Este trabalho foi apoiado pelo Escritório de Investigação e Desenvolvimento, RR &amp; D Service, do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA, NIH COBRE 1P20RR024484, NIH K24 AR02128 eo Departamento de Defesa W81XWH-10-1-0643.

1. Biaxial Carregando biorreator projeto <ol><li> O biorreactor emprega duas fases produzidos pela Thor-labs (Newton, MA) para aplicações de laser guiadas com precisão para a aplicação uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para engenharia de tecidos, com uma grande precisão da dose de carga (amplitude e frequência), e aplicação a uma ampla variedade de condições de cultura de tecidos a partir de único para placas de 24 poços (Figura 1). </li><li> Carga bi-axial é realizada por duas fases Travelmax (LNR50SE). Esses estágios são montados ortogonalmente numa configuração XZ. A fase horizontal proporciona movimentos de cisalhamento dinâmico oscilando ao longo do eixo-X. A fase de carga de compressão vertical prever dinâmico oscilando ao longo do eixo-Z. Estes estágios têm uma faixa de deslocamento 50 mm e são conduzidos de forma independente por atuadores de motor de passo (DRV014), controlada por um motorista do motor de ciclo fechado de passo (BSC102), que possui capacidade de micro-stepping, permitindo tamanhos de passo de menos de50 nm. </li><li> O dispositivo é montado sobre uma rígida 25 centímetros x 30 cm x 12,5 mm placa base de alumínio que é usado como uma plataforma para a montagem dos componentes da máquina e para a montagem de placas de cultura de tecidos. Paragens ajustáveis ​​cinemáticos são usados ​​para bloquear as placas de cultura de tecidos no local sobre a placa base de alumínio. Essas paradas cinemáticas têm parafusos de ajuste fino para permitir o alinhamento preciso que não é possível de outra forma com a mão. O design modular do prato de base permite a colocação flexível dessas paragens cinemáticos para acomodar placas de diferentes tamanhos e formas (placas de Petri vs placas de poços múltiplos). </li><li> A custom-usinado polysulfone carregamento cilindro é acoplado à plataforma móvel bi-axial através de um sinal de maior precisão usinadas. Material de Polysulfone foi escolhido devido à sua biocompatibilidade, facilidade de usinagem e facilidade de esterilização. </li><li> Movimentos dos estágios são controlados pela Tecnologia Avançada de Posicionamento &#39;Thor-labs (APT) software. O condutor do motor de passo nos éed em combinação com o software que permite o ajuste dos parâmetros de carregamento de frequência e amplitude de cisalhamento e compressão, tanto independentemente como simultaneamente. </li><li> Realimentação posicional é fornecida por encoders ópticos lineares que estão ligados a cada plataforma móvel e estão integrados com o software. O sistema codificador tem uma repetibilidade bidirecional de 0,1 mM e uma resolução de 20 nm, traduzindo-se a precisão posicional de menos de 3 mM sobre os total de 50 mm de curso. Estes encoders fornecer o necessário feedback de posição no sistema eletrônico da unidade para garantir verdadeiras capacidades nanoposicionamento e uma leitura direta da posição absoluta. </li><li> A fim de proporcionar a realimentação de força necessária para a detecção de contacto entre a prensa e as amostras e avaliar as respostas de carga, uma célula de carga em miniatura precisão (Honeywell Modelo 31) está posicionada entre o cilindro de carregamento e a plataforma móvel (figura 2). A célula de carga tem alta precisão de0,15% a 0,25% da escala total. A unidade de exibição (SC500) para a célula de carga também