이 프로토콜을 수행하기 쉬운 프로토콜은 높은 처리량 설정에서 다양한 조건 하에서 파지 칵테일이라고도 하는 다양한 박테리오파지 조합의 항균 효능을 평가합니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 환경 조건하에서 파지 효능에 영향을 줄 수 있는 온도와 같은 다양한 생체 제제 및 비생물인자를 스트리밍하는 능력입니다. 이 방법은 생체 제어 및 치료 결과를 향상시키고 세균 성 호스트와 박테리오파지 사이의 상호 작용을 결정하기 위해 적절한 파지 칵테일의 설계를 용이하게 할 수 있습니다.
먼저 교차 오염을 방지하기 위해 필터링된 팁을 사용하여 마이크로플레이트 분석기를 설정합니다. 먼저, 96웰 마이크로플레이트 의 1~12개의 컬럼에 180마이크로리터를 추가한 다음, 멸균 96웰 마이크로플레이트의 1~8개 기둥에 각 파지의 연속 10배 희석제를 준비하여 분석법을 설정한다. 마이크로 플레이트의 상단 행 A의 1~8개 에 개별 파지 또는 파지 칵테일 20마이크로리터를 추가합니다.
파지 프리 및 빈 컨트롤의 경우 9~12개의 열 상단에 20마이크로리터의 mTSB를 추가합니다. 파이펫팅하는 동안, 적어도 다섯 번 부드럽고 반복 된 포부와 희석 사이의 팁을 변경잘 내용을 혼합. 마지막 행 H에서 20 마이크로리터를 제거한 다음 희석 된 배양의 2 ~3 밀리리터를 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 저수지로 이송하여 테스트 된 세균 균주에 대한 저장소를 설정합니다.
멀티채널 파이펫을 사용하여 각 첨가물 사이의 팁을 변경하면서 1~10개의 컬럼에 희석된 세균 배양의 마이크로리터 20개를 추가합니다. 마이크로 플레이트를 덮고 섭씨 37도에서 배양합니다. 2 시간 간격으로 인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 제거하고 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 읽습니다.
또는 마이크로 플레이트 판독기에서 플레이트를 배양하고 시간이 지남에 따라 읽습니다. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 600 나노미터의 광학 밀도를 검사하려면 마이크로 플레이트 판독기에서 프로그램을 엽니다. 시작 옵션 창에서 간단한 모드를 선택한 다음 작업 관리자에서 새 프로토콜 만들기를 선택합니다.
플레이트 유형 선택 창에서 드롭다운 목록에서 96웰 플레이트를 선택합니다. 감지 방법으로 읽기 유형에 대한 흡광도를 선택하고, 광학 유형에 대한 끝점/운동 옵션을 선택하고, 단색로미터를 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 읽기 단계의 경우, 파장에 대한 600 나노미터를 입력, 읽기 속도에 대한 일반을 선택하고 분석에 대한 온도를 설정 OK.To 클릭, 인큐베이터 확인란을 클릭하고 인큐베이터 를 선택 On.온도 상자에 원하는 온도를 입력한 다음 확인을 클릭합니다. 섭씨 22도의 시험 조건에는 옵션이 필요하지 않지만 섭씨 37도 의 다음 단계 확인란으로 계속하기 전에 예열을 클릭하십시오. 인큐베이션 중에 플레이트 뚜껑의 응축을 방지하려면 그라데이션 상자에 값을 입력하여 온도 그라데이션을 설정한 다음 확인을 클릭합니다. 다음으로 Kinetic 확인란을 클릭하여 운동 설정을 엽니다.
런 타임을 섭씨 37도 인큐베이션으로 10시간 또는 실온22시간 동안 설정하고 판독 간격으로 2시간을 입력한 다음 OK를 클릭합니다. 각 운동 읽기에 필요한 경우 쉐이크 상태를 설정하려면 프로시저 창의 쉐이크 확인란을 클릭합니다. 리니어를 쉐이크 모드로 선택하고 지속 시간을 30초로 변경합니다. 선형 주파수 값을 분당 731사이클로 설정한 다음 프로토콜 요약 대화 창 OK.In 클릭하고, 플레이트 레이아웃을 클릭하고, 공백, 분석 컨트롤 및 샘플을 선택하고 다음을 클릭합니다.
각 웰 유형에 대한 설정을 정의한 후 마무리를 클릭합니다. 왼쪽 인터페이스에서 잘 ID를 선택하고 플레이트 레이아웃 창에 표시된 행렬에 할당한 다음 확인을 클릭합니다. 읽기 플레이트 버튼을 클릭하고 프로토콜을 prt 파일로 저장하고 저장을 클릭합니다. 접시를 삽입하고 확인을 클릭합니다. 실험이 완료되면 실험을 XPt 파일로 저장하고 저장을 클릭합니다.
추가 분석을 위해 메시지 창 상자의 예 단추를 클릭하여 데이터를 Excel로 내보냅니다. 저장 예/아니오 선택 영역을 클릭하고 기본 설정을 저장하려면 다시 확인란을 요청하지 마십시오. 프로토콜에 따라, 파지 효능의 비교는 다양한 파지 조합, 온도, 시간, 및 감염의 복합성, 또는 MOI, 수행되었다.
이러한 분석에 기초하여, 항 O157 파지 효능은 섭씨 22도에서 14, 16 또는 18시간의 배양 후에 최대화되었다. 박테리아의 파지 죽이는 역학을 이해하기 위해 600 나노미터의 OD 값은 샘플링 시간, MOI 및 파지 치료에 대해 플롯되었습니다. 치료된 섭씨 37도에서 대표적인 세균 성장 곡선이 표시됩니다.
T4는 낮은 MOI에서도 각 샘플링 시간에 세균 성장을 완전히 억제했습니다. 파지를 분석하여 세균 성장을 저해하고, 모든 MOI의 평균 OD 값이 각 샘플링 시간 및 파지 처리에 대해 플롯되었다. 두 온도에서 대표 그래프는 파지 살인 효능을 밝혀, 예를 들어, T1 플러스 T4에 대한 향상 된 22 섭씨 에 비해 섭씨 37 섭씨.
전반적인 파지 효과의 비교는 최고의 위상 처리를 확인하는 것을 용이하게 하는 표시됩니다. 예를 들어, 대장균 균주 3081의 경우, 파지 T4 및 T5 플러스 T4를 가진 치료는 섭씨 37도에서 가장 효과적인 치료법이었다. 그러나, 22도에서, T4, 파지 T1 플러스 T4, T1 플러스 T4 플러스 rV5, 4 파지 칵테일 이외에도 효과적이었다.
이 절차를 수행할 때, 특히 멀티채널 파이펫과 접근 방식의 균일성을 사용할 때 매우 정확한 파이펫팅은 비교되고 해석 가능한 결과를 얻기 위해 필수적입니다. 후속 실험은 광범위한 국물 배양 시스템 및 기타 생물학적 행렬에서 항식 돌연변이의 출현을 방지하여 스크리닝에서 가장 영향력 있는 칵테일의 추가 성능을 평가해야 합니다.
