Este trabalho é financiado por doações NSERC para BK e RG. Os autores também gostariam de agradecer Kehe Xie e Russell Hosain por seus conhecimentos coloração Golgi-Cox.

Todas as experiências foram realizadas em conformidade com o Conselho Canadiano de Tratamento Animal e aprovado pela Universidade de Lethbridge, Comité Animal Care. 1. Criação e Tátil Estimulação <ol><li> Encomende ratas prenhes de animais fornecedores comuns ou raça filhotes em casa usando os procedimentos de criação de laboratório padrão. </li><li> Casa todos os animais em uma sala com temperatura controlada de criação (21 ° C), mantida em uma luz 12:12 hr: ciclo escuro e fornecer acesso a comida e água ad libitum. </li><li> Quando os filhotes nascem, ratos casa, individualmente com os seus descendentes. </li><li> Para evitar estresse adicional relacionado com a manipulação imediatamente após o nascimento, começar a estimulação tátil dos filhotes ao P3. </li><li> Estimulação tátil deve ser realizado três vezes por dia (09:00, 01:00 e 16:00) a partir de P3-P21 e os filhotes devem ser desmamados de suas mães no P21. </li><li> Quando se utiliza um design ninhada cruz, metade dos filhotes from cada ninhada será submetido a estimulação tátil com a outra metade servindo como controle. Aleatoriamente atribuir um número igual de filhotes machos e fêmeas para cada grupo. Para diferenciar filhotes submetidas a estimulação e controles táteis, marcar um grupo de filhotes de cachorro com um marcador permanente sobre as patas traseiras e cauda. Marcação tem que ser reaplicado a cada dois dias. </li></ol> Tátil Estimulação <ol start="7"><li> Remover barragens de sua gaiola e colocá-los em uma gaiola temporária com comida e água. Mantenha a represa e gaiola temporária na sala de criação / habitação. </li><li> Pesar os filhotes de rato como um grupo, antes da sessão de estimulação táctil manhã (09:00). Para cada sessão, rato transporte filhotes suas gaiolas de casa para uma sala de ensaio separado para a estimulação tátil. Coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento que está definido para 24 ° C. </li><li> Use uma placa rígida para dividir a gaiola em duas metades. Coloque filhotes de ratos nas táteis estimulação grupo um meio de controle e filhotes a outra metade.Definir um temporizador de 15 min. </li><li> Usando um espanador-like macio e escovar todos os filhotes do grupo estimulação tátil, ao mesmo tempo, durante 15 minutos consecutivos. Os filhotes de ratos jovens (~ P3-P12) usualmente se amontoam e parecem entrar em um ciclo de sono profundo que torna muito fácil para estimular todos os filhotes de uma só vez. Como a idade filhotes, eles se tornam mais ativas, com alguns filhotes andando e investigar durante a sessão. O experimentador deve se mover continuamente crias errantes no grupo para garantir que cada filhote recebe igual estimulação. </li><li> Uma vez que a 15 min de sessão é completa, transportar os filhotes de volta para a sala de reprodução e retornar a mãe para a jaula. </li><li> Repita este processo três vezes por dia, durante os 19 dias de estimulação tátil. Após a sessão de estimulação tátil final no P21, os filhotes devem ser desmamados de suas mães. Os filhotes devem ser alojados em gaiolas com 5 ou 6 outros animais desmamados do mesmo sexo. </li><li> Se os ratos são submetidos a nenhum teste adicional, que deve ser deixado unperturbada, na luz normal: ciclo escuro com acesso a comida e água ad libitm (além de limpeza gaiola regular e