Este trabalho foi apoiado por uma EMBO companheirismo de longo prazo (ABW), a Science Foundation Internacional de Pós-Doutorado Bolsa de Investigação Nacional (ABW), a Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), uma bolsa CAVE-BB (AO), eo Conselho Europeu de Investigação de acordo com as Comunidades Europeias Sétimo Programa-Quadro STG-207634 (DS, ACO). Agradecemos Ravi Desai pelos comentários úteis sobre o manuscrito. Gostaríamos também de agradecer a facilidade de expressão de proteínas MPI-CBG para a produção do fragmento de peixe-zebra Fibronectin1, o MPI-CBG pessoal instalação de peixe para o cuidado e manutenção das nossas linhas de peixe e a facilidade de microscopia de luz MPI-CBG para suporte de imagem.

1. Antes Dissecção <ol><li> No dia antes da dissecação, obter embriões a partir de um dos pares de peixe-zebra incross heterozigóticas para o alelo transgénico. <ol><li> Levante embriões em meio E3 sem azul de metileno a 28 o C até o estágio de blindagem (6 horas pós-fertilização). </li><li> Transferência de embriões em meio E3 sem azul de metileno a 20 o CO / N. Aos 20 o C, os embriões formarão um somite por hora, uma vez que eles atinjam fase tailbud. Após 17-20 h de O / N a 20 ° C, os embriões devem ser em 5 a 8 somito fase na manhã seguinte ao início do protocolo de dissecção. </li></ol></li><li> Montar ferramentas e reagentes necessários para dissecção. <ol><li> Pipeta de vidro polido-Fire para a transferência de embriões e tecido </li><li> Par de uma pinça fina para remoção de córions de embriões </li><li> Sylgard-revestido de 35 mm de prato de dissecação - Pour Sylgard polímero num prato de 35 mm e curar S / N a 37 ° C. Faça a dissecção bem usandouma ponta de agulha para remover uma pequena quantidade de polímero curada. O prato pode ser limpa e subsequentemente reutilizado. </li><li> Afiadas, ferramentas de fio de tungstênio achatadas para manipulação de tecidos PSM </li><li> Micro-bisturi para cortar pedaços desejados de PSM para a cultura </li><li> 35 mm prato de plástico para tripsina incubação </li><li> Meio L15 contendo 10% de soro fetal bovino </li><li> Solução de tripsina / EDTA a 0,25% </li><li> Sigmacoted dicas gel de carregamento para a dispersão </li><li> Placas de Petri de plástico contendo meio E3 sem azul de metileno. </li></ol></li><li> Cubra a assadeira de imagens com fundo de vidro com substrato Fibronectin1 (10 mg / ml em PBS). Deixe prato no banco para cobrir durante a dissecção. </li><li> Use estereoscópio com filtros de fluorescência apropriadas para identificar e embriões transgênicos tipo positivos (fase 5-8 somite). <ol><li> Identificar os embriões transgénicos por análise de mesoderme presomitic (PSM) para expressão YFP sob canal de fluorescência (Figura 1A). Fluorescência shoULD ser visível na região desde o último somite formada para o tailbud. Selecione embriões com sinal mais brilhante; 25% de descendência devem ser embriões portadores homozigóticos 2 cópias do transgene. O número de embriões identificados necessário varia de acordo com a experiência. Um pedaço tailbud dissecados produzirá 1.000 células, em média. Normalmente, alguns embriões positivos adicionais são úteis no caso são feitos erros durante a dissecção. </li><li> Use luz transmitida como uma referência de posicionamento para distinguir qualquer autofluorescência, particularmente na gema de célula, a partir do sinal. </li><li> Transferência de embriões positivos para uma placa de Petri contendo meio de plástico separado E3 sem azul de metileno. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissecção e Dispersão <ol><li> Prepare embriões para dissecção. <ol><li> Sob um microscópio de dissecação, usando uma pinça fina, retire cuidadosamente o córion de cada embrião no meio E3. Cuidado para não danificar o embrião ou interromper o celular gema. </li&gt; <li> Encha Sylgard revestido dissecando prato com meio L15 com soro. Utilizando uma pinça ou outra ferramenta plana, remova as bolhas de ar da superfície do Sylgard. </li><li> Transferência de embriões dechorionated utilizar o vidro pipeta-fogo polido para o prato dissecção. </li><li> Usando as ferramentas de arame, mover todos os embriões para um lado do prato de dissecação. </li></ol></li><li> Dissecar PSM a partir de um único embrião. <ol><li> Orientar um único embrião no seu lado lateral, na pequena bem feito na camada de Sylgard dentro do prato de dissecação (Figura 1B). </li><li> Usando o micro-bisturi, fatia através do embrião e das células gema apenas anterior ao cérebro posterior e pelo pólo ventral do embrião (Figura 1B, pontilhada linha vermelha). </li><li> Retire a peça anterior do embrião a partir do bem, transferindo-o para o lado do prato, e, em seguida, usar as ferramentas de arame para raspar restantes grânulos celulares gema da seção posterior, incluindo o PSM. </li><li>Uma vez que a gema tem sido raspado, achatar e orientar o PSM com a extremidade anterior que aponta para longe do experimentador e posterior que aponta para o experimentador (Figura 1C). </li><li> Se a fina camada de ectoderma não tem puxado para fora por este ponto, use as ferramentas de arame para descascá-lo longe do topo do tecido PSM. </li><li> Usando o micro-corte do bisturi tailbud, a ponta mais posterior da PSM para além da extremidade da notocorda, afastado do resto do tecido (Figura 1C, linha pontilhada vermelha). NOTA: outros pedaços de tecido a partir do PSM, para o PSM exemplo anterior mais perto do último somito formado, pode também ser feita em cultura, dependendo da questão experimental. </li><li> Mova a peça tailbud para um canto do prato longe da área de dissecação. Use as ferramentas de arame para limpar todos os detritos e tecido embrião indesejado do campo de dissecação. </li><li> Repita com a próxima embrião. </li></ol></li><li> Peças Piscina tailbud de múltiplas embryos, dependendo do número de células vai ser necessária para o ensaio. Em média, um único pedaço de tecido tailbud rende 1.000 células. </li><li> Encha vazio de 35 mm de prato plástico com um pequeno volume de tripsina-EDTA. </li><li> Utilizar o vidro pipeta-fogo polido, transferir peças tailbud de dissecar prato em prato contendo tripsina / EDTA. Incubar peças tailbud em tripsina / EDTA durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto o tecido está a ser incubado em tripsina, remover a solução Fibronectin1 da imagiologia prato de fundo de vidro. <ol><li> Lava-se a solução de vidro 3 vezes com água MilliQ. Use sucção para remover cada lavagem e garantir o prato esteja completamente seco. </li></ol></li><li> Dispersar peças tailbud em meio para a imagem latente. <ol><li> Pipetar 100 mL de meio L15 com soro em imagens prato. </li><li> Utilizando uma ponta de gel revestida, remover os pedaços tailbud de tripsina / EDTA em que um volume pequeno quanto possível. </li><li> Pipetar as peças tailbud para o meio noprato de imagem. Pipetar as peças para cima e para baixo várias vezes para separá-las e suspender as células no meio. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar. Verifique a existência de aglomerados de células ao microscópio e dispersar mais, conforme necessário. </li><li> Permitir que as células dispersas na suspensão assente em cima do vidro Fibronectin1 revestido durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Adicionar um volume pequeno de meio L15 adicional com soro para as células antes do início de imagem. Tenha cuidado para não perturbar as células resolvido. </li><li> Dada a questão experimental, adicionar qualquer suplemento ou tratamentos com drogas para a cultura. </li></ol> 3. Imagem latente de células dispersas PSM <ol><li> Configure imagem prato em câmara de temperatura na