pode fornecer medições de carga de até 5 casas decimais. Além disso, tem uma porta RS-232 para permitir a recolha de dados de um computador. </li></ol> 2. Célula-semeado de agarose Construções <ol><li> Prepare a 4% de agarose: Adicionar 0,8 g de agarose de 20 ml de DMEM (sem aditivos) num frasco de 50 ml, fervura, e, em seguida manter a 70 ° C no forno até à sua utilização. </li><li> Ajustar o volume de suspensão celular para dobro da densidade de semeadura de células desejado. Esta suspensão é misturada com um volume igual de 4% w / v de agarose para criar um gel de agarose a 2% para a densidade desejada a semeadura. </li><li> Colocar ambos a suspensão de células e uma pipeta de 10 ml na incubadora. </li><li> Configure o sistema de fundição gel. Uma 1,5 mm e uma 0,75 milímetros placa separadora devem ser colocados juntos para criar um gel grosso 2,25 milímetros. Outras placas espaçadoras tamanho pode ser usado para criar diferentes espessuras de gel. O sistema de fundição de gel não é grande o suficiente para manter estas placas togetela, então eles devem ser firmemente gravado para evitar vazamentos. </li><li> O próximo passo é misturar rapidamente a suspensão de células com a agarose previamente preparadas e pipeta no interior do molde de gel, antes da agarose solidificar. Remover o líquido de agarose do forno e colocar um termómetro estéril no mesmo. A agarose deve arrefecer até 42-43 ° C antes da mistura com as células. Aqueça a suspensão de células a 37 ° C. Uma vez que a agarose atinge 43 ° C, de forma rápida, pipetar-se a quantidade desejada e, em seguida, pipeta imediatamente a suspensão de células para cima e para baixo algumas vezes para misturar. Em seguida, pipeta imediatamente toda a mistura para dentro do molde do gel. </li><li> Permita que o gel solidificar por 10-15 min e, em seguida, incline-o cuidadosamente para a posição horizontal. </li><li> Remova a placa de vidro superior e discos perfurados com a biópsia. Os discos podem ser pego com uma pequena espátula estéril. Em nossa experiência, a 9 ml gel era grande o suficiente para fazer mais de uma centena de discos de 5 mm de diâmetro. </li></ol> 3. Cultura dos Discos </p&gt; <ol><li> Coloque um disco em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços não-tecido tratado. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de diferenciação sem soro condrogénica a cada poço. </li><li> Colocar as placas em incubadora (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> De alterações na mídia, substitua 1 ml por poço a cada 2-3 dias. </li></ol> 4. Imobilização de amostras para Carregamento mecânico <ol><li> Prepare a 4% de agarose (nenhuma suspensão de células adicionado) e o gel deve ser mais fino do que as próprias amostras (para evitar interferência durante o carregamento). A espessura recomendada é de 1,5-1,9 mm (para as amostras de 2,25 milímetros de espessura). </li><li> Uma vez gelificada, os discos 16 mm de diâmetro perfurados para placas de 24 poços. Em cada disco, perfurador um milímetro furo 5 para a amostra a ser colocado dentro Se desejado, perfurador outro orifício 5 mm na extremidade do disco para a pipeta para ser colocada durante mudanças de meio. </li><li> Uma vez que os poços de agarose foram feitas, no lugar da placa de 24 poços, conforme mostrado na Figura 3. </li><li> Uma vez que a agarose wvaras estão na placa de 24 poços, prima caber amostras em cada poço. A amostra deve sobressair a partir do cimo do poço de agarose. </li></ol> 5. Carga mecânica <ol><li> Esterilizar cilindro (Figura 2). </li><li> Fixe a placa