manipulação) até atingirem cerca de 100 dias de idade. Se passando por outras manipulações experimentais, os animais devem ser tratados ou testados de acordo com esses protocolos de laboratório. </li></ol> 2. Sacrifício e Golgi-Cox Coloração <ol><li> Em aproximadamente P100, administrar uma dose excessiva de pentobarbital de sódio através de injecção IP aos ratos e perfundir intracardial com aproximadamente 100 ml de solução salina 0,9%. </li><li> Extraia o cérebro quando a perfusão for concluída. Remover o cérebro do crânio, o corte do nervo óptico por baixo com um esforço para manter o cerebelo intactas; os pesquisadores podem optar por manter ou remover os bulbos olfatórios. Coloque cérebros extraídos em uma garrafa Nalgene opaco com 20 ml de solução de Golgi-Cox 14. </li><li> Mantenha o cérebro em solução de Golgi-Cox por 14 dias. Após 14 dias, substituir o Golgi-Cboi solução com uma solução de sacarose a 30%. Mantenha o cérebro na solução de sacarose por 2-5 dias antes do corte. </li></ol> Nota: Se o cérebro não pode ser seccionado dentro de 14 dias da transferência para a solução de sacarose, o pesquisador precisa substituir a sacarose com um novo estoque de 30% de sacarose. O pesquisador pode substituir a sacarose a cada duas semanas durante quatro meses, sem efeitos adversos sobre a coloração. <ol start="4"><li> A fim de secção do cérebro, o cérebro deve ser seco com papel absorvente e fixo para o palco seccionamento com cola cyanocacrylic. Para evitar a ruptura ou corte irregular, o pesquisador deve ser cauteloso e garantir que todo o cérebro está bem presa ao palco. </li><li> O reservatório vibratome deve ser preenchido com uma solução de sacarose a 6% para um nível que cobre a lâmina de corte. Defina os parâmetros vibratome a uma velocidade e amplitude a 5, (o ponto médio em ambas as escalas). Fatie o cérebro em 200 mM seções e coloque as seções em um micro gelatinizado 2%slides escopo. Certifique-se de manter as seções molhado durante o curso de corte. </li><li> Quando todas as seções de interesse foram coletadas, pressione as seções para os slides, aplicando pressão para as lâminas com papel absorvente umedecido. Armazenar os slides em uma porta-lâminas na câmara de umidade até que eles estejam prontos para ser manchada. Eles devem permanecer na câmara úmida por pelo menos 12 horas, mas não mais do que 4 dias. Os slides precisa ser úmido e não devem ser autorizados a secar. </li><li> Prepare o regimento coloração antes de iniciar o processo de coloração. Etiqueta doze pratos de coloração de vidro (10,7 x 8,5 x 6,8 centímetros) e de processo da seguinte forma: <ol><li> Água destilada - 1 min </li><li> Hidróxido de amónio - 30 min (no escuro) </li><li> Água destilada - 1 min </li><li> Kodak Correção para Film - 30 min (no escuro) </li><li> Água destilada - 1 min </li><li> 50% de álcool - 1 min </li><li> 70% de álcool - 1 min </li><li> 95% de álcool - 1 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> 100% de álcool - 5 min </li><li> Solução (1/3 do clorofórmio, 1/3 HemoDe, 1/3 100% de álcool) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xileno pode ser utilizado em substituição de HemoDe. A fim de garantir a qualidade da coloração consistente, soluções frescos devem ser utilizados para cada porta-lâminas processado. <ol start="8"><li> Após o último 15 min emersão em HemoDe, lamela as lâminas com Permount. </li><li> Permitir que as lâminas para o ar seco antes de examinar com um microscópio. </li></ol>

