단일 세포 수준에서 모양 의존적 전사학을 연구하는 접근법

우리는 단일 세포 수준에서 다른 형태로 부착을 성장하고 분류하는 방법을 사용하여 세포 모양이 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하기위한 새로운 플랫폼을 제안합니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내의 다른 모양과 세포를 비교하는 것으로 시험관 내 세포 모양의 높은 처리량 연구를 용이하게한다는 것입니다. 패턴심근세포 배양을 설정하려면, 적절한 도금 중간 농도의 밀리리터 당 10~5개의 세포로 세포를 계산하고 희석하기 위한 15밀리리터 튜브에 관심있는 종횡비로 심근세포 현탁액을 이송한다.

35 밀리리터 그레니에 페트리 접시 내부에 따뜻한 도금 매체 의 두 밀리리터에 잠긴 섬유넥틴 코팅 마이크로 패턴 칩에 2 밀리리터의 셀을 넣고 18시간 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 접시를 놓습니다. 다음 날, 대부분의 세포가 부착되어 있는지 확인하기 위해 가벼운 현미경 검사법에 의해 칩을 확인하십시오. 접시에서 배지를 제거하여 파편이나 죽은 세포를 제거하고 중앙에서 시작하여 드롭 현명한 방식으로 측면을 향해 이동하여 세포에 PBS를 부드럽게 추가합니다.

세 번째 세척 후 PBS를 4 밀리리터 유지 보수 매체로 교체하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌리게 한다. 72시간 후, 칩 표면을 두 번 부드럽게 세척당 따뜻한 덜벡코의 PBS 2밀리리터로 부드럽게 세척하고 집게를 사용하여 세척된 칩을 새로운 멸균 35 밀리리터 그레니에 페트리 접시로 즉시 옮겨냅니다. DPBS에 1.5 마이크로리터의 생생한 디사이클 그린 희석 1000배를 칩에 빠르게 추가합니다.

칩 위에 챔버를 고정하고 셀 피커 스테이지의 접시 홀더에 접시를 놓습니다. 마그네틱 캡을 삽입하고 라이브 뷰 창에 십자선을 찾습니다. 십자선에 초점을 맞추고 스캐닝 및 정렬 창에서 자동화된 주입 및 교정을 위한 교정을 선택합니다.

접시 상체를 DPBS 용액의 일대일 트리플 E의 1.5 밀리리터로 교체하여 섬유넥틴에서 세포를 풀고 스캐닝 탭을 엽니다. 전체 칩을 스캔하려면 시야에서 칩의 왼쪽 상단 모서리에 초점을 맞추고 현재 현미경 위치를 클릭합니다. 다음으로 칩의 오른쪽 하단 모서리에 초점을 맞추고 현재 현미경 위치를 클릭합니다.

팝업 창에서 가장 날카로운 평면을 클릭하고 오른쪽 상단으로 이동하여 왼쪽 하단 모서리 버튼으로 이동합니다. 그런 다음 마무리를 클릭하여 스캔을 시작합니다. 스캔이 완료되면 분석 탭을 열고 표시 맵을 클릭하여 학습 기준을 통과하는 단일 셀을 선택합니다.

현미경 라이브 뷰의 중간에 유리 미세 모세관을 중앙및 펌프 탭을 엽니 다. 진공을 만들려면 50 밀리리터 넘버 원 주사기 4밀리리터에서 플런저를 철회하고 선별 탭을 엽니다. 단일 셀을 선택하도록 하려면 밸브 2개를 120밀리초 동안 열고 밸브를 200밀리초의 시간 경과 후 20밀리초 동안 개봉하도록 설정합니다.

고른 셀이 용해 버퍼를 포함하는 PCR 튜브에 성공적으로 전달되도록 하려면 밸브 하나를 20밀리초 동안 열고 밸브 2개를 10밀리초의 시간 경과 후 10밀리초 동안 개봉하도록 설정합니다. 밸브 설정이 조정되면 경로를 계산합니다. 이 소프트웨어는 칩 전체에 선택한 셀을 집어 들고 주입하기 위해 셀에서 셀로의 가장 빠른 경로를 계산합니다.

그런 다음 현미경을 칩 표면의 패턴에 집중합니다. 조이스틱을 사용하여 마이크로카세필레를 조심스럽게 아래로 이동하여 마이크로모세혈관 끝의 가장 선명한 이미지를 칩 표면과 클릭 세트에 건드리지 않고도 얻을 수 있습니다. 마이크로모세필리 단면을 보여주는 새 창이 열립니다.

소프트웨어가 X, Y 및 Z 좌표에서 모세관의 팁 오프셋을 기록하려면 모세관의 정확한 중심을 클릭합니다. 그런 다음 정렬을 시작하려면 정렬을 시작합니다. 고른 단일 셀로부터의 사전 증폭 된 cDNA의 이러한 대표적인 분석에서, 밀도 플롯과 같은 겔내의 명확한 대역은 전기 페로그램에서 1, 852 염기 쌍에서 피크에 대응하는 것으로 관찰되었다.

단편의 평균 크기는 1, 588 개의 기본 쌍이었고, 작은 수의 파편이 300 개의 기본 쌍보다 짧아서 좋은 cDNA 라이브러리의 생성을 나타냅니다. 면역형염색 염색 및 분석은 또한 패턴심근세포 내의 사코메구조 구조를 평가하기 위하여 수행될 수 있다. 이 플랫폼은 심부전의 다른 모형의 높은 처리량 연구 그리고 약 검열을 위한 도로를 포장합니다.