이 프로토콜은 E3 리가아제에 의한 특정 기질의 유비퀴틸화를 평가할 수 있게 한다. 우리는 리가아제-기질 상호작용의 특성화가 세포에서의 그들의 기능을 이해하는 데 중요하다는 것을 알고 있다. 이 기술은 값 비싼 시약이나 정교한 장비를 필요로하지 않습니다.
플라스미드 및 관심있는 유전자를 코딩하고, 세포 용해물을 사용한 면역 침전 분석법을 개발하고, 기질 유비퀴틸화를 검출하기위한 웨스턴 블롯이 필요합니다. 암 및 신경 장애와 같은 몇몇 인간 질환은 E3 리가아제의 조절 장애와 관련이 있다. 따라서, 특정 E3 리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 확인은 이러한 질병을 치료하거나 진단하는데 도움이 될 수 있다.
절차를 시연하는 것은 발렌타인 스파 놀 (Valentine Spagnol)이 할 것입니다. 시작하기 위해, HEK293T 세포주를 10% 태아 소 혈청 및 100 단위 페니실린, 100 마이크로그램 스트렙토마이신 및 밀리리터 L-글루타민 당 0.292 밀리그램으로 보충된 둘베코 변형된 이글스 배지에서 80 내지 90% 합류로 성장시킨다. 이어서, 이 배양물을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소의 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
혈청학적 피펫을 사용하여 배양 접시로부터 배지를 흡인함으로써 세포를 계대시키고, 이를 멸균된 1X PBS 1밀리리터로 1회 세척한다. 다음으로, 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 용액 한 밀리리터를 첨가하여 세포를 분리하고, 섭씨 37도에서 5분간 배양한 후, 혈청학적 피펫을 사용하여 이들 세포를 두 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 신선하고 깨끗한 15밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리한다.
이어서, 상청액을 부드럽게 제거하고, 세포 펠릿을 성장 배지의 세 밀리리터에 재현탁시켜 상하로 피펫팅하여 균질한 세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 이 세포 현탁액 1밀리리터를 9밀리리터의 성장 배지를 함유하는 100밀리미터 TC 처리된 배양 접시에 옮긴다. 형질감염 전에, 세포가 오염으로부터 자유롭고 일시적인 형질감염에 대한 적절한 합류에 있는지 인증하십시오.
각 형질감염 샘플에 대해, 보충 없이 Opti-MEM 1 환원 혈청 배지 100 마이크로리터에 각 플라스미드의 세 마이크로그램을 희석하고 용액을 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합함으로써 DNA-폴리에틸렌이민 복합체를 제조하였다. 다음으로, 실온에서 DNA-폴리에틸렌이민을 해동시키고 DNA의 한 마이크로그램 당 세 마이크로리터의 DNA-폴리에틸렌이민의 비율에 따라 용액에 첨가한다. 위아래로 피펫팅하여 용액을 균질화하십시오.
이어서, DNA-폴리에틸렌이민 복합체의 형성을 허용하도록 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다. DNA-폴리에틸렌이민 복합체의 총 부피를 세포 배양물이 들어있는 각 접시에 넣고 플레이트를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 이들 세포를 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 인큐베이션한다.
인큐베이션 및 세포 용해 6시간 전에 배양한 후, 형질감염된 세포를 10-마이크로몰 프로테아좀 억제제 MG132로 처리하고 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션한다. 다음으로, 혈청학적 피펫을 사용하여 각 배양 접시로부터 배지를 흡인하고, 세포를 1X PBS의 1밀리리터로 1회 세척한다. 이어서, 하나의 밀리리터 트립신을 첨가하여 세포를 분리하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 디쉬를 인큐베이션한다.
세포를 한 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시키고 세포 현탁액을 신선하고 깨끗한 두 밀리리터 마이크로튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리한다. 원심분리가 끝나면 조심스럽게 부어 상층액을 제거하고 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일이 보충 된 얼음처럼 차가운 MP40 용해 완충액 200 마이크로 리터에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하십시오. 그런 다음이 용액을 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로 옮깁니다.
이 세포 용해물을 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하고, 인큐베이션한 후, 섭씨 4도에서 20분 동안 16, 900배 G에서 세포 용해물을 원심분리한다. 한편, 아가로스 항-HA 비드를 빙냉 MP40 용해 완충액으로 평형화시킨다. 각 샘플에 대해 15 마이크로리터의 아가로스 항-HA 비드를 사용하십시오.
