Este trabalho foi financiado por um RO1 de NIH e Comentários Mérito do Serviço de Pesquisa do VA de C.-MT, e um NRSA individuais para CWL

Considerações gerais de projeto Se o comprimento de onda de estimulação foto está na faixa do visível, como para experiências optogenetic, o layout do sistema será consideravelmente mais simples do que para os experimentos de fotólise UV. Um só precisa comprar um módulo de porta dupla câmara que está disponível a partir de todas as empresas microscópio. O avião DMD pode ser posicionado no plano da imagem conjugada de qualquer uma das duas portas da câmara. Mas, na fotólise UV a luz proveniente da DMD devem ser levados em pelo caminho epi-iluminação (Fig. 3A), porque a lente do tubo de imagem de liderança para a câmera não for corrigido para comprimento de onda UV em qualquer um dos microscópios comercialmente disponíveis. A aberração esférica da lente do tubo de imagem em 350 nm é grave o suficiente para impedir a capacidade de focalizar a luz para um local apertado e gerar resolução espacial suficiente. Este problema não é encontrado em microscopia confocal porque a lente do tubo é removido quando um feixe de laser colimado é trazido ao longo do mesmo eixo óptico. O problema da iluminação UV pode ser resolvido por trazer à luz através do caminho epi-fluorescente porque as lentes do tubo existem todos os parcialmente corrigida para aberração esférica no comprimento de onda UV. Podemos expandir a ótica dos microscópios em qualquer grau, os desejos do jornal. A comunidade científica é, em geral, interessados ​​rápida neste tópico e não há muitas fontes que ensina-lo bem. A fim de minimizar modificações do microscópio e devido a restrições de espaço apertado na unidade de epi-fluorescência, a DMD é colocado em um plano de imagem recém-criada conjugado criado por uma lente relay (ponto a posição da unidade de DMD em relação ao microscópio). A UV comercial corrigido lente relay foi comprado (Optics Especialidade) (ponto-a no diagrama e no microscópio). Iluminação da DMD Ao receber a sua entrada binária um micromirror pode alternar entre um positivo e um negativo 12 ° de inclinação em relação ao plano do chip. O eixo de rotação é ao longo da diagonal cantos de cada espelho (45 ° para os lados do chip). A orientação da rotação do espelho é designado por um triângulo dourado em um canto na superfície frontal do chip. O ângulo de inclinação dos microespelhos dita o alinhamento do campo e azithmus do feixe de iluminação de entrada. A afinação do feixe de iluminação precisa ser 24 ° do eixo perpendicular do chip DMD e necessidades azithmus ser perpendicular ao eixo de rotação do espelho. Alinhamento do feixe preciso é fundamental para uma operação eficiente. No sistema protótipo nós projetamos múltiplos ajustes de inclinação manual que nos permitiu corrigir inadequações de projeto e usinagem. Isto resultou em um sistema que é consideravelmente mais volumoso do que o necessário. Arranjo, alternativo mais compacto para trazer à luz é possível (show projeto alternativo, se for considerado útil). Para experimentos de fotólise uma fonte de laser é necessária para gerar o feixe de alta intensidade de luz focada necessários para uncaging rápida. Para experimentos optogenetic onde a luz de alta intensidade focalizados não é necessária, uma fonte de luz não coerente seria adequada. No experimento descrito aqui fotólise empregados um diodo semi-contínua bombeado de estado sólido (DPSS) freqüência triplicou NdVO4 laser (1 W, 355 nm). (Para uma discussão detalhada sobre as opções de fontes de luz para fotólise ver referência 2). Um laser de potência relativamente alta é necessário nos experimentos descritos aqui porque apenas uma pequena fração da saída do laser é efectivamente entregue ao espécime quando se utiliza um sistema de DMD. A quantidade de luz entregues ao modelo é proporcional à razão entre o número de ON / OFF espelhos na região iluminada pelo feixe de laser. Se uma fonte de luz laser é necessário, é melhor para lançar a saída do laser em uma fibra multimodo para que ele possa ser facilmente posição e orientada ao longo do eixo correto para iluminar a DMD. Transmissão da luz através da fibra óptica resolve um segundo problema, como eliminar os padrões speckle inerentes à iluminação coerente. A fibra é enrolada em torno de uma maca de fibra piezoelétrico (modelo 915, Instrumentação Canadian &amp; Research, Ltd), que oscila em ~ 40 kHz. (Ponto estas no rig) O microscópicas alongamento da fibra é suficiente para move o speckle pattern muitas vezes durante a duração de cada pulso milissegundos foto estimulação, assim, efetivamente eliminando o efeito de manchas. A saída da fibra óptica é então colimados com uma objetiva de microscópio UV (Olympus DApo20UV). (Apontar isso) A calibração da resolução óptica do sistema é mostrado na figura. 3B. A resolução efetiva fisiológica medida pela amplitude do fluxo de corrente em função da posição do local da fotoestimulação é mostrado na figura. 