이 작업은 NIH 보조금 P20 GM109098과 Praespero에서 Edwin Wan까지의 혁신 상 프로그램에 의해 지원되었습니다. 유세포 측정 실험은 NIH grants S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 및 P20 GM103434에 의해 지원되는 WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility에서 수행되었습니다.

수행 된 모든 프로토콜과 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 마우스는 웨스트버지니아 대학교의 vivarium에서 특이적-병원체-비함유 조건 하에 수용되었다.
1. 용액의 제조
<ol><li>관류 완충액(인산완충식염수, PBS)을 준비한다. 마우스 당 약 두 개의 얼음처럼 차가운 PBS 분취량을 사용하십시오.</li>
	<li>폐 세포 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오. FACS 완충액은 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 PBS를 함유한다. 폐 절제와 이동의 전체 과정을 위해 중간 정도를 차갑게 유지하십시오. 폐 샘플 당 약 8 mL를 준비하십시오. 실험 전에 신선한 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오.</li>
	<li>단일 세포 분리를 위해 해리 완충액을 준비하십시오. 완충액은 행크의 완충 염 용액(HBSS)에 1mg/mL 콜라게나제 D와 200μg/mL DNase I을 함유한다. 실험 전에 원액 (100 mg / mL 콜라게나제 D 및 10 mg / mL DNase I)에서 신선하게 준비하십시오. 폐 샘플 당 약 6 mL가 필요합니다. 사용하기 전에 버퍼가 실온에 도달하는지 확인하십시오.</li>
	<li>폐 조직 균질화를 위한 균질화 완충액을 준비한다. 완충액은 PBS 및 1x 프로테이나제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유한다(스톡=100x). 실험 전에 신선하게 준비하십시오. 전체 균질화 과정 동안 버퍼를 차갑게 유지하십시오. 대략 200 μL의 완충제는 폐의 단일 우로브를 균질화하기에 충분하다.</li>
</ol>2. 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 (tMCAO)
참고: 중간 대뇌 동맥에 모노필라멘트 삽입을 통한 tMCAO에 대한 절차는 이전에10에 상세히 문서화되었다. 이들 실험에서, 25-30 g의 체중을 갖는 8-12주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.
<ol><li>간단히 말해서, 수술 전에 마우스에 2 mg / kg 멜록시캄을 피하 투여하십시오. 마우스를 5% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 깊이 마취시킨다. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오. 코 콘을 사용하여 수술 중에 1-2 % 이소 플루란으로 마취를 유지하십시오. 마우스 아래에 따뜻한 담요를 놓아 시술 내내 체온을 36.5 - 38 °C로 유지하십시오. 모든 수술 도구는 수술 하루 전에 오토클레이브 살균해야합니다.</li>
	<li>면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 복부 목의 피부를 준비한 다음 클로르헥시딘 스크럽을 준비하십시오. 첫 번째 절개를하기 전에 절개 부위에 2mg / kg bupivacaine을 피하 투여하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈을 가리기 위해 눈 연고를 사용하십시오. 중간 선 목 절개를하십시오. 기관 주위의 연조직을 부드럽게 당겨 내립니다.</li>
	<li>왼쪽 일반적인 경동맥과 외부 경동맥을 확인하십시오.</li>
	<li>혈액의 흐름을 막기 위해 일반적인 경동맥에 임시 봉합사 (크기 6/0)를 적용하십시오. 외부 경동맥을 절개하십시오.</li>
	<li>실리콘 고무 코팅 모노필라멘트(크기 6-0)를 외부 경동맥에 삽입한 다음, 모노필라멘트를 중간 대뇌 동맥으로 전진시킨다. 모노 필라멘트를 중간 대뇌 동맥에 60 분 동안 두십시오 (폐색).</li>
	<li>레이저 도플러 유량계를 사용하여 혈류 속도를 모니터링합니다. 중간 대뇌 동맥으로의 유속의 감소가 > 80%는 성공적인 폐색을 나타낸다.</li>
	<li>60분의 폐색 후, 모노필라멘트를 제거하여 재관류가 일어나도록 한다. 절개를 닫습니다.</li>
	<li>가짜 조작된 마우스에서, 모노필라멘트의 삽입 없이 단계 2.1-2.6을 수행한다. 이 생쥐에서 혈류 속도는 전체 절차 중에 일정하게 유지되어야합니다.</li>
	<li>매일 마우스를 모니터하고 표준 채점 기준11을 사용하여 신경 학적 결핍을 측정하십시오. 0 – 신경 학적 결손 없음; 1 – 꼬리에 의해 들어 올릴 때 반대쪽 앞발을 철회; 2- 꼬리에 의해 들어 올릴 때 대측으로 원; 3- 걷는 동안 대측으로 떨어지는 것; 4 – 자발적으로 걷지 않거나 혼수 상태; 5 - 죽었어.</li>
	<li>수술 후 3 일 동안 24 시간마다 정상 식염수와 진통제 (meloxicam, 2 mg / kg)를 피하 주사하십시오.</li>
	<li>하류 분석을 위해 tMCAO 후 24 및 72 h 후에 폐를 분리한다.</li>
</ol>3. 폐 조직 수확
<ol><li>100 mg / kg의 케타민과 10 mg / kg의 자일라진 주사를 복강 내 (i.p.) 주사하여 마우스를 깊이 마취하십시오. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오.</li>