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	<li>Mychasiuk, R., Ilnystkyy, S., Kovalchuk, O., Kolb, B., Gibb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensity+matters:+Brain,+behaviour,+and+the+epigenome+of+prenatally+stressed+rats.">Intensity matters: Brain, behaviour, and the epigenome of prenatally stressed rats.</a> Neuroscience. 180, 105-110 (2011).</li><li>Muhammad, A., Carroll, C., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+during+development+alters+dendritic+morphology+in+the+nucleus+accumbens+and+prefrontal+cortex.">Stress during development alters dendritic morphology in the nucleus accumbens and prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 216, 103-109 (2012).</li><li>Wiesel, T., Hubel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+visual+deprivation+on+morphology+and+physiology+of+cells+in+the+cat's+lateral+geniculate+body.">Effects of visual deprivation on morphology and physiology of cells in the cat's lateral geniculate body.</a> Journal of Neurophysiology. 26 (978), 6 (1963).</li><li>Dwyer, J., McQuown, S., Leslie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+effects+of+nicotine+on+the+developing+brain.">The dynamic effects of nicotine on the developing brain.</a> Pharmacology &amp; 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Devido à plasticidade ostensiva do cérebro em desenvolvimento, é importante que os procedimentos experimentais envolvendo as primeiras experiências são analisadas e são feitas tentativas para controlar todas as variáveis ​​intervenientes. Por este motivo, uma concepção cruzada maca é utilizada durante o procedimento de estimulação táctil ao garantir que os filhotes são recebem experiências similares em todos os outros domínios de desenvolvimento. Além disso, é também importante que os vários filhotes de ninhadas múltiplas são seleccionadas para análise a fim de evitar a possibilidade de que os efeitos resultar de um desvio num cão ou maca. Estimulação táctil é acreditado para mimetizar o comportamento maternal que ocorre naturalmente, lamber e preparação, que se pensa ser benéfica para o desenvolvimento de descendência. Embora pesquisas anteriores tem enfatizado a primeira semana de vida (P0-P7) para ser um período crítico para lamber e aliciamento 16, a magnitude da mudança identificada de acordo com 18 dias de taestimulação ctile pode implicar que, apesar de existir momentos sensíveis, mais tempo de exposição é superior. Também é importante notar que os filhotes receberam estimulação táctil neste paradigma experimental também experimentar lambendo e preparação de suas mães, por conseguinte, a estimulação táctil é, para além da estimulação normal, administrados pela mãe. Finalmente, é preciso também estar ciente das mudanças depende de cada região. Embora a estimulação tátil durante o desenvolvimento do aumento da complexidade dendrítica no córtex pré-frontal, isso não garante que as mudanças estruturais desta natureza será evidente em todas as regiões do cérebro. É possível que a morfologia neuronal em outras regiões do cérebro tais como o córtex parietal, que respondem de uma maneira notavelmente diferente para a mesma experiência. No entanto, porque o procedimento de estimulação tátil é facilmente administrado e não representa qualquer risco para a prole ou barragens, que tem o potencial para servir como uma ferramenta valiosa para muitos estudos de investigação que visam melhorar o desenvolvimentoal resultados. No que diz respeito ao Golgi-Cox coloração de tecidos do cérebro, os passos críticos para visualização bem-sucedida de células neuronais são como se segue: 1) não tem de ser adequada a perfusão do cérebro com uma solução salina. Perfusão inadequada ou insuficiente dos tecidos cerebrais resultados em artefatos dos vasos sanguíneos que o tornam difícil de realmente visualizar células neuronais através do labirinto de vasos sanguíneos, além de complicar a capacidade de fotografar neurônios manchadas. 2) cérebros perfundido deve ser armazenado em solução de Golgi-Cox e a solução de sacarose no escuro. Armazenar o tecido cerebral no escuro reduz a coloração do tecido base, mais uma vez aumentando a oportunidade de visualizar com sucesso células neuronais qualidade. 3) O tecido cerebral é armazenado em solução de sacarose a seguir a 14 dias de armazenamento em solução de Golgi-Cox. Quando o tecido é imerso na solução de sacarose a 30% durante 2-5 dias, os cérebros são mais flexíveis que impede quebra e rasgamento das secções quandocorte. É importante evitar que o tecido cerebral de que permanece na solução de sacarose, por períodos de tempo aumentados (a não ser que a solução de sacarose é continuamente substituída com solução fresca), porque o armazenamento prolongado em sacarose, reduz a qualidade da coloração. 4) Finalmente, uma vez que as lâminas foram manchadas e tampa deslizado, eles devem ser dado tempo suficiente para secar antes de visualização com um microscópio. Se os slides não são permitidas para o ar seco adequadamente, o tecido pode escurecer, reduzindo a visualização bem-sucedida de neurônios corticais. Mudanças estáveis ​​no funcionamento psicológico e respostas comportamentais que ocorrem em resposta a experiências são acreditados para ser facilitada pela reorganização da morfologia neuronal e conectividade sináptica 17. Como estas alterações estruturais proporcionar um recurso para mensurável dependente da experiência plasticidade, a utilização de um procedimento de coloração de confiança é importante. Procedimento de coloração de Golgi-Cox baseado Este vibratome fornece mancha confiáveling de galhos finos e espinhas dendríticas que podem não ser evidentes com outros protocolos como celoidina-incorporação. A peculiaridade do processo de Golgi-Cox decorre de sua capacidade de manchar apenas uma pequena fração dos elementos neuronais (1-10%), o que permite o rastreamento de neurônios individuais para longas distâncias. Apesar do fato de que apenas uma pequena fração dos neurônios são impregnadas com a mancha, as células que são processados ​​visível, manter todos os recursos, incluindo corpo celular, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Além disso, quando o procedimento de coloração é realizado corretamente, as células marcadas destacam-se claramente e distintamente contra um fundo transparente, porque outras estruturas corticais permanecem unstained e transparente. Devido à constatação de que alterações persistentes no funcionamento exterior deve estar relacionada com a plasticidade do sistema nervoso, ou seja, a capacidade dos neurônios para modificar sua estrutura e conectividade, o procedimento de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores umatécnica confiável para visualizar e quantificar essa plasticidade.