3C. Respostas atual para fotoestimulação de diferentes intensidades são ilustrados na fig. 3D. Funcionamento do sistema: Co-registro do pixels CCD com os espelhos DMD Um software in-house foi escrito que determina a correspondência de cada um dos espelhos DMD para pixels específicos da câmera CCD de imagem. O usuário interface gráfica (GUI) dentro deste software, permite que o usuário atribua os espelhos DMD que corresponde à região na imagem CCD marcados pelo mouse. Assim, o local para a estimulação da foto pode ser marcado simplesmente movendo o cursor sobre a imagem exibida na tela do computador e clicar na região com a tag de interesse. (A imagem fluorescente de um mandril dendríticas será exibido na tela do computador. Student vai marcar um número de posições sobre a imagem na tela do computador.) Programação dos padrões para a entrega de luz O padrão marcado na tela do computador pelo operador é armazenado como uma série de imagens separadas. O tempo dos pulsos de laser para cada padrão espacial é então programado para o software que está integrado com os dados do programa de aquisição (pClamp). (Demonstrar isso). Coordenar os pulsos de laser para os padrões de DMD O programa de aquisição de dados inicia e coordena o tempo da eletrônica DMD, a propagação do laser, ea aquisição do patch preso sinal elétrico do neurônio alvo. (Simular esta seqüência no computador) Dados experimentais: Não-linear através de somatório distal pontos de ramificação dendríticas Integração dendríticas com eletrodos tem sido tradicionalmente realizado através da variação da amplitude da estimulação em locais discretos, em vez de expandir a área de estimulação, mantendo uma intensidade constante. Questões relacionadas com a saturação do eletrogênese e recrutamento de canais dependentes da localização pode influenciar o resultado e conclusão. Distribuídos estimulação dendríticas pode ser facilmente implementado usando um sistema baseado DMD (Fig. 4A). Intensidade de entrada foi variado, aumentando o número de pontos de fotoestimulação. Podemos ver que soma espacial pode ser não-linear ao longo pontos de ramificação cada vez mais supra-linear, com amplitudes de entrada aumentando chegando em dois ramos filha. O supra-linearidade é largamente mediada receptores NMDA e não a tensão de canais fechados (Fig. 5) Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Operação da microespelhos na DMD. (Vista lateral) forças eletrostáticas dirigida a espelhos individuais causam o espelho para ser inclinado em uma das duas orientações possíveis 12 ° da horizontal. Na posição ON um feixe incidente é direcionado ao longo do eixo óptico perpendicular do chip. Na posição OFF o feixe incidente é direcionado 48 ° fora do eixo. Luz que atinge as lacunas fina entre os espelhos é direcionado 24 ° fora do eixo. (Vista de cima) a inclinação é orientada 45 ° com relação aos lados dos espelhos e chip. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Arranjo básico de um microscópio fluorescente moderna. O cubo de filtro está posicionado no &quot;espaço infinito&quot; entre o objetivo ea lente do tubo. Há um caminho que leva a imagem da câmera e não há um caminho de iluminação que traz a luz para a amostra. A lente do tubo para estas caminho da luz dois são tipicamente diferentes no projeto e no comprimento focal. A iluminação, mas não a imagem, lente do tubo é projetado para operação no espectro UV. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Layout para sistema baseado UV DMD. Se a iluminação está no espectro UV, então ele deve ser trazido através da lente do tubo que é corrigida por UV. A lente do tubo no caminho de imagem não é projetada para UV. Um sistema de revezamento é necessária para criar um plano de imagem facilmente acessível conjugado. Os planos diferentes de conjugado imagem no microscópio é marcada por linhas pontilhadas vermelhas. Padrões brilhantes em um plano de imagem são projetadas em planos conjugados outros. Durante a gravação do padrão no plano da amostra é projetada sobre o detector / câmera. Para a iluminação do padrão gerado pela DMD é projetada na amostra. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Layout para sistema de projeção de luz visível DMD. Se a luz de iluminação é na faixa do visível, é possível trazer o padrão de luz DMD gerado através do caminho da luz de imagem. Isso pode ser facilmente implementado com commercial câmera dupla anexos porta eo espelho apropriado dicróicas. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Resolução lateral do sistema. (A) Resolução óptica no alvo fluorescente é ~ 2 micra. (B) resolução efetiva medida por fotólise de glutamato enjaulado em um dendrito é de aproximadamente 5 mm. A distância maior é devido a uma combinação de difusão de glutamato ea largura finita do dendrito. (C) Fotólise podem imitar a cinética de eventos sinápticos. A família de tensão preso respostas atual se deve a variações na energia da luz entregue ao dendrito. <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Non-linear através de somatório pontos de ramificação dendrítica. (A) entradas distribuídas são aplicadas a dois ramos dendríticas separadamente. Suas respostas tensão respectivas são mostradas abaixo. (B) Os estímulos são dadas simultaneamente. A resposta medida (vermelho trace) é diferente do que a soma aritmética das duas respostas individuais (cinza traço). <img src="/files/ftp_upload/2003/2003fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Somatório supralinear é dependente do receptor NMDA. (A) APV, um antagonista do receptor NMDA seletivo bloqueia o somatório supralinear. (B) A relação intensidade do estímulo e sua sensibilidade para antagonista do receptor NMDA é traçado.

