Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD e RW). Estamos gratos ao Euler Thomas (Töbingen, Alemanha) para o software QDS luz estimulação.

A descrição a seguir pressupõe que o pesquisador tem um conhecimento básico da estrutura da retina, patch-clamp de gravação e de microscopia de dois fótons. Para obter informações úteis sobre como estabelecer e executar uma instalação de patch-clamp e dois fótons sistema de imagem veja referências [7-12]. 1. Animal e de preparação dos tecidos <ol><li> Mantenha rato de adaptação ao escuro por pelo menos 3 h. Nesse meio tempo, prepare 1-2 l de solução extracelular consistindo de (em mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 CaCl 2, 1,6 MgCl 2, 25 NaHCO 3, 10 D-glicose e equilibrar-o para pH 7,4 por gás com carbogênio (5% de CO 2 em O 2) em temperatura ambiente. </li> um <li> Euthanize o mouse em uma câmara hermética de CO 2 overdose seguido por deslocamento cervical. Este procedimento e os seguintes passos devem ser realizados na escuridão. Use iluminação de longo comprimento de onda dim (que bloquear comprimentos de onda curtos a partir de uma fonte de luz fria por um 690 nm-longpass filtro) para apoiar a visão pessoal, mantendo os olhos do animal de adaptação ao escuro (ratos só têm má visão na parte vermelha do espectro de luz). Para o trabalho na iluminação completa escuridão usar infravermelho (&gt; 800 nm) e usar óculos de visão noturna. </li><li> Enuclear olhos com um par de tesouras curvas íris e transferi-los para um prato de solução extracelular colocadas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Remover da córnea e do corpo ciliar, abrindo o bulbo do olho ao longo da ora serrata (a fronteira entre a retina eo corpo ciliar) com uma tesoura de mola (nós usamos primeiro uma lanceta para furar um ponto de partida para o corte). Retire a lente e separe cuidadosamente a retina do epitélio pigmentar. Se a orientação da retina é crucial para o seu estudo, indicam que, como na Ref. [12]. Cortar o nervo óptico entre retina e epitélio pigmentar da retina e remover a partir do ocular. Observe a direção das superfícies da retina: o interior da retina enrolado-up é o Ganglion lado célula; o exterior é o lado fotorreceptoras. </li><li> Remover o vítreo da superfície interna da retina, puxando-o fora com o auxílio de um palito de madeira. Para este fim, use um pequeno volume de solução extracelular que apenas cobre a retina. As varas do vítreo para o palito e podem ser arrastados centrifugamente fora da retina. Em seguida, aplique incisões curtas ao longo do perímetro da retina para facilitar o nivelamento do tecido. </li><li> Transferir a retina para dentro da câmara de gravação fotorreceptoras voltada para baixo, estendeu-o no fundo de vidro (usamos um pincel fino) e imobilizá-lo com um quadro de nylon amarrado de aço inoxidável. Prepare a retina segundo da mesma maneira e mantê-lo de adaptação ao escuro em solução extracelular carboxygenated para uso posterior. </li></ol> 2. Gravações <ol><li> Instalar a câmara de gravação na escuridão sob um microscópio a laser na vertical digitalização e superfuse a preparação da retina continuamente (não inferior a 5 ml / min) com solução extracelular carboxygenated aquecida a 35 ° C. O microscópio (também equipado com uma câmera CCD infravermelho-sensível) está situado em um choque de absorção de mesa de ar dentro de uma gaiola de Faraday para eletrônicos de proteção. Cobrir a gaiola com uma cortina não transparente para manter a preparação em trevas. Nós também fora da tela a luz de monitores de computador por película transparente vermelho. </li><li> Ajustar o laser infravermelho para 850-870 nm ou comprimentos de onda maiores, alterne para modo bloqueado condição e utilização de dois fótons de excitação para visualizar células que expressam GFP. Atenuar a saída do laser usando filtros de densidade neutra controlada pelo software de digitalização a laser até um grau que é apenas suficiente para o reconhecimento claro da célula fluorescentes </li><li> Para patch-clamp gravações em grampo atual modo de usar micropipetas de vidro (utilizamos tubos de vidro de borosilicato de 1,5 mm de diâmetro externo e espessura da parede 0,225 mm) preenchidas com solução intracelular consistindo de (em mM) 125 K gluconato, 10 KCl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, titulada para pH 7,4 com KOH (dando uma resistência pipeta de cerca de 5 mohms). Note-se que outras condições experimentais como tensão-clamp gravação requer uma solução diferente. Se injeções de corante são desejados, adicione uma sonda fluorescente (nós usamos 10 mM Alexa Fluor 594) ou uma molécula marcador (3% Neurobiotin). Insira o micropipeta no suporte e certifique-se que o eletrodo de referência (fio de prata clorada) está em contato com a solução extracelular na câmara de gravação. </li><li> Aplicar pressão ao micropipeta e alvo de uma expressando GFP-célula (usamos um de 40 vezes objetiva de imersão em água; NA 1,25). Corpos celulares amácrinas estão situados na camada de células ganglionares (diretamente abaixo da superfície na orientação atual da retina), bem como na parte proximal da camada nuclear interna (cerca de 55-75 mM profundamente dentro da preparação). Antes de micropipeta contato com a célula-alvo, a membrana limitante interna (a bainha feita de glial endfeet) na retinasuperfície tem de ser penetrada. Penetração bem sucedida é reconhecida pela solução intracelular que é expulso da ponta micropipeta e destaca a membrana limitante interna da retina ao tecido subjacente como pode ser observado em uma imagem de transmissão infravermelha capturada pela câmera IR-CCD. </li><li> Abordagem a célula