de alumínio para carregar celular. Seguro de carga placa / montagem placa de células / alumínio da carga para o palco. </li><li> Ligue o controlador de motor de passo (interruptor na parte de trás). </li><li> Ligue o PC e programa aberto &quot;APT User&quot; (Figura 4). <ol><li> Tela para a esquerda controla horizontal motor de passo. Tela direita controles verticais motor de passo. Em cada tela, a aba &quot;Graphical Control&quot; permite um posicionamento manual e guia &quot;Move Sequencer&quot; permite a automação. Todas as unidades são mm. </li></ol></li><li> Vá para a aba &quot;Control Gráfico&quot; em ambas as telas e pressione o botão &quot;Home / Zero&quot;. Ambos os motores passo a passo tem um intervalo de 50 mm. Pressionando &quot;Home / Zero&quot; vai enviar dois motores de passo para a posição zero (superior e à direita a maioria das posições). </li><li> Prepare as amostras da placa de 24 poços para o carregamento por alguns meios de remoção de cada poço. Não mais do que 1 ml de meio deve ser deixado em cada poço para evitar transbordamento durante o carregamento. Certifique-se de que a mídia suficiente no poço para manter a amostra coberta. <ol><li> Note-se que a incubadora seja mantida em condições de baixa humidade para evitar falha do instrumento. </li></ol></li><li> Lugar de 24 poços placa em biorreator e alinhar-se com cuidado com o rolo. <ol><li> A placa é presa ao bioreactor utilizando quatro localizadores cinemáticos ajustáveis. Para tornar mais fácil para alinhar o rolo, os dois localizadores esquerdo foram pré-posicionada. Aperte os dois localizadores de direito para que o prato é seguro. Certifique-se de alinhar a placa nivelada com a frente da base do biorreator. </li><li> Na aba &quot;Control Gráfico&quot;, uma posição específica motor de passo pode ser digitado manualmente, clicando na caixa de posição. Use esse recurso para reduzir lentamente o cilindro e movê-lo na horizontal para alinhar com a placa. </li> &lt;/ Ol&gt; </li><li> Uma vez que a placa está perto de entrar em contato com as amostras, começar a trazer o rolo para baixo em incrementos muito lento (0.1 mm) até chegar à posição inicial pré-determinado (ver parte 6). </li><li> Uma vez que a posição inicial é alcançado, vá em &quot;Mover Sequencer&quot; guia e carregar a seqüência de movimento desejado pressionando &quot;Load&quot;. Em seguida, pressione &quot;Executar&quot; para começar. (Figura 5) Ver parte 7. Escrevendo um protocolo de tratamento. </li><li> Quando terminar de carregar, levantar manualmente a exposição. Se todas as amostras estão presos à placa, cuidadosamente colocá-los de volta para o adequado bem com uma espátula estéril. </li><li> Remover 24 poços placa de biorreator e substituir os meios de comunicação. </li><li> Cuidadosamente retire o cilindro da célula de carga e, em seguida, desligue instrumentos. </li></ol> 6. Calibrar Carregando Platen Para garantir que as estirpes adequadas sejam aplicadas às amostras, cada cilindro tem de ser cuidadosamente calibrada antes de se iniciar um ensaio. <ol><li&gt; Siga os passos 5,1-5,8. </li><li> Colocar manualmente horizontal motor de passo na posição de 25 mm. </li><li> Cuidadosamente abaixe cilindro até que mal entra em contato com a base do biorreator. Célula de carga irá mostrar aumento de cargas neste momento. Tome nota da posição exata da vertical motor de passo (ser tão precisa quanto possível, todas as medições de deformação de compressão serão computados a partir deste valor). </li><li> Registrar a posição. Este valor será usado para escrever um protocolo