<ol>
	<li>Scanziani, M., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930-939 (2009).</li><li>Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolysis+of+caged+neurotransmitters:+Theory+and+procedures+for+light+delivery.">Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+Technology+Feature,+Cell+imaging:+Light+activated.">Nature Technology Feature, Cell imaging: Light activated.</a> Nature. 456, 826-827 (2008).</li><li>Lutz, C., Otis, T. S., DeSars, V., Charpak, S., DeGregorio, D. A., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Holographic+photolysis+of+caged+neurotransmitters.">Holographic photolysis of caged neurotransmitters.</a> Nature Methods. 5, 821-827 (2008).</li><li>Hornbeck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital Light Processing and MEMs: An overview. , .</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A vantagem da abordagem baseada fotoestimulação DMD é mais aparente para situações em que o alvo ocupa uma área relativamente grande. Se o alvo de interesse é muito pequeno, como um espinhas dendríticas, sistemas de digitalização seqüencial confocal e 2-fótons são susceptíveis de ser a melhor abordagem. Uma fraqueza significativa da abordagem DMD é o uso ineficiente da luz disponível. A maior parte da luz disponível é necessariamente direcionado para os espelhos OFF e não utilizados. <p class="jov...

Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Modern upright fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera and image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and data acquisition/interface system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DLP Discovery Developer Kit </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALP3 USB interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S2 + Optics w/LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dual camera port unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>355nm frequency tripled NdVO4 laser (~1 W)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DPSS Laser Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser shutter Model LS6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multimode optical fiber and fiber stretcher Model# 915</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canadian Instrument and Research, Ltd </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>100 um core multimode fiber</td>
</tr>
<tr>
<td>Multimode Fiber launcher </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Oz Optics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Signal generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>up to 50 kHz</td>
</tr>
<tr>
<td>Beam collimator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>DApo20UV340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UV relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Special Optics</td>
<td>#: 54-25-60-355</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

patterned photostimulation with digital micromirror devices to investigate dendritic integration across branch points