Embora existam muitas técnicas relatadas e utilizados para a análise das primeiras experiências negativas na maturação do cérebro, como o stress perinatal 1,2, privação sensorial 3 e toxicidade de drogas 4, há muito poucas metodologias empregadas para examinar os efeitos de experiências positivas em este período de tempo. Além de enriquecimento ambiental, estimulação táctil é um dos poucos cérebro, melhorando os tratamentos com efeitos demonstrados 5. A estimulação tátil é um método de estimulação sensorial para a pele que imita o comportamento de ratos materna, lambendo e aliciamento. Sua aceitação geral como uma manipulação positiva surge a partir de estudos que indicam que a estimulação tátil melhorado maturação de recém-nascidos prematuros e ratos recém-nascidos 6. Além disso, a pesquisa no laboratório Meaney 7 demonstrou que os níveis mais elevados de lamber materna e aliciamento estão ligados a resultados positivos na prole. Devido a tinfluências positivas stas, estimulação tátil evoluiu rapidamente em uma estratégia de remediação que visa reduzir a ansiedade 8, melhorando os resultados associados com lesão cerebral 9-11, e atenuação de sensibilização da droga 12. Como tal, a estimulação tátil é uma técnica valiosa para a promoção de primeiras experiências positivas, com uma capacidade comprovada para reorganizar drasticamente morfologia neuronal e conectividade sináptica do cérebro em desenvolvimento. De modo a examinar e quantificar as alterações na morfologia neuronal, é necessário visualizar os neurónios intactos. O procedimento de coloração de Golgi-Cox é uma modificação da técnica de Camillo Golgi publicado no final de 1800 que fornece coloração discreta de um pequeno número de neurônios completos 13. Embora o procedimento parece manchar os neurônios de forma aleatória e reprodutibilidade é comumente citado como grande falha, a visualização permite taxa de impregnação pequena de todo o elemento neuronal, incluindo cecorpos ll, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Da mesma forma, o tempo necessário para impregnar um dado cérebro com solução de Golgi, também tem sido citado como uma queda. No entanto, dado que uma vez que a coloração é tecido completo pode ser preservado indefinidamente, e o tempo entre a perfusão do cérebro e da visualização dos neurónios com um microscópio pode ser completado em menos de 21 dias, o período de tempo não é razoável. Além disso, com pequenas modificações no protocolo, a coloração de Golgi-Cox pode ser efetivamente usado para impregnar cérebros dos roedores de todas as faixas etárias. Como as mudanças no nível estrutural têm sido associados a modificações persistentes para funcionamento comportamental e psicológica, a técnica de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para medir a neuroplasticidade.