de tratamento baseado nas dimensões da amostra e estirpes desejadas. </li></ol> 7. Escrevendo um protocolo de tratamento <ol><li> O bioreactor é capaz de aplicar tensão, tanto à compressão e ao cisalhamento, simultaneamente ou individualmente. Três parâmetros principais devem ser decididas: tara compressão tensão, amplitude de tensão dinâmica e carregamento de freqüência. </li><li> Uma estirpe de tara é aplicada a fim de impedir a decolagem do cilindro a partir da amostra. </li><li> Exemplo de amplitude de tensão de carga dinâmica e frecia são escolhidos. </li></ol> Neste estudo, definimos tensão de compressão e de cisalhamento, como se segue: <img alt="Equação 1" fo:content-width="3.26in" fo:src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50387/50387eq1.jpg" /> Exemplo Biaxial Protocolo de Dosagem Espessura da amostra: 2,25 milímetros Estirpe da embalagem (compressão): 10% da espessura da amostra (0,225 milímetro) Amplitude de deformação dinâmica (compressão): 10% (+ / - 5% da espessura da amostra) Frequência (compressão): 1 Hz A amplitude dinâmica Strain (cisalhamento): 25% da espessura da amostra (0,5625 milímetro): Tensão de cisalhamento é aplicada à amostra pela placa móvel horizontalmente. Frequência (cisalhamento): 0,5 Hz Protocolo de tratamento típico é de 3 horas de carga por dia. Neste exemplo, a carga dinâmica e de corte é aplicada simultaneamente em vez de consecutivamente. Acreditamos que este padrão melhor MIMics as condições de carga no complexo do joelho humana. <ol start="4"><li> Uma vez que o protocolo de tratamento foi selecionado, um programa de seqüência movimento de compressão deve ser escrita. </li><li> A seqüência de movimento é exatamente o que parece, de uma lista de posições que o motor de passo vai passar para a uma aceleração e velocidade máxima especificada. </li><li> Calcule posições verticais desejadas de acordo com a dosagem de protocolo e cilindro valor de calibração (da parte 6). </li><li> Exemplo cálculos para expositor 1 são apresentados a seguir: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Diferença em relação ao valor de calibração </td><td> Posição Vertical </td></tr><tr><td> Platen valor de calibração (toques fundo do biorreator) </td><td> 0 milímetros </td><td> 29,7700 milímetros </td></tr><tr><td> Platen faz contato com amostra (2,25 milímetros da amostra) </td><td> 4,4140 milímetro </td><td> 25,3560 milímetros </td></tr><tr><td> Stchuva (5% de espessura) </td><td> 4,3015 milímetro </td><td> 25,4705 milímetros </td></tr><tr><td> Strain (10% de espessura) </td><td> 4,1890 milímetro </td><td> 25,5810 milímetros </td></tr><tr><td> Strain (15% Espessura) </td><td> 4,0765 milímetro </td><td> 25,6955 milímetros </td></tr></tbody></table><ol start="8"><li> Uma vez que as posições são computados, experiência com valores de aceleração e velocidade máxima para obter a freqüência correta. O número de ciclos deve ser escolhido em conformidade (por exemplo, 10.800 ciclos de 3 horas a 1 Hz). </li><li> Exemplo programação da sequência de movimento de compressão dinâmica (10% de compressão de tara, 10% de amplitude de tensão dinâmica, 1 Hz) (Figura 5) </li><li> Programa seqüência movimento de cisalhamento dinâmico: O número de ciclos deve ser escolhido de acordo com a frequência e duração desejada (por exemplo, 5.400 ciclos de 3 horas a 0,5 Hz). </li><li> Exemplo programação da sequência de movimento de cisalhamento dinâmico (10% de compressão da tara, 0,5625 milímetros (25% da espessura), amplitude de deformação de cisalhamento dinâmico, 0,5Hz) (Figura 5). </li></ol>

