이 프로토콜은 유전자 분석을 위해 부화 된 나비 ovi에서 융모막을 샘플링하는 새로운 접근 방식을 사용합니다. 다른 조직 샘플링 기술이 비실용적이거나 사용할 수 없거나 허용되지 않을 때 특히 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 공급품을 획득하기 쉽고 유전자 샘플을 획득하기 위해 일시적으로 포획하거나 조작하고 잠재적으로 살아있는 유기체에 해를 끼칠 필요가 없는 잔류 유기 물질을 표적으로 하는 것을 사용하여 상대적으로 낮은 전체 비용을 갖는다.
전체 프로토콜은 간단하고 배우기 쉽지만 특히 샘플 수집 이벤트 간의 교차 오염을 방지하기 위해 매우 작은 대상 샘플을 성공적으로 찾고, 식별하고, 제거하기 위해 손재주와 세부 사항에 대한 엄격한 주의가 필요합니다. 필요한 수집 관련 물품의 전체 목록을 주의 깊게 검토하고 수집하는 것으로 시작하십시오. 샘플 수집이 여러 위치에서 발생하거나 여러 개인 또는 팀에 의해 발생하는 경우 필요한 모든 보급품을 별도의 배치 가능한 장치로 수집하고 구성합니다.
지역 사회 과학자 또는 현장 수집을 담당하는 기타 직원에게 물품을 운송합니다. 직원이 현지인이 아닌 경우 완전한 배송 라벨이 있는 별도의 판지 배송 상자에 소모품을 조심스럽게 포장하여 배송하십시오. 수거 도구 상자를 포함한 수거 용품을 수령하면 적층 공급 목록을주의 깊게 검토하고 전체 재고를 수행하십시오.
누락된 소모품이 있는 경우 프로젝트 리더에게 알립니다. 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 180 마이크로 리터의 용해 버퍼를 미리 채 웁니다. 미리 인쇄된 고유 ID 라벨을 각 마이크로 원심분리기 튜브에 적용하고 모든 튜브를 64웰 마이크로 원심분리기 튜브 보관 상자에 넣습니다.
적재 후 뚜껑을 단단히 고정하십시오. 모든 디지털 장비가 완전히 충전되어 있고 예비 배터리가 포장되어 있는지 확인하십시오. 수집 된 샘플의 현장 저장 및 지역 운송을 위해 작은 냉각기에 얼음을 부분적으로 채 웁니다.
안전한 운송 및 통합 보관을 위해 모든 수집 용품을 수집 도구 상자 또는 이와 유사한 견고한 비바람에 견디는 컨테이너에 포장하십시오. 현장으로 향하기 전에 비파괴 유전자 샘플 수집 프로토콜과 세부 사항을 검토하십시오. 현장 현장에 도착하면 연필이나 전천후 펜을 사용하여 시간, 날짜, 전체 속성 이름, 특정 현장 현장 위치 이름 또는 설명, 가능한 경우 GPS 판독값, 내후성 현장 노트북에 있는 모든 개인의 전체 이름과 역할을 기록합니다.
유충 숙주 식물의 존재에 적합한 서식지를 종 별 표적 나비에 배치하십시오. 스마트 폰이나 카메라를 사용하여 모든 현장 현장, 샘플 수집 위치, 숙주 식물 및 기타 관련 정보의 자세한 사진을 찍습니다. GPS 좌표를 기록하는 스마트 폰이나 기타 카메라를 사용하십시오.
잎, 꽃 봉오리, 꽃과 같은 모든 유충 숙주 식물 부분을 종합적으로 검색하거나 부화 된 알을 위해 난자를 양성하는 성인 암컷 나비가 선택한 것으로 알려진 개발 과일을 검색합니다. 대부분의 Lycaenidae의 경우 중앙에 신생아 유충이 나온 도넛과 유사한 뚜렷한 구멍이있는 흰색 부화 알을 찾으십시오. 색이 더 어둡고 종종 녹색 또는 푸르스름하고 중간에 구멍이 없어 완전히 손상되지 않은 부화되지 않은 알을 찾으십시오.
부화 한 알을 찾으면 니트릴 장갑을 착용하십시오. 멸균되고 뾰족한 집게를 사용하여 부화 한 알을 숙주 식물에서 잡고 부드럽게 당겨 용해 완충액으로 미리 채워진 라벨이 붙은 미세 원심 분리기 튜브에 직접 넣습니다. 유사하게, 다른 조직 샘플이 사용되고 처리될 수 있다.
수집된 모든 물질이 각 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브 내의 용해 완충액에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 튜브의 바닥을 단단한 표면에 두드려 샘플을 다시 담그십시오. 새 샘플을 수집 할 때 사용한 니트릴 장갑을 버리고 깨끗한 쌍으로 교체하십시오.
각 계란 수집 후, 집게 끝을 짜기 병에서 95 % 에탄올 약병에 담그거나 뿌리거나 알코올 물티슈를 사용하여 조심스럽게 청소하십시오. 사이트 당 숙주 식물 패치 당 최소 5 개의 샘플을 수집하고, 각 샘플에는 1-20 개의 알이 포함되어 있으며, 가능한 경우 한 위치에서 총 50 개 이상의 알을 목표로합니다. 동일한 숙주 패치의 여러 식물에서 부화 한 알 1-20 개를 단일 미세 원심 분리기 튜브에 모으고 뚜껑을 단단히 닫습니다.
더 큰 초본 또는 목본 숙주 종을 사용하는 나비 종의 경우 숙주 패치가 제한된 경우 동일한 식물의 다른 위치에서 여러 알을 수집합니다. 비바람에 견디는 필드 노트북에서 할당된 고유 ID 레이블을 샘플 유형, 부화한 알의 대략적인 수 및 수집 정보와 함께 기록합니다. 계란 파편 샘플이 있는 닫힌 미세 원심분리기 튜브를 64웰 미세 원심분리기 보관 상자에 다시 넣습니다.
현장에 있는 동안 얼음이 있는 쿨러에 보관 상자를 보관하십시오. 다른 모든 수거 용품은 현장 간에 안전하고 통합된 보관 및 운송을 위해 수거 도구 상자에 넣으십시오. 이 160 개의 샘플 중에서 DNA는 마이크로 리터당 1.67 나노 그램의 평균 농도로 88 개에서 성공적으로 추출되었으며 가장 높은 DNA 수율은 마이크로 리터당 26.8 나노 그램이었습니다.
조직 유형별 DNA 농도는 하나의 계란 파편을 포함하는 샘플에는 하나의 계란 케이스만 있고 여러 개의 계란 케이스를 포함하는 샘플에는 2개에서 20개 사이의 케이스 수가 샘플 당 평균 5.3개로 최소 2개 있는 것으로 확인되었습니다. 최대 563 개의 샘플을 수집하기위한 자료는 북미 동부의 종 범위에 걸쳐 9 개 주에서 온 8 명의 보존 및 지역 사회 과학자에게 보내졌습니다. 자료는 현지 피크 비행 시간 전에 2021년 동안 3개월에 걸쳐 발송되었습니다.
총 160 개의 칼레 펠리스 홍채 조직 샘플이 접수되었습니다. 샘플 간의 교차 오염을 최소화하고, 수집된 샘플이 용해 버퍼에 완전히 잠기도록 하고, 각 샘플에 대한 고유한 ID 라벨 및 수집 데이터를 정확하게 기록하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 지역 사회 과학자들이 희귀 나비의 현존하는 개체군을 비파괴적으로 샘플링하여 광범위한 유전 구조 분석을 수행하는 데 도움이 되는 광범위한 배포 및 사용을 가능하게 했습니다.