A luz é um meio versátil e precisa para o controle da excitabilidade neuronal. A recente introdução da luz effectors sensíveis, tais como canais de rodopsina e neurotransmissores enjaulado levaram a interesses no desenvolvimento de melhores meios para controlar os padrões de luz no espaço e no tempo que são úteis para fins experimentais da neurociência. Uma estratégia convencional, empregada na microscopia confocal e 2-fóton, é para focalizar a luz para um ponto de difração limitada e, então, verificar que o único ponto em seqüência sobre a região de interesse. Esta abordagem torna-se problemática se grandes áreas devem ser estimuladas dentro de uma janela de tempo breve, um problema mais aplicável a fotoestimulação do que para a imagem latente. Uma estratégia alternativa é projetar o padrão completo espacial no alvo com o auxílio de um dispositivo de microespelhos digitais (DMD). A abordagem DMD é atraente porque os componentes de hardware são relativamente baratos e é apoiado por interesses comerciais. Porque esse sistema não está disponível para microscópios verticais, vamos discutir as questões críticas na construção e operação de um tal sistema DMD. Mesmo que será principalmente descrevendo a construção do sistema de fotólise UV, as modificações para a construção do sistema de luz visível muito mais simples para os experimentos optogenetic também serão fornecidas. O sistema de fotólise UV foi usada para carryout experimentos para estudar uma questão fundamental em neurociência, como estão espacialmente distribuídos insumos integrada através de pontos de ramificação distal dendríticas. Os resultados sugerem que a integração pode ser não-linear em pontos de ramificação eo supralinearity é largamente mediada por receptores NMDA.

Watch this Scientific Journal Video about Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points at JoVE.com

Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Digital micromirror dispositivos (DMD) pode gerar padrões complexos em tempo e espaço com o qual o controle da excitabilidade neuronal. Questões relevantes para a concepção, construção e operação de sistemas de DMD são discutidos. Tal sistema permitiu a demonstração de não-linear integração entre distal pontos de ramificação dendrítica.

Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

Light is a versatile and precise means to control neuronal excitability. The recent introduction of light sensitive effectors such as channel-rhodopsin ...

patterned-photostimulation-with-digital-micromirror-devices-to

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K visualizações.  University of Maryland School of Medicine. Digital micromirror dispositivos (DMD) pode gerar padrões complexos em tempo e espaço com o qual o controle da excitabilidade neuronal. Questões relevantes para a concepção, construção e operação de sistemas de DMD são discutidos. Tal sistema permitiu a demonstração de não-linear integração entre distal pontos de ramificação dendrítica.

Vídeo: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

Modelos e Métodos para avaliar Transporte de Drug Delivery Systems através das barreiras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

Helicoidal Organização dos Fatores de Coagulação Sanguínea VIII em Lipid Nanotubos

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Fabricação de uma funcionalizados Magnetic bacteriana Nanocellulose com óxido de ferro nanopartículas

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Fabricação de algodão dispositivos analíticos

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Um Experimental e Finite Element protocolo para investigar o transporte de solutos neutras e carregadas em toda a cartilagem articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Soft Lithographic Procedure for Producing Plastic Microfluidic Devices with View-ports Transparent to Visible and Infrared Light

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable microfluidic devices. Here, a protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices is demonstrated, where soft lithographic techniques are used to embed transparent Calcium Fluoride (CaF2) view-ports in connection with observation chamber(s). The method is based on a replica casting approach, where a polydimethylsiloxane (PDMS) mold is produced through standard lithographic procedures and then used as the template to produce a plastic device. The plastic device features ultraviolet/visible/infrared (UV/Vis/IR) -transparent windows made of CaF2 to allow for direct observation with visible and IR light. The advantages of the proposed method include: a reduced need for accessing a clean room micro-fabrication facility, multiple view-ports, an easy and versatile connection to an external pumping system through the plastic body, flexibility of the design, e.g., open/closed channels configuration, and the possibility to add sophisticated features such as nanoporous membranes.

A protocol for the fabrication of plastic microfluidic devices with transparent view-ports for visible and infrared light imaging is described.

Procedimento litográfico macio para a produção de dispositivos microfluídicos plástico com vista-portas transparentes à luz visível e infravermelho

Infrared (IR) spectro-microscopy of living biological samples is hampered by the absorption of water in the mid-IR range and by the lack of suitable ...