본 연구는 투렛 증후군 환자에서 관찰된 GABARAP 결핍을 모델링하기 위해 RNAi 매개 Atg8a 녹다운 후 Drosophila melanogaster의 그루밍 행동을 평가합니다. 우리는 행동 발달에서 aAtg8a의 역할을 이해하여 신경 행동 과정에서 인간 상대의 조절 기능에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다. 수동 주석 방법의 현재 실험적 과제에는 영상에 주석 달기 및 검토와 같은 복잡한 분석 프로세스와 수동 주석과 관련된 주관성이 포함됩니다.
자동화된 방법은 또한 효과적으로 구현하고 실행하기 위해 상당한 컴퓨터 과학 전문 지식이 필요한 등의 문제에 직면해 있습니다. 우리는 Atg8a 유전자가 이전에 확립된 것 이상으로 초파리의 행동 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 우리는 그것이 그루밍과 학습을 모두 조절한다는 것을 발견했으며, 이는 Atg8a ortholog가 다른 유기체에서 유사한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
이 기술을 사용하면 Drosophila의 그루밍 빈도와 분포를 직접 정량화할 수 있습니다. 자동화된 분석법을 활용할 수 없는 실험실에서 특히 유용하며 간접 염료 기반 분석법보다 더 자세한 분석이 가능합니다. 전반적으로, 우리의 연구는 투렛 증후군과 같은 강박 행동을 보이는 신경 발달 장애를 연구하기 위한 모델 유기체로 초파리의 사용을 발전시킵니다.
또한 자가포식 관련 단백질이 행동 발달에 중요한 역할을 한다는 증거가 증가하고 있습니다. 시작하려면 흰색 표면에 4개의 3웰 접시를 나란히 놓고 각 접시를 유리 슬라이드로 덮습니다. 접시 위에 카메라를 놓습니다.
접시에 있는 파리의 가시성을 제한할 수 있는 슬라이드에 눈부심이 없는지 확인하고 눈부심을 제거하기 위해 필요에 따라 접시 위치를 조정하거나 조명을 어둡게 합니다. 이제 녹음이 이루어지는 벤치에 접시와 카메라의 위치를 표시하십시오. 생후 4일에서 9일 된 파리를 파라필름과 종이 타월로 덮인 얼음 덩어리 위에 올려놓고 가볍게 마취시킵니다.
마취가 끝나면 페인트 브러시를 사용하여 가능한 한 빨리 파리를 관찰실로 옮깁니다. 3웰 접시의 각 웰에 파리 한 마리를 배치하여 스트레스로 인한 행동 변화를 유발하지 않도록 방해를 최소화합니다. 마취 후 30 분 후 파리에 적응 한 후 카메라를 사용하여 파리를 기록 한 다음 터미널을 열고 cd PiSpy를 입력하십시오.
python3 PiSpy를 입력합니다. py를 입력하고 원하는 녹화 길이와 프레임 속도를 입력합니다. 원하는 해상도를 선택하고 빠른 캡처를 클릭합니다.
이제 Pi Spy의 미리보기 카메라 기능을 사용하여 파리의 초점이 맞고 충분히 보이는지 확인합니다. 초당 24프레임의 권장 프레임 속도로 10분 동안 파리를 기록하고 파일을 저장합니다. 비디오를 분석하려면 파일을 ELAN 6.8 소프트웨어로 가져와 그루밍 동작에 대한 자세한 주석과 심층 분석을 수행합니다.
계층, 새 계층 추가를 선택하고, 계층 이름에 접시의 위치를 입력하고, 추가를 선택하여 각 행을 할당하여 개인의 푸티지에 수동으로 주석을 추가합니다. 동작에 주석을 달려면 주석을 달 계층을 두 번 클릭하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고, 선택한 계층을 따라 커서를 끌어 단일 그루밍 시합이 표시되는 기간 동안 수행합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 새 주석을 선택하고 새로 강조 표시된 기간을 두 번 클릭하여 해당 시점에서 관찰된 동작에 대한 약어를 입력합니다.
비디오에 완전히 주석이 추가되면 View를 클릭한 다음 Annotation Statistics를 클릭하여 각 동작에 대한 분석을 얻습니다. 전방 그루밍(anterior grooming)을 플라이 바디의 전방 영역에서 수행되는 그루밍으로 식별합니다. 후방 그루밍(posterior grooming)을 플라이 바디의 전방-후방 끝에서 수행되는 그루밍으로 식별합니다.
그루밍 시합은 대조군에 비해 Atg8a RNAi 돌연변이에서 유의하게 증가했습니다. 그루밍에 소요된 시간도 대조군에 비해 Atg8a RNAi 돌연변이에서 크게 증가했습니다. 전방 그루밍 행동과 후방 그루밍 행동의 분포에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.