<table><tbody><tr><td>Potassium Dichromate</td><td>Fisher</td><td>P188</td><td></td></tr><tr><td>Mercuric Chloride</td><td>Fisher</td><td>M1561</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chromate</td><td>Fisher</td><td>P220</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide</td><td>Fisher</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Kodak Rapid Fix</td><td>Vistek</td><td>Kodak 146 4016</td><td></td></tr><tr><td>EtOH-95 &amp;amp; Anhydrous</td><td>Commercial Alcohols</td><td>No Cat Numbers</td><td>All other Et-OH are dilutions</td></tr><tr><td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td><td>Safeway</td><td></td><td>Can be found at most grocery stores</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9378</td><td></td></tr><tr><td>HemoDe</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>23410</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>Sp15</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>160004-365</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>062011-9</td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

Para gerar mudanças de longo prazo no comportamento, experiências devem ser estáveis ​​produzindo mudanças na morfologia neuronal e conectividade sináptica. A estimulação tátil é uma experiência inicial positiva que imita materna lambendo e aliciamento no rato. Expondo filhotes de ratos para esta experiência positiva pode ser concluída de forma fácil e econômica, utilizando materiais altamente acessíveis, tais como um espanador doméstico. Usando um projeto cross-ninhada, os filhotes são ou acariciou ou deixado em repouso, por 15 minutos, três vezes por dia durante o período perinatal. Para medir as mudanças de neuroplasticidade relacionados com esta experiência inicial positiva, é utilizado Golgi-Cox coloração do tecido cerebral. Devido ao facto de Golgi-Cox impregnação cora um número discreto de neurónios, em vez de todas as células, a coloração do cérebro de roedores com solução de Golgi-Cox permite a visualização de elementos neuronais inteiros, incluindo o corpo da célula, os dendritos, axónios e espinhas dendríticas. O procedimento i coloraçãos realizados ao longo de vários dias e exige que o pesquisador preste muita atenção aos detalhes. No entanto, uma vez que a coloração é concluído, a totalidade do cérebro foi impregnada e pode ser preservado indefinidamente para análise contínua. Portanto, a coloração de Golgi-Cox é um recurso valioso para o estudo de dependentes de experiência plasticidade.

