dimensional echocardiography is limited: the everyday clinical practice usually relies on simple linear dimensions and functional measures. Three-dimensional (3D) echocardiography overcame these limitations by providing volumetric quantification of the RV free of geometrical assumptions. Here, we offer a step-by-step guide to obtain and analyze 3D echocardiographic data of the RV using the leading commercially available software. We will quantify 3D RV volumes and ejection fraction. Several technical aspects may help to improve the quality of RV acquisition and analysis as well, which we present in a practical manner. We review the current opportunities and the limiting factors of this method and also highlight the potential applications of 3D RV assessment in current clinical practice.

Here, we provide a step-by-step acquisition and analysis protocol for the 3D volumetric assessment of the right ventricle, mainly focusing on the practical aspects that maximize the feasibility of this technique.

Avaliação Morfológica e Funcional do Ventrículo Direito Utilizando Ecocardiografia 3D

Traditionally, it was believed that the right side of the heart has a minor role in circulation; however, more and more data suggest that right ...

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion pressure. However, it is difficult to monitor the dynamic changes of the coronary arterioles and the capillaries in the whole heart, primarily due to its motion and non-stop beating. Here we describe a method that enables monitoring of arterial perfusion rate, pressure and the diameter changes of the arterioles and capillaries in mouse right ventricular papillary muscles. The mouse septal artery is cannulated and perfused at a constant flow or pressure with the other dynamically measured. After perfusion with a fluorescently labeled lectin (e.g., Alexa Fluor-488 or -633 labeled Wheat-Germ Agglutinin, WGA), the arterioles and capillaries (and other vessels) in right ventricle papillary muscle and septum could be readily imaged. The vessel-diameter changes could then be measured in the presence or absence of heart contractions. When genetically encoded fluorescent proteins were expressed, specific features could be monitored. For examples, pericytes were visualized in mouse hearts that expressed NG2-DsRed. This method has provided a useful platform to study the physiological functions of capillary pericytes in heart. It is also suitable for studying the effect of reagents on the blood flow in heart by measuring the vascular/capillary diameter and the arterial luminal pressure simultaneously. This preparation, combined with a state-of-the-art optic imaging system, allows one to study the blood flow and its control at cellular and molecular level in the heart under near-physiological conditions.

Presented here is a protocol to study the coronary microcirculation in living murine heart tissue by ex vivo monitoring of the arterial perfusion pressure and flow that maintains the pressure, as well as vascular tree components including the capillary beds and pericytes, as the septal artery is cannulated and pressurized.

Medição dinâmica e imagem de capilares, arterioles e pericias em coração de rato

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This paper describes a protocol for assessing changes in contractility in adult human primary ventricular cardiomyocytes utilizing the MyoBLAZER, a non-invasive optical method that preserves the normal physiology and pharmacology of the cells. This optical recording method continuously measures contractility transients from multiple cells in parallel, providing both medium-throughput and valuable information for each individual cell in the field of view, enabling the real-time tracking of drug effects. The cardiomyocyte contractions are induced by paced electrical field stimulation, and the acquired bright field images are fed to an image-processing software that measures the sarcomere shortening across multiple cardiomyocytes. This method rapidly generates different endpoints related to the kinetics of contraction and relaxation phases, and the resulting data can then be interpreted in relation to different concentrations of a test article. This method is also employed in the late stages of preclinical development to perform follow-up mechanistic studies to support ongoing clinical studies. Thus, the adult human primary cardiomyocyte-based model combined with the optical system for continuous contractility monitoring has the potential to contribute to a new era of in vitro cardiac data translatability in preclinical medical therapy development.

This protocol describes how to measure contractility in adult human primary cardiomyocytes from donor hearts with the MyoBLAZER system, a reliable platform for assessing drug-induced changes in contractility during preclinical development.

Medida da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Primários Humanos Isolados

The evaluation of changes in heart contractility is essential during preclinical development for new cardiac- and non-cardiac-targeted compounds. This ...