imagem microscópio time-lapse. Definir Warner câmara até à temperatura desejada para a experiência. Permitir prato a equilibrar durante pelo menos 30 min antes de iniciar a aquisição de imagem. Temperatura Crosscheck com sonda de temperatura externa colocada no prato, se necessário. NOTA: Devido aa relação entre a temperatura ea taxa de somitogenesis 21 controle de temperatura estável é essencial para medições precisas de período em células PSM individuais. </li><li> Adquirir imagens de teste do canal de fluorescência para verificar que o tempo de exposição e ganho de fornecer uma grande gama dinâmica das intensidades, sem saturação para assegurar um bom sinal de níveis de ruído. A imagem típica fluorescência adquiridos a partir de células dispersas gerados a partir de nossas linhas usando este protocolo requer 400 ms e 40 ms para uma imagem de luz transmitida com uma câmera EMCCD operando com um ganho EM de 85. Além disso, o ganho de pré-amplificador e velocidade de leitura do câmera também são essenciais para maximizar o sinal sobre o ruído. </li><li> Usando o canal de luz transmitida, escolher campos de células para a aquisição de lapso de tempo. </li><li> Executar protocolo de aquisição de lapso de tempo para período de tempo desejado. <ol><li> Adquirir uma imagem de fluorescência por um campo de luz transmitida e. NOTA: Defina um intervalo entre ro de aquisiçãounds que irá capturar dinâmica temporal sem foto-branqueamento sobre imagem ampliada ou toxicidade induzindo nas células. Este protocolo utiliza um intervalo de 2 min. </li></ol></li><li> Verifique lapso de tempo set-up de vez em quando durante a gravação para garantir que as células permanecem em foco, nenhum software ou hardware erros, etc </li></ol> 4. Processamento de Imagens de Adquiridas Time-lapse Filmes <ol><li> Abrir arquivo de filme para um campo adquirida em um software de processamento de imagem. NOTA: Fiji foi usado para todo o processamento neste protocolo. <ol><li> Dividir transmitida quadros de luz e de fluorescência de um campo para criar 2 pilhas de imagens. </li></ol></li><li> Acompanhe uma única célula no canal de luz transmitida. <ol><li> Coloque um ROI circular (região de interesse) em torno da célula selecionada no primeiro quadro no canal de luz transmitida. NOTA:.. Apenas as células que são saudáveis ​​1 no final da gravação, 2 não se mover para fora do campo, e 3 não entram em contacto com a outra ce.lls são rastreadas. </li><li> Salvar um ROI cada poucos quadros para o gerente de ROI. Acompanhe célula até que o último quadro. </li></ol></li><li> Medir a intensidade usando os ROIs salvos no canal de fluorescência. <ol><li> Selecione a pilha de fluorescência e com o ROIs salvo, use o círculo personalizado interpolador plug-in e macro para medir a intensidade da célula monitorado ao longo do tempo. </li><li> Confira o traço saída da macro. Se o traço qualitativamente captura características da fluorescência de lapso de tempo, exportar os valores para uma planilha do Excel. </li><li> Salvar a lista de ROI para a célula. </li></ol></li><li> Repita rastreamento no canal transmitido e medir no canal de fluorescência para outras células no campo. </li><li> Repita todas as etapas para campos adicionais do experimento. </li></ol>

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Autor Contribuições: ABW desenvolveu e refinou a dispersão, cultura, imagem e protocolos de rastreamento de celular. DS gerou as linhagens transgênicas e supervisionou o projeto do microscópio de fluorescência de lapso de tempo utilizado neste protocolo. AO pioneira iniciais experimentos de prova de princípio para dissociar e células imagem PSM em cultura. JS escreveu a ferramenta plugin do círculo interpolador em Fiji usado para medir a intensidade de fluorescência de filmes de lapso de tempo. ABW e ACO escreveu o manuscrito.