desejada, comparando a posição soma a partir da imagem de dois fótons com a imagem da câmera CCD IR-mostrando a posição da micropipeta de gravação. Note que este passo não é fácil, e exige alguma prática, porque a célula expressando GFP-tem que ser reconhecida na imagem de transmissão infravermelha, a fim de direcionar a micropipeta em direção a ela. Direcionamento correto é alcançado quando a ponta da micropipeta causa ondulações na superfície da célula que pode ser visto na imagem de dois fótons. Alternativa a este procedimento, use um corante fluorescente (por exemplo Alexa Fluor 594, 100 mM) na solução intracelular para revelar a posição micropipeta na imagem de dois fótons. Dois fótons excitação infravermelho permite fluorescência suficiente deste corante para fazer a micropipeta discernível. Para este fim, ajustar o alcance de detecção do software de digitalização a laser para cobrir também a fluorescência vermelha. </li><li> Libertação de pressão da micropipeta e obter uma célula inteira configuração de patch-clamp clamp na corrente de modo. Uma gravação utilizável deve dar um potencial de membrana de -50 a -55 mV e durar pelo menos 20 min. </li><li> Apresentar estímulos visuais criados por um software de estimulação (usamos QDS por Thomas Euler, da Universidade de Tübingen, Alemanha) 11 em um monitor de computador. Ajuste a posição espacial do estímulo a ser centralizado na célula registrados: Mark a posição da célula no monitor que mostra a imagem de transmissão da câmera CCD e IR-centro de um estímulo como o local para ele. Sintonize a intensidade do estímulo através da inserção de filtros de densidade neutra para o caminho do feixe. Para a calibração do espectro monitorar e intensidade ver Ref. [14]. Escolha um prolonged interstimulus intervalo (por exemplo, 15 s) para evitar a adaptação. Incluem um fotodiodo no caminho do feixe de manter registro do tempo de estímulo. </li><li> Iniciar o protocolo de estimulação e gravar as respostas luz (nós usamos uma taxa de amostragem de 10 kHz com filtragem de 5 kHz para não-spiking células; para gravação spike uma maior taxa de amostragem de 20 kHz, como é recomendado). Use o software de estímulo de luz para ativar o software de gravação. </li><li> Para deixar o corante preenchendo difusa agente fluorescente na célula gravada por 30-45 min antes cuidadosamente retração da micropipeta da célula. Tome cuidado para não retirar o corpo da célula. Se o não-traçador fluorescente Neurobiotin foi usado, ele precisa de visualização por ligação a estreptavidina conjugada a um fluoróforo (usamos estreptavidina-Cy3, 1:400 durante a noite a 4 ° C após 20 min paraformaldeído fixação da retina; para a tintura de acoplamento estudos de incubação estreptavidina pode ser prolongado para 3 d). Alternativamente, as injeções também pode ser realizada comeletrodos pontiagudos (&gt; 100 mohms) quando o corante é conduzido para dentro da célula iontophoretically empalado (pulsos retangulares: 0,25-1 nA, 100 ms, intervalo de 100 ms, o tempo total 06/03 min). </li></ol> 3. Resultados representativos: Os seguintes resultados provêm de um estudo sobre um rato que expressam a proteína verde fluorescente (GFP), sob o promotor de tirosina hidroxilase 13,14, a enzima que catalisa a taxa de etapa limitante na síntese de catecolaminas (TH:: GFP mouse). Com base no brilho da GFP sinal de duas populações celulares distintas são distinguíveis (Figura 2A). Células que expressam o nível mais elevado GFP possuem corpos celulares localizados na camada nuclear interna (INL, Figura 2A) ou deslocadas na camada de células ganglionares (GCL, Figura 2B) e estratificar no meio da camada plexiforme interna (IPL, figura 2C) . Eles foram identificados como tipo 2 células 14-16 e poderia ser sistematicamente estudada em relação à morfologia (Figura 3) e elegeratividade rical (Figura 4), ​​embora sua densidade populacional só equivale a 250 células / mm 2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática da instalação experimental. Dois fótons de excitação (caminho da luz vermelha pontilhada) de células que expressam fluoróforo na retina intacta permite visuais segmentação por uma micropipeta (verde caminho emissão de luz). A retina é submetido a estímulos ópticos projetados através do condensador do microscópio (caminho da luz amarela), e as respostas celulares a luz são registradas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> Figura 2. GFP-células que expressam em uma flatmount retina de um TH:: mouse GFP. Duas populações pode ser distinguido pelo brilho da GFP sinal: tipo 1 (células DA) localizada no INL mostrando fluorescência fraca (A, ver pontas de seta) e tipo 2 células intensamente marcadocom corpos celulares tanto no INL (A, ver setas) ou deslocadas na GCL (B) e uma estratificação dendrítica no estrato S3 do IPL (C). Barras de escala, 50 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> Figura 3. Morfologia de uma célula do tipo 2 injetado com o Neurobiotin marcador. O traçador foi posteriormente visualizado por estreptavidina-Cy3 binding (magenta). A micrografia, que também está representando o sinal de GFP (verde), é uma projeção de pilhas de imagens cobrindo o GCL e IPL. Barra de escala, 50 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> Figura 4. Respostas luz de uma célula do tipo 2 localizado na GCL. Padrão de resposta ao branco iluminação de campo total de luz de intensidade crescente na faixa escotópica. Intensidade do estímulo é dado em photoisomerizations por haste por segundo (Rh * / rod / s). Um estímulo prolongado de 3 s foi usado para uma melhor distintosíon dos componentes de resposta no início do estímulo (ON resposta) e offset (OFF resposta).

