이 프로토콜은 오가노이드로 성공적으로 작업하는 것이 세부 사항에 달려 있기 때문에 중요하며 현장에는 다른 사람들이 구축 할 수있는 명확한 세부 프로토콜이 누락되어 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 시간 척도, 낮은 바이오 매스 요구 사항 및 저렴한 비용 확장 성입니다. 훨씬 더 많은 연구가 필요하지만,이 기술은 임상 적으로 번역 될 수있는보다 정확한 개별 또는 조합 요법의 테스트를 허용함으로써 폐암 치료를 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.
가장 큰 도전은 Matrigel로 널리 알려진 BME2를 처리하는 것입니다. 소중한 오가노이드를 소개하기 전에 액체 BME2를 피펫팅하고 취급하는 것이 좋습니다. 먼저 침수된 BME2 오가노이드 배양물을 배양 플레이트에서 조심스럽게 흡인하여 배양물을 접촉시키지 않도록 분리시킨다.
침수된 BME2 오가노이드 배양물을 여섯 웰 플레이트에 웰당 2밀리리터의 재조합 효소를 첨가함으로써 적합한 재조합 효소로 트립신화한다. BME2를 상하로 반복적으로 피펫팅하여 기계적으로 파쇄하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 세포 배양 배양기에서 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면 현탁액을 15 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5 분 동안 600 배 G에서 원심분리한다.
재조합 효소 상청액을 오가노이드 펠릿을 건드리지 않고 조심스럽게 흡인하고, 오가노이드 펠릿을 성장 배지에 재현탁시킨다. DNase 1을 첨가한 후, 현탁액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하고, 실온에서 3분 동안 600배 G에서 원심분리한다. 오가노이드 펠릿을 만지지 않고 조심스럽게 배지를 버리고 펠렛을 신선한 성장 배지에 재현탁하십시오.
새로운 검은색 투명 바닥 96웰 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 세포 배양 인큐베이터에서 예열한 다음, 세포 분석기를 사용하여 세포를 계수하기 위해 PBS에 세포 현탁액을 제조하였다. 실험에 필요한 세포 현탁액 부피를 계산한 후, 이전에 입증된 바와 같이 원심분리에 의해 단일 세포 현탁액 및 펠릿으로부터 세포를 분취한다. 배지가 폐기되면 BME2에서 재현탁하기 전에 세포를 약 1분 동안 얼음 위에 보관하십시오.
미리 예열된 검은색 투명 바닥 96웰 플레이트를 몸체 쪽으로 기울이고 웰 당 다섯 마이크로리터의 세포 현탁액을 시드한 다음, 웰의 6시 위치에 세포 돔을 시딩한다. 96 웰 플레이트의 테두리에 있는 외부 웰을 PBS로 채우고 나머지 내부 웰에 세포 돔을 시드한다. 세포 배양 층류 후드에서 갓 시딩된 세포 돔을 플레이트를 이동시키지 않고 5분 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 섭씨 37도에서 10분 동안 인큐베이션한다.
조심스럽게 오가노이드를 함유하는 모든 웰에 웰당 100 마이크로리터의 성장 배지를 첨가하고 100 마이크로리터의 PBS를 플레이트의 테두리에 있는 외부 웰에 첨가한다. 7 일 동안 섭씨 37도에서 오가노이드를 배양하고, 텍스트 원고에 언급 된 지시에 따라 미디어를 변경하고, 광 현미경으로 오가노이드의 성장을 정기적으로 검사합니다. EGFR 돌연변이 비소세포 폐암 오가노이드를 치료하기 위해 오시머티닙을 위한 저성장 인자 배지에서 희석된 연속 약물을 준비한다.
낮은 성장 인자 배지 및 0.1%DMSO를 첨가하여 음성 대조군을 포함시킨다. 오가노이드 플레이트를 시계 방향으로 180도 회전시켜 오가노이드가 이제 12시 위치에 오도록 하고 바람직하게는 다중 채널 장치를 사용하여 성장 매체를 조심스럽게 흡인한다. 웰 당 100 마이크로 리터의 조절 또는 약물 용액을 첨가하십시오.
처리된 오가노이드를 다시 섭씨 37도에서 5일 동안 세포 배양 배양기에서 배양한다. 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 시약을 해동하여 생존 검정을 수행하기 시작한다. 시약을 사용 전에 실온에서 30분 동안 수조에서 평형화시키고 반전시켜 혼합한다.
각 웰에 시약 100 마이크로 리터를 넣고 오르가노이드 돔의 위치에 놓인 피펫 팁으로 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하십시오. 어둠 속에서 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 다중 채널 피펫을 사용하여, 용해물의 대략 150 마이크로리터를 새로운 백색 불투명 바닥 96 웰 플레이트로 옮긴 다음, 플레이트를 어둠 속에서 실온에서 추가로 25분 동안 인큐베이션한다.
ELISA 플레이트 리더를 사용하여 발광을 기록한다. 사용된 플레이트 레이아웃 및 약물에 대한 모든 원시 읽기 및 기록을 포함하는 적절한 데이터 테이블 형식으로 데이터를 저장합니다. EGFR 돌연변이 양성 TH107 오가노이드는 56 나노몰의 절반 최대 억제 농도로 오시머티닙 처리에 대한 민감성을 보인 반면, EGFR 돌연변이 양성 TH116 오가노이드는 1 마이크로몰 초과의 절반 최대 억제 농도로 오시머티닙 처리에 내성을 보였다.
EGFR 양성 TH107 비소세포 폐암 세포의 감수성은 세포 주기 관련 유전자 시그너처의 발현의 감소 및 아폽토시스 관련 유전자의 발현의 증가를 포함하는 유의한 전사 변화를 수반하였다. 표적 억제제에 대한 민감한 EGFR 돌연변이 양성 TH330의 반응은 성장 배지 대 낮은 성장 인자 배지에서 유의하게 영향을 받는다. EGFR 돌연변이 양성 TH330에서의 조합 치료는 증가된 치료 반응을 가져왔다.
이 접근법은 분자 치료 또는 조합 치료 요법을위한 개인화 된 전략을 향상시킵니다. 후자는 약물 내성 및 내성 메커니즘을 조기에 표적화하여 임상 반응을 심화시키고 환자 결과를 개선하는 데 도움이됩니다.