Para estudar um processo celular que ocorre ao longo do desenvolvimento embrionário, os biólogos normalmente utilizam uma abordagem no contexto de todo o embrião. No entanto, para entender completamente como uma única célula se comporta dentro de um período de desenvolvimento, um método para examinar e perturbar as células individuais em isolamento também é altamente benéfico. Ao gerar culturas de células dispersas PSM usando embriões de peixes-zebra transgénicos agora temos uma ferramenta para estudar diretamente a natureza autônoma da célula de oscilações genéticas no relógio da segmentação de uma forma quantitativa. É possível medir a dinâmica das oscilações no nosso repórter fluorescente em centenas de células sob uma variedade de condições. O período observado de células isoladas em cultura é mais longo do que o período somitogenesis no embrião intacto. Observa-se que um explante PSM intactas em cultura também apresenta oscilações mais lentas do que o embrião intacta (dados não apresentados), sugerindo that o período de tempo observado em células isoladas não é simplesmente devido a danos causados ​​por dispersão. Um período variável e amplitude é observado na maior parte de nossa série de tempo de uma única célula. A fonte dessa variabilidade é desconhecida, mas deve revelar detalhes importantes sobre circuitos de ritmo fazendo do relógio da segmentação. Com esse método, podemos estudar os componentes genéticos de segmentação no nível celular e dirigir perguntas que são um desafio para examinar em todo o embrião. Por exemplo, por adição controlada de moléculas sinalizadoras conhecidas encontradas no embrião em desenvolvimento para as culturas, pode-se examinar os efeitos sobre o único oscilador celular PSM em um ensaio robusto e reprodutível. Nosso sistema de cultura PSM abre a porta a uma rigorosa avaliação de quais os fatores que, isoladamente ou em combinação promover oscilações nessas células, quais os fatores que inibem essas oscilações, e para testar a interação entre essas moléculas. Com essas ferramentas em mãos, pretendemosavaliar os modelos existentes das somitogénese que são baseadas em dados de nível de tecido publicados, assim como os resultados de utilização em células individuais para gerar previsões que podem ser testadas em todo o embrião. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro protocolo de cultura de células primárias de peixe-zebra para a gravação de lapso de tempo aguda de fluorescência em células individuais; maior desenvolvimento e refinamento deste protocolo é sem dúvida possível. Outros protocolos usam frequentemente embriões de peixes-zebra para gerar linhas celulares estáveis, que podem ser transfectadas com os repórteres e utilizados para imagiologia de longo prazo 27-29. Enquanto linhas estáveis ​​são úteis para a imagem de um processo que não está vinculado ao tempo de desenvolvimento, como o relógio circadiano, a questão da segmentação embrionária requer imagiologia imediato, enquanto as células ainda estão em sua oscilatório, estado progenitor. Uma vez que as células param de oscilação, que assumem um destino celular diferenciada, e quando no tecido, poderá ser incorporado em um somito. É possible que com o fator ou fatores presentes in vitro direito poderíamos gerar PSM-como linhas de peixe-zebra de cultura de células que permanecem oscilatório, permitindo significativamente observações de longo prazo, vários perturbações seqüenciais, ou high-throughput screening. Espera-se que este método de preparação de culturas primárias de células dispersas para imagiologia de lapso de tempo é bem apropriado para o estudo de qualquer processo celular que ocorre dentro de um período de desenvolvimento que não é acessível através de linhas celulares estáveis ​​de peixe-zebra. O isolamento de células-tipos distintos em estágios de desenvolvimento diferentes das linhas repórter transgênicos apropriadas, quer através de dissecação ou através FACS após dissociação embrionário, poderiam fornecer as células iniciais. Alguns otimização das condições de cultivo, guiados pela origem embrionária das células, pode ser necessária. Ao combinar este protocolo flexível e sensível, com o rápido crescimento da coleção de peixes-zebra transgénicoslinhas, esperamos facilitar uma abordagem de desenvolvimento in vitro biologia que é complementar aos métodos genéticos e embriológicas clássicas.