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Camundongos foram tratados e sacrificados, em conformidade com as diretrizes institucionais para bem-estar animal e as leis em experimentos com animais emitidos pelo governo alemão.

Este método oferece a possibilidade de estudar as propriedades elétricas de neurônios específicos na retina intacta sob orientação visual, sem influenciar a condição de adaptação da retina. É particularmente adequado para a caracterização de células que estão actualmente bastante mal estudada, devido à baixa densidade populacional como a maioria das populações de células amácrinas. Dois fótons excitação permite imagens de alta resolução e alto contraste até mesmo de partes mais profundas do tecido 17, um pré-requisito para uma mira precisa e bem sucedida patch-fixação de células particularmente no INL, com sua alta densidade de corpos celulares. A retina do rato isolada é viável para 3-4 h nas condições experimentais. Se a retina segundo é armazenado em completa escuridão sob gaseamento carbogênio contínua, mantém a cor púrpura do fotopigmento crus e pode ser usado depois de terminar experimentos com a retina em primeiro lugar. No início, visando acélulas selecionado com a micropipeta na wholemount da retina é um pouco desafiador e requer alguma prática, especialmente quando se trabalha na escuridão. Incluindo um corante fluorescente na micropipeta pode simplificar o procedimento, porque celular e micropipeta são visíveis sob dois fótons de excitação, ao mesmo tempo. No entanto, a adição de componentes à solução intracelular podem impedir a formação de gigaseal ou causar a qualidade de gravação a sofrer. Uma vez alcançado com sucesso, uma boa gravação pode durar cerca de 1 h. Considerando que a luz de excitação infravermelho si só é mal absorvido por fotorreceptores da retina, animado células que expressam GFP emite luz na parte visível do espectro. No entanto, fluoróforos está animado apenas em um pequeno volume focal que não é susceptível de alterar a condição de adaptação da retina. Ainda mais excitação, só é necessária para segmentação e pode ser desligado durante a gravação de respostas luz. O usefulness desta abordagem já está demonstrada por estudos em populações específicas de células amácrinas 14,18 a partir do qual as gravações eletrofisiológicas de outra forma teria sido possível apenas por acidente 12. Finalmente, esta poderosa técnica pode ainda ser prorrogado, incluindo uma abordagem farmacológica 14, Ca 2 + 19 ou imagem usando células injetadas para estudos imunocitoquímicos ou microscopia eletrônica. Dessa forma, a posição funcional de um dado tipo de célula no circuito da retina podem ser desvendados.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente / equipamentos de </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> Óculos de visão noturna </td><td> Gutzeit GmbH, Warthausen, Alemanha </td><td> Xtron F1 </td><td> inclui uma fonte de luz 800 nm </td></tr><tr><td> Filtro óptico </td><td> Schott, Mainz, Alemanha </td><td> RG9 </td><td> longpass filtro com corte em 690 nm </td></tr><tr><td> Iris tesoura </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 14061-09 </td><td> curvo com 22 milímetros de lâmina </td></tr><tr><td> Tesoura primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15000-00 </td><td> em linha reta com 3 milímetros de lâmina </td></tr><tr><td> Câmara de gravação </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Alemanha </td><td> 200-100 500 0180 Tipo A (CT) </td><td> Teflon câmara com fundo montado lamínula de vidro (aprox. 0,15 mm; n º 2-100 500 0182) </td></tr><tr><td> Aquecedor de fluxo </td><td> Sistemas de multicanal, Reutlingen, Alemanha </td><td> PH01, TC01 </td><td> cânula de perfusão aquecido com a temperatura scontrolador de Ensor e temperatura </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser </td><td> Leica Microsystems </td><td> DM LFS </td><td> controlada pelo Software Leica Confocal </td></tr><tr><td> Air tabela </td><td> Newport </td><td> VH 3036W-OPT </td><td></td></tr><tr><td> Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td></td><td> Modo bloqueado tsunami Ti: safira de laser </td></tr><tr><td> CCD da câmera </td><td> pco AG, Kelheim, Alemanha </td><td> PixelFly QE </td><td> incluindo software de controle </td></tr><tr><td> Micropipeta capilares de vidro </td><td> Hilgenberg, Malsfeld, Alemanha </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-20004 </td><td> corante fluorescente </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC-SP-1120-M050 </td><td> não traçador fluorescente </td></tr><tr><td> Estreptavidina-Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Luigs &amp; Neumann GmbH, Ratingen, Alemanha </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> motorizada Mini25 unidade manipulador com display SM-5 </td></tr><tr><td> Amplificador de patch-clamp </td><td> npi electronic GmbH, Tamm, Alemanha </td><td> SEC-05LX npi </td><td></td></tr><tr><td> Digitizer </td><td> National Instruments </td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td> De aquisição de dados software WinWCP </td><td> John Dempster, University of Scotland, Glasgow, Reino Unido </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS gerador de estímulo visual </td><td> Thomas Euler, da Universidade de Tübingen, Alemanha </td><td></td><td> tem que ser operado em um computador separado controlar dois monitores (interface do usuário, estímulo monitor) </td></tr><tr><td> Os filtros de densidade neutra </td><td> ITOS, Mainz, Alemanha </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