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	<li>Drachman, D. B., Sokoloff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+movement+in+embryonic+joint+development.">The role of movement in embryonic joint development.</a> Devl. Biol. 14, 401-420 (1966).</li><li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte/agarose+culture.">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> J. 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Cell Mater. 22, 214-225 (2011).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Nós projetamos um dispositivo de carga que é capaz de aplicar uniaxial ou biaxial tensão mecânica de tecido construções engenharia fabricados para transplante. O dispositivo pode ser usado como um biorreactor de cultivo in vitro de biocompósitos engenharia ou como um dispositivo de teste para descrever as características mecânicas do tecido nativo ou após outros tratamentos anteriores. Os sujeitos de dispositivos concebidos para construções de tecido biaxial de carregamento mecânico com grande prec...

Nós projetamos um biorreator de carga que é capaz de aplicar uniaxial ou biaxial tensão mecânica a um tecido biocompósitos engenharia fabricados para transplante. Este dispositivo é concebido principalmente como um biorreactor para substituições de engenharia para a cartilagem articular, mas também poderia ser utilizado para outros tecidos estruturais no corpo humano. A nossa motivação neste projeto biorreator decorre Drachman e Sokoloff 1, que fez a observação seminal de formação anormal da cartilagem articular em embriões de galinha paralisadas devido à falta de movimento. Da mesma forma, o exercício físico é essencial para o desenvolvimento do músculo normal e osso. De acordo com este conceito, muitos grupos de pesquisa têm investigado como diferentes modos de estímulos físicos durante o cultivo in vitro modula as propriedades bioquímicas e mecânicas dos biocompósitos célula-biomaterial e explantes de tecido 2-7. O conceito de engenharia de tecidos funcionaisenvolve a utilização in vitro de estímulos mecânicos para melhorar as propriedades funcionais de tecidos, isto é, as propriedades mecânicas, que permitem que o tecido para resistir ao esperado no stress in vivo e coe 8,9. Numerosos estudos relatam o uso carregamento mecânico em termos de cisalhamento e compressão para estimular construções cartilagem de engenharia para juntas articulares. Mauck et al. 10 sugerem que a carga mecânica sozinha pode induzir condrogénese de células estaminais mesenquimais, mesmo na ausência de factores de crescimento que são consideradas vitais. Aplicação de carregamento mecânico intermitente, tais como a compressão de cisalhamento ou durante o cultivo de tecidos tem sido mostrado para modular a formação do osso e cartilagem, no entanto, a dosimetria óptima de alimentação varia com as propriedades do tecido celular e 11. A função mais importante das cartilagens articulares é a capacidade de resistir a forças de compressão e de corte dentroa articulação, portanto, ele tem que ter alta compressão e módulos de cisalhamento. A falta de resistência mecânica funcional e ultra fisiológico na cartilagem engenharia resultou na degradação em neo-cartilagem in vivo e a insuficiência das estratégias de substituição de cartilagem em articulações. Apesar de compressão e de cisalhamento têm sido comumente demonstrado modular e melhorar a resistência mecânica da cartilagem articular biocompósitos, uma abordagem combinada é raro 6,12-15. Wartella e Wayne 16 projetou um biorreator que se aplica a tensão e compressão para produzir substitutos de cartilagem do menisco. Waldman et al. 15 concebido para aplicar um dispositivo de compressão e de cisalhamento de condrócitos em cultura num substrato poroso polifosfato de cálcio. Bian et al. 17 demonstraram propriedades mecânicas correspondentes cartilagem nativa com a cultura in vitro de condrócitos caninos adultos em geles e aplicação de biaxial Mechmecânicos de carregamento (compressão deformational carga e deslizamento de carga de contato). O biaxial biorreator carregamento mecânico foi originalmente concebido por Danielle Chu em nosso laboratório com o objetivo geral de induzir adaptações morfológicas em tecido de cartilagem engenharia constrói resultando em módulos de compressão e de cisalhamento mais elevadas do que as actualmente disponíveis 18. Acreditamos que esta pesquisa irá aumentar significativamente a nossa compreensão mais ampla de como mechanotransduction pode ser modulada para engenheiro de tecidos clinicamente relevantes.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, High glucose, pyruvate</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 39346-81-1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Glutamine 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ITS+ Premix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen Strep Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>041-95780</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-2218</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonessential Amino Acid Solution 100x</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7145</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-5607</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2915</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human Transforming Growth Factor &beta;1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240-B-010</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 31 Load Cell (1000 g)</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>AL311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Single Channel Display</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>SC500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50SE/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Two Channel Stepper Motor Controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BSC102</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DRV014</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adjustable Kinematic Locator (4)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KL02</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Right Angle Plate</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vertical Mounting Bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LNR50P2/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Solid Aluminum Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB3030/M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates </td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1653312 and #1653310 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable Biopsy Punch, 5 mm</td>
			<td>Miltex, Inc.</td>
			<td>33-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16 mm hollow punch</td>
			<td>Neiko Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86735k19</td>
			<td>Custom-machined</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