A formação contínua de segmentos ao longo do eixo do corpo de vertebrados, ou somitogénese, é uma evidência de um oscilador espacial e temporal no embrião em desenvolvimento. O mecanismo favorecido controlando somitogenesis é conceitualmente descrito por um &quot;relógio e frente de onda&quot; modelo 1, em que o &quot;relógio&quot;, que consiste de osciladores celulares, agora pensado para ser intracelularmente impulsionada pela expressão rítmica de um conjunto de genes cíclicos 2, carrapatos fora da formação de somitos a partir da mesoderme presomitic (PSM). À medida que o embrião se desenvolve, um amadurecimento &quot;de frente de onda&quot; na PSM se move em conjunto com o tecido regredir para a parte posterior, retardando e prendendo osciladores celulares que passa 3. Em conjunto, este sistema espaçotemporalmente dinâmico é denominado o relógio da segmentação. As abordagens atuais para estudar o relógio período segmentação três níveis crescentes de organização do oscilador genético em células individuais a dia acoplamento locaisa ocorrer entre células e, finalmente, a regulação global da informação posicional no tecido PSM coletiva 4. Estudos anteriores sugerem que a célula-autônoma segmentação oscilador no peixe-zebra é composto de genes e produtos de proteína do her / hes transcrição factorfamily, que são pensados ​​para formar um loop de feedback negativo através da repressão transcricional 5-7. A via de sinalização Delta / Notch sincroniza oscilações entre células vizinhas e regula o período colectiva da população 8-10. Moléculas fgf sinalização produzidas na tailbud aparecem para construir um gradiente entre os PSM do peixe-zebra, e são, assim, a hipótese de contribuir para abrandar e prendendo as células que oscilam na face anterior 11. Até agora, os papéis funcionais de cada uma destas moléculas em somitogénese foram investigados por mutação genética, injecção morfolino, choque térmico sobre-expressão, e antagonista trea drogatamento de componentes de relógio e de sinalização entre as células 5,7,10,12. Usando estas perturbações, função relógio da segmentação foi inferida a partir de descrições de nível de tecido de defeitos somito ea perda de oscilações uniformes na expressão de genes cíclicos como HER1, her7 e delta C. No entanto, quase todos estes dados são a partir de embriões fixas e não conseguem captar com precisão as mudanças que são inerentes à função dinâmica do relógio da segmentação. Mais recentemente, de vários embriões de lapso de tempo de imagem revelou os primeiros mutantes com período oscilador alterada, mas essas observações também foram feitas no nível do tecido 7,13. Assim, não foi observado o comportamento do oscilador de células-autônoma hipótese durante somitogenesis. Instantâneos estáticos de somitogenesis dar uma imagem incompleta, porque, por natureza, o processo é conduzido por um sistema oscilatório. Trabalhos anteriores em células de camundongo e de bico mostrou que os níveis de transcriçãoe aumento de proteína e cair, mas a amostragem uma oscilação de aproximadamente 2 horas a cada 30 ou 45 min necessariamente restringe os dados coletados e, portanto, as conclusões que podem ser extraídas 14,15. Estudo de outros osciladores biológicos, principalmente, relógios circadianos, afastou-se das medições encenadas de expressão gênica e protéica de monitoramento em tempo real usando fluorescente e repórteres bioluminescentes 16,17. Estas ferramentas são essenciais para demonstrar propriedades de clock de 18 células individuais. Um repórter bioluminescente do gene cíclico HES1 foi desenvolvido e brevemente caracterizado nas células do rato PSM individuais 19. O período médio e variação foram calculados para um pequeno número de células, que mostra que as oscilações persistir durante vários ciclos in vitro. No entanto, esses estudos não quantitativamente abordar a estabilidade e robustez da freqüência de oscilação e amplitude, se as células podem entrar espontaneamente ou oscilações de saída,e como as células mantêm as suas relações de fase. Além disso, os efeitos de moléculas de sinalização encontrados no embrião no relógio célula-autónoma não foram directamente testados. Por conseguinte, estas propriedades fundamentais do oscilador de célula única permanecem completamente desconhecido. Recentemente, desenvolveu linhas de peixes transgênicos utilizando BAC recombineering 20 para dirigir Venus (YFP) repórteres de fluorescência de expressão HER1 30. Tais linhas explorar as pistas de regulação do locus cromossômico intacto em que estão inseridas e recapitular a dinâmica temporal e padrão espacial de HER1. Esta descoberta permite o monitoramento em tempo real da expressão do gene no embrião de peixe-zebra desenvolvimento in vivo. Para estudar as propriedades fundamentais das oscilações celulares-autônoma e como tal expressão é regulada ao longo do tempo, que recentemente desenvolveu um método confiável para isolar e gravar a partir de células PSM in vitro. Este protocol descreve como nós utilizamos nossas linhas repórter transgênicos para gerar culturas de células dispersas, a partir do qual podemos caracterizar as oscilações do relógio da segmentação zebrafish em células individuais. Podemos, assim, resolver questões pendentes no campo que não eram acessíveis com a análise de nível de tecido ou estática, bem como manipular diretamente o relógio da segmentação no nível de uma única célula com moléculas de sinalização e inibidores.