비드를 200 마이크로리터의 MP40 용해 완충액으로 세척하고, 이를 섭씨 4도에서 1분 동안 3, 000배 G의 마이크로 원심분리 튜브에서 펄싱한다. 다음으로, 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡인하고 버리고이 과정을 세 번 반복하십시오. 그 후, 사용할 때까지 구슬을 얼음 위에 평형으로 유지하십시오.
세포 용해물을 원심분리한 후, 상층액을 회수하고 브래드포드법을 이용하여 전체 용해물 중의 단백질 함량을 정량화하여 면역침전을 실시한 각 시료가 동일한 양의 단백질을 제시하도록 한다. 필요한 부피의 세포 용해물을 네 시간 동안 평형화된 아가로스 항-HA 비드와 함께 인큐베이션하고, 섭씨 4도에서 회전하는 인큐베이터에서 부드럽게 회전하며, 이는 UXT-V2-HA가 아가로스 항-HA 비드에 결합할 수 있게 한다. 아가로스 항-HA 비드를 섭씨 4도에서 1분 동안 3, 000배 G의 마이크로원심분리 튜브에서 펄싱하여 수집한다.
조심스럽게 상층액을 흡인하고 버리십시오. 빙냉 MP40 세포 용해 완충액으로 비드를 세 번, 얼음처럼 차가운 FLAG HA 완충액으로 두 번 씻으십시오. 최종 세척 후, 피펫을 사용하여 모든 상층액을 조심스럽게 제거하고, FLAG HA 완충액 상에 희석된 HA 펩티드의 밀리리터 당 300 마이크로그램으로 폴리유비퀴틸화 단백질을 용출시켰다.
아가로스 항-HA 비드를 HA 펩티드와 함께 한 시간 동안 교반 진탕기 플랫폼에서 섭씨 네 도에서 인큐베이션한다. 다음으로, 비드를 섭씨 4도에서 2분 동안 3, 000배 G에서 스핀다운하고, 폴리유비퀴틴화 단백질을 함유하는 상청액을 조심스럽게 제거하였다. 필요한 경우 용리액을 영하 20도의 신선하고 깨끗한 마이크로 튜브에 보관하십시오.
용리액과 세포 용해물을 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 면역블롯팅으로 해결한다. 습식 이송 웨스턴 블롯팅을 수행하려면 젤을 여과지, 겔 멤브레인 여과지로 구성된 전사 샌드위치에 넣고 패드로 쿠션한 다음 지지 그리드로 함께 누릅니다. 그런 다음이 시스템을 스테인레스 스틸 또는 백금 와이어 전극 사이의 이송 버퍼로 채워진 탱크에 수직으로 놓습니다.
전송은 습식 전달 버퍼의 150V에서 90 분 동안 발생합니다. 마지막으로, 항-myc 항체를 사용하여 면역블롯 막을 프로브한다. 세포에서 F-box 단백질 7에 의해 매개되는 UXT-V2-HA의 특이적 폴리유비퀴틸화는 기질에 접합된 myc-ub를 검출하는 항-myc 항체로 항-HA 면역침전으로부터 용리액을 프로빙한 후에 관찰되었다.
폴리유비퀴틸화된 기질에 대한 항-myc의 특이성은 하나 및 두 개의 레인에서 가시화되었고, 여기서 폴리유비퀴틸화된 단백질의 도말은 세포가 UXT-V2-HA 플라스미드의 부재 하에 F-box 단백질 7 및 myc-ub로 공동형질감염되었을 때 검출되지 않았다. 추가적으로, 단백질 폴리유비퀴틴화에 상응하는 도말 없음은 myc-ub 플라스미드가 없는 F-box 단백질 7 및 UXT-V2-HA의 조합에서 가시화되었다. 활성 SCF를 조립할 수 없는 빈 벡터 야생형 F-박스 단백질 7 또는 F-box 단백질 7 돌연변이체가 UXT-V2-HA 및 myc-ub와 결합하여 형질도입되었을 때, 폴리유비퀴틸화된 UXT-V2의 강한 도말 신호는 야생형 F-박스 단백질 7에 대해서만 관찰되었으며, 이는 UXT-V2가 대조군과 비교하여 SCF F-박스 단백질 7 복합체 및 세포에 의해 폴리유비퀴틸화되었음을 시사한다.
평형화된 비드를 사용한 세포 용해물의 인큐베이션 및 면역침전된 단백질의 용출을 포함하는 모노침전 단계는 이러한 프로토콜의 목적을 달성하기 위해 필수적이다. 이 절차 후에, E3 리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 특이성을 확인하기 위해 시험관내 유비퀴틸화 분석이 수행되어야 한다.