design of a biaxial mechanical loading bioreactor for tissue engineering

Nós projectamos um dispositivo de carregamento que seja capaz de aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um tecido de engenharia biocompósitos fabricadas para transplante. Enquanto o dispositivo funciona principalmente como um biorreactor que imita as tensões mecânicas nativas, também está equipado com uma célula de carga para fornecer feedback força ou teste mecânico das construções. Os sujeitos dispositivo projetado construções cartilagem biaxial carga mecânica com grande precisão de dose de ataque (amplitude e freqüência) e é compacto o suficiente para caber dentro de uma cultura de tecidos incubadora padrão. Ele carrega amostras directamente numa placa de cultura de tecidos e em vários tamanhos de placas são compatíveis com o sistema. O dispositivo foi projetado com componentes fabricados para aplicações de laser guiadas com precisão. Carga bi-axial é realizada por duas fases ortogonais. As fases têm uma faixa de percurso 50 mm, e são conduzidos independentemente por actuadores do motor de passo, controlado porum motorista de circuito fechado do motor deslizante que possui capacidades de micro-stepping, permitindo tamanhos de passo de menos de 50 nm. Uma polissulfona de carregamento cilindro está acoplada à plataforma em movimento bi-axial. Movimentos dos estágios são controlados por Thor-laboratórios de Tecnologia Avançada de Posicionamento (APT) software. O excitador do motor de passo é usado com o software para ajustar os parâmetros de carregamento de frequência e amplitude de cisalhamento e compressão, tanto independentemente como simultaneamente. Realimentação de posição é fornecida por codificadores ópticos não lineares que têm uma repetibilidade bidireccional de 0,1 um e uma resolução de 20 nm, traduzindo-se uma precisão de posicionamento inferior a 3 um sobre o total de 50 mm de curso. Estes encoders fornecer o necessário feedback de posição no sistema eletrônico da unidade para garantir verdadeiras capacidades nanoposicionamento. A fim de proporcionar a realimentação de força para detectar e avaliar respostas contacto de carga, uma célula de carga em miniatura precisão está posicionado entre o cilindro de carregamento e o movendoplataforma g. A célula de carga tem grandes precisões de 0,15% a 0,25% da escala total.

O aparelho foi testado utilizando géis de agarose semeada com 20 milhões de células / ml e condrócitos cultivados na presença de uniaxial (compressão) ou biaxial (compressão e ao cisalhamento) a carga mecânica. Condrócitos porcinos primários foram isolados a partir da cartilagem articular de porcos de 2-4 meses de idade. Mm de diâmetro, e as amostras de espessura 1,5 milímetros 5 foram cultivados em 2 ml de meio de cultura condrogénica definida (glicose elevada DMEM, 1% de ITS + Premix, com 100 U / ml de pe...

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Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

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Analysis and Design of Beams for Bending

SCIENTISTS IN ACTION

14.3K visualizações.  The Warren Alpert Brown Medical School of Brown University and the Rhode Island Hospital. Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Vídeo: Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

Funcionamento de um biorreator de bancada

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Design e Construção de Matriz Extracelular Artificial (MECa) Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Para engenharia de tecidos da pele

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa<em&gt; In Vivo</em&gt; Câmara Engenharia de Tecidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

Recombinante colágeno peptídeo Microcarriers para expansão da célula e seu potencial uso como sistema de entrega de células em um bioreator modelo

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Agarose-based Tissue Mimicking Optical Phantoms for Diffuse Reflectance Spectroscopy

This protocol describes how to make agarose-based tissue-mimicking phantoms and demonstrates how to determine their optical properties using a conventional optical system with an integrating sphere. Measuring systems for the acquisition of the diffuse reflectance and total transmittance spectra are constructed with a broadband white light source, a light guide, an achromatic lens, an integrating sphere, a sample holder, an optical fiber probe, and a multi-channel spectrometer. An acrylic mold consisting of two rectangular acrylic pieces and a U-shaped acrylic piece is constructed to create an epidermal phantom and a dermal phantom with whole blood. The application of a sodium dithionite (Na2S2O4) solution to the dermal phantom enables the researcher to deoxygenate hemoglobin in red blood cells distributed in the dermal phantom. The inverse Monte Carlo simulation with the diffuse reflectance and total transmittance spectra measured by a spectrometer with an integrating sphere is performed to determine the absorption coefficient spectrum &#181;a(&#955;) and the reduced scattering coefficient spectrum &#181;s&#39;(&#955;) of each layer phantom. A two-layered phantom mimicking the diffuse reflectance of human skin tissue is also demonstrated by piling up the epidermal phantom on the dermal phantom.

Here, we demonstrate how agarose-based tissue-mimicking optical phantoms are made and how their optical properties are determined using a conventional optical system with an integrating sphere.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

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