<table><tbody><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>Model: SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>X-cite Illumination</td><td>Series: 120Q</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>Model: SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps no. 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Glass transfer pipettes</td><td>Assistent</td><td>567/2</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic petri dishes</td><td>Greiner</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plastic petri dishes</td><td>Greiner</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard polymer</td><td>SASCO</td><td>266727</td><td></td></tr><tr><td>Manipulation tools</td><td>Made in-house</td><td></td><td>For description of manipulation tools Ref. 22</td></tr><tr><td>Microsurgical knife</td><td>World Precision Instruments</td><td>500249</td><td></td></tr><tr><td>L15 medium</td><td>Invitrogen</td><td>57322</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomyocin</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>257322</td><td></td></tr><tr><td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>253188</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>254589</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette set</td><td>Gilson International</td><td>F167300</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td><td>MPI-CBG protein facility</td><td></td><td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td></tr><tr><td>Glass bottom imaging dishes</td><td>Mattek (single well)</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom imaging dishes</td><td>Greiner (CellView -multi-well)</td><td>262502</td><td></td></tr><tr><td>E3 medium without methylene blue</td><td>Made in-house</td><td></td><td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes</td><td>Ratiolab</td><td>260011</td><td></td></tr><tr><td>Warner heating/cooling chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B/344B</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD camera</td><td>Andor</td><td>Model: iXOn 888</td><td></td></tr><tr><td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td><td>Zeiss</td><td>Model: Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td><td></td><td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td><td></td></tr><tr><td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td><td>Lumencor Light Engine</td><td>Model: Spectra X</td><td></td></tr><tr><td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td><td>BrightLine HC 575/15</td><td>F39-575</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

A segmentação é um processo morfogenético periódica e sequencial em vertebrados. Esta formação rítmica de blocos de tecido chamados somitos ao longo do eixo do corpo é a evidência de um oscilador genético padronização do embrião em desenvolvimento. No peixe-zebra, o relógio intracelular segmentação de condução é composta por membros da família de fator de transcrição Ela / Ele é organizado em ciclos de feedback negativo. Geramos linhas recentemente repórter fluorescentes transgénicos para o gene de HER1 cíclico que recapitular o padrão espacio-temporal de oscilações na mesoderme presomitic (PSM). Utilizando estas linhas, foi desenvolvido um sistema de cultura in vitro que permite a análise em tempo real do relógio oscilações de segmentação, dentro de células de PSM individuais isolados. Ao remover o tecido PSM de embriões transgênicos e dispersar as células de oscilação regiões em placas com fundo de vidro, geramos culturas apropriadas para lapso de tempo de imagem de sinal de fluorescência decélulas-relógio individual. Esta abordagem fornece uma estrutura experimental e conceitual para a manipulação direta do relógio da segmentação, com resolução de uma única célula sem precedentes, permitindo que suas propriedades de células-autônoma e em nível de tecido a ser distinguido e dissecados.

