단일 세포 또는 단일 핵 현탁액을 준비하는 것은 높은 처리량 전사및 후성 유전체 프로파일링을 위한 중요한 단계입니다. 우리의 프로토콜은 단일 핵 절연을위한 간단하고 재현 가능한 보편적 인 방법을 제공합니다. 핵 분리를 위한 세제를 요구하는 그밖 방법과는 달리, 우리의 프로토콜은 세제 및 효소가 없는 열 기지를 입니다.
그것은 30 분 이내에 핵 절연을 가능하게합니다. 우리의 프로토콜은 핵 분리를 단순화합니다. 그것은 소화하기 어려운 조직에서 단 하나 핵 현탁액을 준비하는 강력한 방법을 제공합니다.
시작하려면, 적어도 30 분 동안 얼음에 배치하여 세제없는 핵 절연 키트에서 사전 냉각 버퍼 A와 B. 5%BSA 용액을 갖춘 코트 튜브 및 파이펫 팁으로 핵 회복이 향상됩니다. 파이펫 팁을 코팅하려면 파이펫 5% BSA 용액을 2~3회, 공기는 2시간 동안 건조시다.
튜브를 코팅하려면 BSA로 채우고 세 번 반전하십시오. 용액을 제거하고 깨끗한 티슈 페이퍼에서 튜브를 거꾸로 2시간 동안 건조시다. 수집 튜브 1개와 샘플당 1.5밀리리터 튜브 1개를 코팅합니다.
집게를 사용하여 두개골을 부드럽게 부수고 두개골의 복부와 등쪽에서 연조직, 피부 및 뼈를 제거합니다. 그런 다음 얼음 차가운 PBS가 들어있는 30밀리미터 접시에 뇌를 부드럽게 옮기고 면도날을 사용하여 뇌를 작은 조각으로 다진다. 단일 핵을 분리하기 위해, 핵 격리 키트에 제공된 필터 카트리지에 다진 조직을 옮기고 과잉 용액을 제거하고 2분 동안 플라스틱 막대로 조직을 분쇄하는 200 마이크로리터를 첨가한다.
300 마이크로리터의 콜드 버퍼 A를 필터 카트리지에 넣고 캡을 10분 동안 열어 얼음 위에 배양합니다. 그런 다음 카트리지를 캡하고 튜브를 5번 반전하여 조직을 다시 중단합니다. 시료 튜브를 16, 000배 g에서 30초 동안 원심분리하여 세포를 파열시다.
플로우스루에는 튜브 바닥에 무색 펠릿을 형성하는 손상되지 않은 핵이 포함되어 있습니다. 필터를 버린 다음 10 초 동안 적극적으로 소용돌이하여 펠릿을 다시 중단합니다. 3분 동안 500배 g의 용액을 원심분리하여 핵을 다시 펠렛한다.
그런 다음 상체를 조심스럽게 폐기하십시오. 2~3회 파이프를 사용하여 0.8 밀리리터의 냉완충제 B에서 펠릿을 다시 중단하고 핵을 10분 동안 600배 g로 원심분리하여 막 파편으로부터 분리합니다. 상체를 조심스럽게 폐기하십시오.
5%BSA로 PBS의 500 마이크로리터에서 분리된 핵을 재중단하고 FACS가 될 때까지 얼음에 현탁액을 유지합니다. HEX 염색을 통해 핵 형태를 확인하기 위해, BSA 코팅 팁을 사용하여 단일 핵 현탁액의 100 마이크로리터를 새로운 튜브로 이송한다. HEX의 0.1 마이크로리터를 추가하고 튜브를 부드럽게 소용돌이시킴으로써 핵을 얼룩지게 합니다.
405 나노미터의 레이저 흥분 설정을 사용하여 형광 현미경을 사용하여 핵의 유리 바닥 접시 및 이미지로 핵 현탁액을 전달한다. FACS를 수행하기 전에 40 마이크로미터 세포 여과기를 BSA 코팅 튜브로 필터링합니다. 1, 000 마이크로리터의 최종 부피에 5%BSA로 PBS를 추가하여 필터링된 서스펜션을 희석시 희석시.
BSA 코팅 파이펫 팁을 사용하여 2라운드 하단 FACS 튜브를 제어 및 염색및 대조관 으로 250 마이크로리터를 제어및 염색하고 이송합니다. 나머지 750마이크로리터의 용액을 염색된 FACS 튜브에 전달하고 HEX 염료 1개를 추가하여 핵을 얼룩지게 한다. 그런 다음 느린 소용돌이로 섞습니다.
스테인드 되지 않은 제어 샘플을 셀 선별기에 로드하고 5, 000 이벤트를 기록합니다. 그런 다음 스테인드 샘플을 로드하고 5, 000 이벤트를 기록합니다. 단일 핵을 식별하기 위해 FACS 게이트를 그립니다.
핵은 대조군과 스테인드 샘플 사이의 HEX 형광 신호를 비교하여 선택될 수 있다. 그런 다음 스테인드 튜브에서 HEX 양성 핵을 5%BSA로 PBS 50 마이크로리터를 포함하는 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 정렬합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 뇌 조직에서 직접 단일 핵 현탁액을 생성하는 데 사용되었다.
고립 된 핵은 HEX로 염색되고 형광 현미경 검사로 시각화되었습니다. 그들은 온전하고 둥글고 잘 분리된 것처럼 보였습니다. 중요한 것은 핵 응집이 없었다는 것입니다.
HEX 형광 신호의 존재에 게이팅하여 절연 된 핵의 농축은 유동 세포측정으로 수행되었다. 얼룩진 핵은 배경 형광을 표시하고 스테인드 핵은 강한 형광 신호를 나타냈다. 얼룩이 없는 핵은 보라색 채널에서 잘 분리되었다.
이 프로토콜을 시도하는 동안 단일 핵이 플라스틱 물질에 달라붙는 경향이 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 핵의 잠재적 손실을 방지하고 효율성을 높이기 위해 플라스틱 재료의 기본 코팅을 적극 권장합니다. 단하나 핵현탁액은 단일 핵 RNA를 위해 더 활용될 수 있고 이 기술은 복잡한 생물학적 시스템에서 세포 이질성을 해명하고 세포 아류형 및 유전자 네트워크를 정의하는 데 도움이 된다.
세제 및 효소 가 없는 방법을 사용하여 시료 준비 중에 도입된 기술적 소음과 편견을 등록합니다. 이 방법은 단순화되고 물류적인 단일 핵 절연을 개발했습니다.
