우리의 프로토콜은 파골세포 재흡수 분석을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트의 사용은 실험실 사용 가능한 재료를 사용하여 쉽게 준비하고 시각화 할 수 있습니다. 불투명 한 뼈 또는 상아질 조각과는 달리, 인산 칼슘 코팅은 재흡수 구덩이와 세포를 동시에 시각화 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 파골세포 분화를 위해 PBMC를 사용합니다. 그러나 골수 유래 단핵구 또는 Raw 264.7 세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 먼저 평평한 바닥 96 웰 세포 배양 플레이트와 이전에 준비된 인산 칼슘 용액 300 마이크로 리터를 각 웰에 피펫으로 가져 간다.
그런 다음, 플레이트를 뚜껑으로 덮고 플레이트를 섭씨 37도에서 3일 동안 인큐베이션한다. 3 일 후, 사전 석회화 된 96 웰 세포 배양 플레이트에서 사전 석회화 용액을 흡인하고 300 마이크로 리터의 인산 칼슘 용액을 각 웰에 첨가하십시오. 접시를 뚜껑으로 덮고 섭씨 37도에서 하루 동안 배양하십시오.
그런 다음 접시를 뒤집어 용액을 붓고 탈이온수로 접시 세 번을 철저히 씻으십시오. 즉시 헤어 드라이어를 사용하여 플레이트를 건조하거나 균일 한 표면을 유지하기 위해 압축 된 이산화탄소 또는 질소 가스를 사용하십시오. 이제 코팅 된 플레이트를 깨끗한 벤치에 자외선으로 한 시간 동안 조사하십시오.
코팅 된 플레이트를 즉시 사용하거나 플레이트를 파라 필름으로 밀봉하고 실온에서 보관하십시오. 15 밀리리터의 신선한 혈액을 동일한 양의 PBS로 희석하고 여러 번 뒤집거나 피펫팅하여 혼합하십시오. 그런 다음 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 15 밀리리터의 밀도 구배 용액을 취하여 튜브를 기울인 다음 희석 된 혈액 샘플 30 밀리리터를 밀도 구배 용액 15 밀리리터에 조심스럽게 겹쳐 놓습니다.
나중에, 튜브를 810배 G에서 휴식 없이 스윙 버킷 로터에서 섭씨 20도에서 20분 동안 원심분리한다. 그런 다음 상층을 흡인하여 단핵 세포층을 계면에서 방해받지 않고 남겨 둡니다. 조심스럽게 단핵 세포층을 새로운 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
튜브를 PBS로 채우고, 섭씨 20도에서 10분 동안 300배 G에서 혼합하고, 원심분리한다. PBMCs를 밀리리터 당 20 나노그램의 대식세포 콜로니 자극 인자를 함유하는 완전한 알파-MEM에 재현탁하고, 플라스크에서 2.5배 센티미터 평방 PBMCs당 5 세포를 10배 시드한다. 인산칼슘 코팅된 플레이트를 섭씨 37도에서 50마이크로리터의 태아 소 혈청으로 한 시간 동안 배양한다.
다음으로, 플라스크를 PBS로 두 번 세척하여 파골세포 전구체를 죽은 세포 또는 부착되지 않은 세포로부터 분리한 다음, 75 평방 센티미터 플라스크 당 네 밀리리터의 트립신을 첨가한다. 30 분 후, 네 밀리리터의 완전한 알파 MEM을 첨가하여 소화를 중단 한 다음 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 조심스럽게 분리하십시오. 세포를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 카운팅 챔버를 사용하여 총 셀 수를 계산하십시오.
튜브를 7분 동안 350배 G에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하고 펠릿을 소생시키고 M-CSF 및 RANKL을 함유하는 완전한 알파 MEM을 밀리리터당 6개의 세포에 1회 10회 수득한다. 인산칼슘 코팅 플레이트로부터 소 태아 혈청을 흡인하고, 웰 당 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫한다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 두 번 세척한다.
세포를 10분 동안 4%파라포름알데히드로 고정시키고 PBS로 다시 세척한다. 염색을 위해, 고정된 세포에 투과 완충액을 첨가하고, 이들을 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 액틴 필라멘트를 염색하기 위해, 세포를 PBS 중의 100 마이크로리터의 알렉사 플루오르 546 표지된 팔로이딘 용액으로 30분 동안 인큐베이션한 다음, 염색 용액을 흡인하고 10분 동안 100 마이크로리터의 Hoechst를 사용하여 핵을 염색한다.
10분 동안 10 마이크로몰 칼세인 및 PBS의 100 마이크로리터로 인산칼슘 코팅을 얼룩지게 하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 이미지를 캡처한다. 인산 칼슘 코팅의 Von Kossa 염색을 위해 5 % 질산은 및 탈 이온수 50 마이크로 리터를 각 웰에 첨가하고 웰 바닥의 코팅이 갈색으로 변할 때까지 한 시간 동안 자외선으로 플레이트를 배양하십시오.
96 웰 플레이트의 바닥에있는 인산 칼슘 코팅은 균일하고 잘 접착 된 것으로 나타났습니다. 인산칼슘 코팅 플레이트 상에서 M-CSF 및 RANKL에서 아홉 일간 배양한 후, 파골세포 전구체는 재흡수 구덩이 및 큰 파골세포를 형성하였다. 구덩이에 위치한 다핵 파골세포는 높은 TRAP 수준을 나타냈다.
성숙한 파골세포는 세 개 이상의 핵과 뚜렷한 액틴 고리의 존재를 보여주었다. 녹색 인산 칼슘 코팅은 검은 재 흡수 구덩이의 존재를 보여주었습니다. 구덩이 영역 형광 이미지는 이미지 J의 임계 도구를 사용하여 측정되었습니다.파골세포의 수와 크기는 ROI 관리자를 사용하여 계산되었으며 RANKL이없는 상태에서 자란 J.Osteoclasts의 전구체는 재흡수 구덩이를 형성 할 수 없었지만 M-CSF와 RANKL은 파골 세포 생성 구덩이의 형성을 촉진했습니다.
그리고 피트 면적을 이미지 J.Immediately 기류로 코팅된 플레이트를 건조시켜 균일한 인산칼슘 코팅을 만드는 데 도움을 주어 정량하였다. 그렇지 않으면 우물 중앙에 더 두꺼운 코팅을 형성하기 쉽습니다.