Este protocolo produz culturas de células, dispersos, PSM únicos viáveis ​​para lapso de tempo de imagem de sinal de fluorescência (Figura 2). Nossa transgene gera um repórter cujo ciclo de produção e degradação ocorre com dinâmica semelhante ao do gene endógeno de proteína e no embrião, no fim de meia hora. Devido ao seu volume de negócios rápido, o sinal YFP em células individuais devem ser detectados rapidamente para minimizar branqueamento e com uma resolução temporal alta para capturar as características de cada ciclo oscilatório. Além disso, dada a imprecisão relativa do sinal, as condições de cultura e de aquisição ter sido cuidadosamente ajustada para assegurar resultados sensíveis e robustos. Nós encontramos os seguintes fatores a ser importantes na geração de culturas de células ótimas PSM para a imagem: 1. Um substrato ECM usado para o revestimento das placas de cultura com fundo de vidro. 2. Adição de soro para a dissecção e meio de imagem. 3. Dissecção do PSM de embriões identificados tomadas após o acasalamento hetepares rozygous, cuja descendência potencialmente levar 2 cópias do transgene. 4. Aquisição de imagens dentro de uma gama de ampliação óptima, utilizando uma objectiva de maior NA para assegurar a captura eficiente do sinal de fluorescência. 5. Iluminação com uma fonte de luz de estado sólido para minimizar flutuações de intensidade que possam contribuir para o ruído de fundo. 6. Detecção de sinal com uma câmara de alta sensibilidade EM-CCD para maximizar o sinal de leitura. Culturas sub-óptimas irão conter células que não permanecem arredondada e saudável durante a gravação. Colocámos a hipótese de que o substrato de ECM, um fragmento de fibronectin1 zebrafish mantém as células num estado indiferenciado PSM semelhante, em comparação com outros substratos normalmente utilizados como poli-lisina ou laminina. Outros substratos testadas causada células para achatar no vidro e a perda de sinal fluorescente oscilante ao longo da gravação. Nós também descobrimos que a adição de soro para o meio durante a dissecção, dispersãoea gravação foi importante não só para saciar a tripsina usada para dissociação, mas também aumentou a intensidade de fluorescência ao longo do fundo, provavelmente devido à melhoria da viabilidade celular. Para garantir a captação do sinal ideal de células individuais foi utilizada uma objetiva de 40x projetada especificamente para imagens de fluorescência (Zeiss Plano série NeoFluor) com uma NA alto. Descobrimos também que uma fonte de luz de estado sólido, desde a iluminação mais estável do que as lâmpadas de mercúrio tradicionais, o que é fundamental para minimizar as flutuações de fundo que contribuem para imagens ruidosas. Essas modificações são importantes para garantir resultados robustos. Usando este protocolo, esperamos culturas em que a maioria das células de um determinado campo são fluorescentes, em algum momento durante a gravação. Descobrimos que as células fluorescentes normalmente permanecem arredondado e às vezes são bastante móveis durante as gravações. Algumas células, incluindo as células fluorescentes, podem tornar-se apoptótico durante a gravação. Estas células são excluídos de qualquer umnálise. Também excluir as células que entram em contato com outras células ou se mover para fora do campo de visão. Em média, vemos uma redução de 12% no número de células por campo pelo fim da gravação 10 horas tal como medido por contagem do número de células saudáveis ​​no canal de luz transmitida. Esta perda inclui tanto a morte das células e células que foram movidos para fora do campo. Dadas essas ressalvas, podemos, em média, faixa 5 células fluorescentes por campo que permanecem viável e visível, e tipicamente gravar seis campos por condição. Por exemplo, um experimento com 4 condições terá 24 campos de total adquirido e, normalmente, cerca de 30 células rastreadas por condição. Sob condições normais de imagem com meio L15 contendo 10% de soro fetal bovino, descobrimos que as células PSM (n = 101 células de quatro experiências em replicado) pode produzir entre 2 e 7 picos, com a média e o desvio padrão de 3 ± 1 (2 picos ciclos -3). O número de pico média, bem como o percentil 25%, é de 2 picos e o percentil 75% de is três picos. Usando o nosso acompanhamento e análise semi-automatizada, podemos gerar rapidamente intensidade de fluorescência sobre traços de tempo para as células PSM individuais, com um traço representativo célula mostrada na Figura 2C. Estes vestígios matérias pode ser usado para fazer medições quantitativas de propriedades das células PSM oscilatórios, tais como a frequência, a amplitude, o número de ciclos e tempo de picos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Figura 1. Identificação de embriões transgênicos e esquemas