내 실험실은 3 차원 및 4 차원 종양 모델링을 전문으로합니다. 종양 스페로이드 모델은 생물학 및 약물 발견 전반에 걸쳐 널리 사용됩니다. 그러나 이러한 실험에서 데이터를 수집하기 위한 기존 프로토콜은 비용이 많이 들고 어렵고 제한적입니다.
이 프로토콜은 쉽게 접근 할 수있는 화학 물질 및 장비가 필요하며 유사한 결과를 제공하는 현재 방법에 비해 노동 집약적이지 않습니다. 이 프로토콜은 초보자가 비교적 쉽게 구현할 수 있고 많은 단계가 되돌릴 수 있으므로 작은 실수에도 견고하도록 개발되었습니다. 유리 병에 0.5g의 저 융점 아가 로스의 무게를 달아 시작하십시오.
그리고 25 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오. 상기 용액을 마이크로파에서 30 내지 60초 동안 끓여서 뚜껑을 닫고 일정하게 소용돌이치게 하여 아가로스를 녹인다. N, N, N'N'Tetrakis(2-하이드록시프로필)에틸렌디아민 9g, 요소 22g, 자당 44g, 트리톤 X-100 0.1g, 탈이온수 24.9g의 무게를 잰다.
일정한 혼합으로 섭씨 56 도의 수조에서 용액을 가열하십시오. 결정이 용해 된 후, 혼합 중에 형성된 기포가 표면으로 상승 할 수 있도록 실온에서 용액을 휴지시킨다. 텍스트 원고에 설명된 아가로스 오버레이 방법을 사용하여 스페로이드를 생성합니다.
메스를 사용하여 1 밀리리터 피펫 팁의 끝을 잘라 구멍을 확대합니다. 피펫을 사용하여 웰에서 스페로이드를 흡인하여 투명한 1.5 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 동일한 조건의 여러 스페로이드를 동일한 튜브에 결합할 수 있습니다.
스페로이드를 PBS 1밀리리터에 두 번 씻은 다음 중성 4% 예열된 파라포름알데히드 용액을 추가하고 스페로이드를 섭씨 37도에서 배양합니다. 20분 후, 파라포름알데히드 용액을 제거하고 1밀리리터의 PBS로 스페로이드를 두 번 세척합니다. 그런 다음 염색을 위해 피펫을 사용하여 최대 15개의 스페로이드를 200마이크로리터 PCR 튜브에 옮깁니다.
PBS에서 200 마이크로 리터의 0.5 % 트리톤 X-100을 사용하여 세포를 투과화합니다. PCR 튜브를 50밀리리터 안에 넣고 캡 튜브를 조이고 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 스페로이드를 실온에서 약간 교반하여 배양합니다. 2시간 후, 용액을 200 마이크로리터의 항체 희석 완충액으로 대체하고, 실온에서 밤새 배양한다.
다음날, 75 마이크로 리터의 1 차 항체를 추가하기 전에 항체 희석 완충액을 제거하고 섭씨 4도에서 2 일 반 동안 배양합니다. 배양 후, 상청액을 제거하고, 0.1% 트윈 및 0.1% 트리톤 X-100 또는 PBS-TT를 함유하는 200마이크로리터의 PBS로 스페로이드를 2회 세척한다. 그런 다음 실온에서 4시간 동안 200마이크로리터의 PBS-TT와 함께 배양합니다.
다음으로, 100 마이크로리터의 2차 항체를 첨가하기 전에 PBS-TT를 제거하고 섭씨 4도에서 2일 반 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 상청액을 제거하고 PBS-TT로 2회 세척한 다음, 4시간 동안 200 마이크로리터의 PBS-TT와 함께 인큐베이션하였다. 장착을 위해 200 마이크로리터 피펫을 사용하고 고정 및 염색된 스페로이드를 조건당 하나의 튜브에서 500마이크로리터 PCR 튜브로 옮깁니다.
용액을 200 마이크로 리터의 2 % 액체 아가 로스 겔로 교체하고 실온에서 고정 된 최대 속도로 30 초 동안 빠른 스핀으로 원심 분리합니다. 50 마이크로 리터의 액체 아가 로스 겔에서 스페로이드를 흡인하고 24 웰 유리 바닥 판의 웰에 분배합니다. 젤이 경화되기 전에 주변 젤의 피펫 팁을 사용하여 스페로이드를 분리하고 스페로이드가 젤로 덮여 있는지 확인합니다.
다음으로, 웰당 500마이크로리터의 투명화 용액을 첨가하여 겔을 담그고, 이미징하기 전에 24시간 동안 실온에서 어둠 속에서 배양한다. 이미징의 경우 용기에서 스페로이드의 장착 높이를 포함하여 전체 스페로이드를 포함할 수 있을 만큼 충분히 긴 작동 거리를 가진 대물렌즈를 선택하십시오. 적도면을 식별하려면 XY 평면에서 가장 큰 표면적에 도달할 때까지 초점을 조정하고 필요한 레이저 출력 백분율, 검출기 전압, 게인 및 오프셋 설정으로 이미지를 조정합니다.
3차원 이미지의 경우 Z 강도 보정 설정을 사용하여 스페로이드의 시작과 끝을 설정하고 다양한 Z 심도에서 적절한 신호 강도를 선택합니다. 이 연구는 PBS 장착 스페로이드와 비교하여 투명화된 FUCCI 인간 흑색종 스페로이드와 투명하지 않은 스페로이드의 비교를 보여줍니다. 클리어링 솔루션은 최소한의 크기 왜곡으로 고선명 이미지를 제공합니다.
Clearing 솔루션은 조직학적 절편 없이 스페로이드 깊숙이 세포 수준 세부 사항의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다. 3차원 컨포칼 이미지를 사용하면 200미크론 깊이에서 세포 수준의 세부 정보를 얻을 수 있습니다. 또한, 피모니다졸과 p27kip1에 대해 염색된 냉동 절단된 구멍 스페로이드와 투명화된 홀 스페로이드 간의 비교가 도시되어 있다.
피모니다졸 염색은 스페로이드의 저산소 영역을 나타내고, p27kip1 염색은 세포주기 정지 및 DAPI 핵 염색을 표시한다. 더 깊은 침투와 더 적은 산란은 최소한의 광 손실로 향상된 3차원 스페로이드 구조 표현을 가능하게 합니다. DRAQ7로 염색된 FUCCI 스페로이드의 3차원 렌더링이 표시됩니다.
클리어링 솔루션은 스페로이드 크기에 최소한의 영향을 미칩니다. 스페로이드의 직경은 스페로이드와 동일한 단면적을 가진 구를 기준으로 정의되었습니다. 스페로이드는 2%와 6% 사이의 직경 폴드 변화로 표시된 바와 같이 처음 6시간 동안 크기가 약간 증가하는 것으로 관찰되었습니다.대조적으로, 24시간에서 72시간 후, 스페로이드는 PBS 파라포름알데히드 고정 후 해당 크기와 거의 동일한 크기로 돌아왔습니다.
이미징하기 전에 최소 24시간을 기다려 투명화 용액이 스페로이드 및 젤과 평형을 이루도록 하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 통해 실무자는 많은 수의 스페로이드에서 데이터를 신속하게 수집할 수 있으므로 생물학에 대한 자세한 통찰력을 제공하는 상세한 정량적 수학적 및 통계적 분석이 가능합니다.