Estudar as propriedades fisiológicas e conexões sinápticas de neurônios específicos no tecido intacto é um desafio para as células que evidente falta características morfológicas ou mostrar uma baixa densidade populacional. Isso vale principalmente para células amácrinas da retina, uma classe de interneurônios excepcionalmente multiformes que compõem cerca de 30 subtipos em mamíferos 1. Apesar de ser uma parte crucial do processamento visual, moldando a saída da retina 2, a maioria desses subtipos não foram estudadas até agora em um contexto funcional, pois encontrar essas células com um eletrodo de gravação é um evento raro. Recentemente, uma infinidade de linhas de camundongo transgênico que está disponível marcadores fluorescentes expressar como a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle de promotores de receptores de membrana ou enzimas que são específicos para apenas um subconjunto de neurônios em um dado tecido 3,4. Estas células pré-rotulados são, portanto, accessible para microeletrodo dirigido segmentação sob controle microscópico, permitindo o estudo sistemático de suas propriedades fisiológicas in situ. No entanto, a excitação de marcadores fluorescentes é acompanhada pelo risco de fototoxicidade para o tecido vivo. Na retina, esta abordagem é adicionalmente prejudicada pelo problema que a luz de excitação faz com que a estimulação adequada dos fotorreceptores, assim, infligir fotopigmento branqueamento e transferência dos circuitos da retina em uma condição de luz adaptado. Estas desvantagens são superadas usando excitação infravermelho entregue por um mode-locked laser em pulsos curtos da faixa de femtossegundos. Excitação de dois fotões fornece energia suficiente para a excitação fluoróforo e, ao mesmo tempo restringe a excitação a um pequeno volume de tecido a minimização dos perigos de photodamage 5. Além disso, ele deixa a retina sensíveis aos estímulos visuais desde a luz infravermelha (&gt; 850 nm) só é mal absorvido pelo fotopigmentos 6. em gravações situ de células que expressam GFP que são visualmente alvo de dois fótons excitação. A retina é preparada e mantida no escuro e pode ser submetido a estímulos ópticos, que são projetadas através do condensador do microscópio (Figura 1). Patch-clamp gravação de respostas a luz pode ser combinado com a tintura de enchimento para revelar a morfologia e para verificar se há corante gap-junction mediada acoplamento para as células vizinhas, de modo que a célula-alvo pode por estudadas em diferentes níveis experimental.

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Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K visualizações.  University of Oldenburg. Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Vídeo: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Biologia do Desenvolvimento

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologia

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Avaliação da atividade do cálcio na camada de células ganglionares da retina

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Autor em destaque: uma abordagem inovadora para estimulação elétrica neural usando imagens de cálcio 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...