de sua dissecção. (A) Vista lateral de um embrião de peixe-zebra transgênico expressando YFP fluorescência em fase ~ 5 somite. Imagem é uma sobreposição de luz transmitida e canal de fluorescência. As setas indicam áreas de sinal a partir da ponta da tailbud, durante todo o PSM, em relação a l<html> ast formado somite. Inset mostra um esquema do transgene repórter (para mais informações sobre o seu desenvolvimento e comportamento in vivo referem-se a 30 Soroldoni et al.. (B) Esquema de vista lateral do embrião antes do primeiro corte durante a dissecção. Pontilhada linha vermelha indica o primeiro corte feitos em toda a parte posterior do cérebro, embora a célula gema apenas atrás do tailbud. (C) Representação esquemática de achatada PSM após a remoção de grânulos de vitelo e camada epidérmica, orientada ao longo do eixo ântero-posterior. pontilhada linha vermelha indica o segundo corte para remover a ponta do tailbud para a dispersão e cultura. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Imagens representativas e os traços de uma única célula em uma cultura PSM dispersa. (A) Montagem de imagens de luz transmitida de uma única célula PSM em uma 6-h de gravação de lapso de tempo. Note-se que a célula permanece arredondada e saudáveis ​​ao longo do curso do registo. (B) correspondente montagem de imagens de fluorescência a partir de uma única célula de PSM. Picos na intensidade da célula são numerados no decurso da gravação. (C) intensidade média ao longo do tempo medido a partir de um ROI colocado nesta célula. Os valores são retirados de cada quadro de um filme com uma taxa de quadros de um por 2 min usando o círculo interpolador plug-in personalizado e macro escrito em Fiji. Picos na intensidade são novamente contados em todo o traçado. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis é um processo de desenvolvimento rítmico que espacialmente padrões do eixo do corpo de embriões vertebrados. Anteriormente, desenvolvemos linhas de zebrafish transgênicos que usam repórteres fluorescentes para observar os genes cíclicos que impulsionam esse processo. Aqui, a cultura dispersas células destas linhas e imagem suas oscilações ao longo do tempo in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K visualizações.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis é um processo de desenvolvimento rítmico que espacialmente padrões do eixo do corpo de embriões vertebrados. Anteriormente, desenvolvemos linhas de zebrafish transgênicos que usam repórteres fluorescentes para observar os genes cíclicos que impulsionam esse processo. Aqui, a cultura dispersas células destas linhas e imagem suas oscilações ao longo do tempo in vitro. 

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Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neurociência

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Biologia do Desenvolvimento

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from the presomitic mesoderm (PSM) as the tail end of the embryo elongates posteriorly. Somites form with regular periodicity and scale in size. Zebrafish is a popular model organism as it is genetically tractable and has transparent embryos that allow for live imaging. Nevertheless, during somitogenesis, fish embryos are wrapped around a large, rounding yolk. This geometry limits live imaging of PSM tissue in zebrafish embryos, particularly at higher resolutions that require a close objective working distance. Here, we present a flattened 3-D tissue culture method for live imaging of zebrafish tail explants. Tail explants mimic intact embryos by displaying a proportional slowdown of axis elongation and shortening of rostrocaudal somite lengths. We are further able to stall axis elongation speed through explant culture. This, for the first time, enables us to untangle the chemical input of signaling gradients from the mechanistic input of axial elongation. In future studies, this method can be combined with a microfluidic setup to allow time-controlled pharmaceutical perturbations or screening of vertebrate segmentation without any drug penetration concerns.

Here, we present the protocol for 3-D tissue culture of the zebrafish posterior body axis, enabling live study of vertebrate segmentation. This explant model provides control over axis elongation, alteration of morphogen sources, and subcellular resolution tissue-level live imaging.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de microscopia de folha de luz multiview refinada para embriões de peixe-zebra

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Estratégias para montagem de embriões de peixe-zebra para microscopia de folha de luz multivisualização de alta resolução - técnicas para imagem

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...