Quando este processo de coloração foi seguido de forma adequada, a coloração consistente e uniforme de dendritos e espinhas é gerado. Ver Figura 1 para uma representação de coloração neuronal Golgi-Cox. Este procedimento produz coloração que é comparável à visualização dos campos dendríticas que são ininterrupta embutindo tecido seguinte recentemente desenvolvido métodos in vitro e podem permitir. A técnica baseada vibratome para a coloração de Golgi-Cox foi encontrado para produzir coloração mais generalizada de ramos terminais e neurônios piramidais, de coloração com ou incorporado-celoidina e tecido seccionado-criostato de 15. Além disso, porque este método de coloração impregna todo o cérebro, todas as seções podem ser analisados ​​imediatamente ou no futuro. Como o local da mudança morfológica é que nem sempre é óbvia ao gerar uma hipótese original, este processo permite a exploração de regiões cerebrais adicionais umd impede a eliminação de tecido que pode ser útil no futuro. Este método de coloração pode ser usado para a coloração confiável de quaisquer cérebros de ratos idosos (idade P0 de idade). No entanto, quando a coloração cérebros jovens (&lt;1 grama), o cérebro deve apenas permanecem na solução de Golgi-Cox durante 6 dias, em vez dos 14 dias recomendados para cérebros adultos, todos os outros procedimentos são mantidos constantes. A principal dificuldade que pode ser encontrada durante o processo de coloração de Golgi-Cox é a incapacidade de produzir a coloração de regiões cerebrais centrais, incluindo o tálamo de alta qualidade. Como todo o cérebro é impregnado, ao mesmo tempo, as regiões centrais pode não receber concentrações ideais de mancha. Apesar desta descoberta, a técnica de Golgi-Cox produz coloração excepcional das regiões subcorticais, tais como o hipocampo e estriado. Uma limitação final do processo decorre de incompleta remoção de sangue do cérebro durante o processo de perfusão. O sangue pode produzir artefatos no tecido cerebralque torna difícil para fotografar e rastrear os neurônios. Técnicas de coloração de Golgi-Cox fornecer uma medida confiável da morfologia dendrítica e neuroanatomia que é útil para uma extensa gama de estudos destinados a examinar as mudanças no nível neuronal. Ao examinar a estrutura neuronal no córtex pré-frontal após a estimulação tátil no período pós-natal precoce, coloração Golgi-Cox revelou um aumento dramático na complexidade dendrítica. Alterações anatômicas relacionadas com a estimulação tátil precoce pode ser demonstrada visualmente comparando densidade da coluna de neurônios piramidais de um rato controle para piramidal neurônios de um rato que passou por estimulação tátil (veja a Figura 1). Além disso, os parâmetros tais como a arborização dendrítica, dendrítica comprimento, e densidade de espinha podem ser calculadas e analisadas estatisticamente para gerar dados contínua, que podem ser comparados entre os animais. Para gerar resultados confiáveis, a análise deve ser realizada em amínima de três animais por grupo de tratamento e, aproximadamente, cinco neurónios por hemisfério deve ser seleccionado aleatoriamente para cada região do cérebro em análise. Figura 2 demonstra a complexidade dendrítica (espinhas / mM x mM de dendrite) dos animais que receberam estimulação e animais que não táctil . Em ambos os campos apicais e basilar dos neurônios analisados ​​a partir da mPFC (CG3), estimulação tátil resultou na proliferação de parâmetros neuronais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Figura 1. A. Representante fotografia de um Golgi-Cox manchado neurônio piramidal da camada III da área CG3 em um rato que recebeu estimulação tátil durante o desenvolvimento. B. Representante ampliada (1.000 X) fotografia de espinhas dendríticas nos dendritos terminais na área basilar da CG3 , a imagem mais clara da esquerda é para um rato no grupo de controle ea imagem mais escuro no right é de um rato que receberam estimulação tátil. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> Figura 2. Representação ilustrativa da complexidade dendrítica apical e basilar média (espinhas / mM x mm) para os neurónios na área de CG3 de ratos adultos que receberam estimulação táctil ou durante o desenvolvimento ou não (* p &lt;0,01).

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Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras.

Visualizar os Efeitos de uma experiência precoce positiva, Tátil Estimulação, em dendríticas Morfologia e Synaptic conectividade com Golgi-Cox Coloração

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.0K visualizações.  University of Lethbridge.  Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras. 

Vídeo: Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become imperative to develop objective approaches to quantify changes in synaptic connectivity. Starting from sample fixation, this protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers. The number of these colocalizations is quantified using a plug in Puncta Analyzer (written by Bary Wark, available upon request, c.eroglu@cellbio.duke.edu) under the ImageJ analysis software platform. The synapse assay described in this protocol can be applied to any neural tissue or culture preparation for which you have selective pre- and postsynaptic markers. This synapse assay is a valuable tool that can be widely utilized in the study of synaptic development.

This protocol details how to quantify synapse number both in dissociated neuronal culture and in brain sections using immunocytochemistry. Using compartment-specific antibodies, we label presynaptic terminals as well as sites of postsynaptic specialization. We define synapses as points of colocalization between the signals generated by these markers.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

One of the most important goals in neuroscience is to understand the molecular cues that instruct early stages of synapse formation. As such it has become ...

Neurociência

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Induzir o crescimento dendrítico no cultivadas neurônios simpáticos

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

Avaliação dos parâmetros de neuroplasticidade ultraestrutural depois no Utero transdução da medula espinhal e cérebro de rato em desenvolvimento

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Biologia do Desenvolvimento

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Neurônios de imagem dentro de seções do cérebro grossas usando o método de Golgi-Cox

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilizando a eletroporação pós-natal in vivo para estudar a morfologia do neurônio do grânulo cerebelar e o desenvolvimento da sinapse

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.