	<li>전신 심질 관류(12)를 수행하기 위해, 마우스를 수술 플랫폼에 고정하고 70% 에탄올로 모피를 적셔 체강 내로의 모피 분포를 감소시킨다. 미세한 해부 가위를 사용하여 꼬리 복부를 가로 절개 한 다음 복막의 중간 선 절개를 만들어 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈 춥니 다.<ol><li>근육을 통해 자르지 말고 복강으로 숨어 복부를 절개하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>횡격막에 구멍을 뚫기 전에 흉강에 도달하자마자 절개를 중단하십시오. 관류 품질 또는 세포 회복을 저해 할 수있는 심장과 폐를 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈추는 복막의 중간 선 절개를 만듭니다.</li>
	<li>포셉을 사용하여 흉골의 원위 끝으로 마우스를 잡고 횡격막을 절단하면서 위쪽으로 들어 올려 심장, 폐 또는 혈관 조직을 손상시키지 않도록하십시오. 장기가 보이면 흉곽을 통해 절개를하고 흉곽 케이스를 분리하고 핀으로 고정하여 심장과 폐가 완전히 노출되도록하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 대동맥 아치 근처의 오른쪽 심방에서 작은 절개를하십시오. 이것은 관류를위한 유출 역할을 할 것입니다.</li>
	<li>그 직후, 차가운 PBS 10 mL로 채워진 주사기에 부착된 25 G x 5/8 바늘을 좌심실의 원위 우량한 표면 내로 부드럽게 삽입한다. 심실 중격을 통해 우심실에 삽입하지 않도록주의하십시오. 바늘은 좌심실에 간신히 삽입해야합니다. 참고 : 심실 중격이 뚫리면 마우스의 코에서 액체가 흘러 나옵니다. 이것은 관류 품질을 감소시키고 세포 손실을 초래할 것이다.</li>
	<li>원하는 경우, 관류 동안 좌심실 내의 제자리에 바늘을 단단히 고정시키기 위해 클램프를 사용할 수 있다.</li>
	<li>차가운 PBS 10 mL를 꾸준히 부드럽게 밀어 넣는다. 마우스 조직은 유체가 오른쪽 심방에서 빠져 나올 때 혈액을 관류하고 제거해야합니다.<ol><li>충분한 혈액 클리어런스가 발생할 때까지 PBS 10 mL의 두 번째 분취량을 밀어 넣습니다. 간은 밝은 갈색으로 보이고 폐는 붉은 분홍색에서 대부분 흰색으로 변합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>포셉과 미세 해부 가위를 사용하여 심장, 기관, 식도, 흉선, 결합 조직, 림프절 및 대형 기관지를 포함한 모든 주변 조직을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>개별 폐 엽을 분리하고 엽을 차가운 폐 세포 배지의 1-2 mL 분취량을 함유하는 얼음 위에 페트리 접시에 넣는다.</li>
</ol>4. 비드 호모게나이저를 이용한 멀티플렉스 비드 어레이용 폐 조직의 균질화
<ol><li>멸균 2.3mm 지르코니아/실리카 비드 3개가 들어 있는 2mL 원뿔형 스크류 캡 튜브를 미리 식히십시오. 200 μL의 차가운 균질화 완충액을 튜브에 첨가한다.</li>
	<li>엽을 계량하고, 로브를 비드 및 균질화 완충액을 함유하는 미리 냉각된 원뿔형 튜브로 옮긴다. 참고: 200 μL의 완충액에서 균질화된 대략 50-100 mg의 조직은 샘플에서 사이토카인 및 케모카인 발현을 검출하기에 충분할 것이다.<ol><li>비드계 호모게나이저(표 표 참조)를 사용하여 로브를 4,000 rpm에서 2분 동안 균질화한다.</li>
		<li>조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 시간을 늘리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>균질화 후, 튜브를 3분 동안 15,870 x g 에서 미리 냉각된 (4°C) 마이크로원심분리기에서 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로튜브로 옮긴다.</li>
	<li>샘플을 즉시 사용하기 위해 얼음 위에 직접 놓거나 나중에 사용하기 위해 샘플을 -80°C에 보관하십시오. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.</li>
</ol>5. 폐 조직 해리 및 단일 세포 분리
<ol><li>해리 완충액의 희석을 피하기 위해 나머지 폐 엽의 폐 세포 배지를 붓는다. 그런 다음, 해리 완충액 1mL를 함유하는 25G 및 5/8 바늘이 있는 1 mL 주사기를 폐 조직에 조심스럽게 삽입한다.</li>
	<li>해리 버퍼의 작은 분획 (약 1/4~ 1/5th)을 각 폐 엽에 주입하고 부드럽게 팽창시킵니다. 참고 : 대부분의 버퍼는 엽이 절제됨에 따라 팽창 한 직후에 급히 빠져 나옵니다.</li>
	<li>해리 버퍼 1-2x의 주입을 반복하십시오.</li>
	<li>폐 엽을 실온에서 2분 동안 해리 완충액으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 폐 엽을 작은 조각으로 잘게 다듬습니다.</li>
	<li>다진 폐 조각을 해리 완충액과 함께 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.  추가 해리 완충액을 총 6 mL로 보충하십시오. 1 분 동안 격렬하게 소용돌이.</li>
	<li>샘플을 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다. 소용돌이는 7-8 분마다 격렬하게 소용돌이친다.</li>
	<li>45분 인큐베이션 후, 최적의 결과를 위해 샘플을 1분 동안 격렬하게 와류시킨다.</li>
	<li>샘플을 100 μm 세포 스트레이너를 통과시켜 잔존, 바람직하지 않은 결합 및 간질성 조직을 제거함으로써 샘플을 더욱 해리시킨다.</li>
	<li>샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>차가운 폐 세포 배지 5 mL를 샘플에 첨가한다. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
	<li>샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>차가운 폐 세포 배지 1 mL를 첨가하십시오. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
	<li>100 μm 세포 스트레이너를 통과시키고, 세포를 계수한다.</li>
</ol>6. 폐 면역 세포 틈새 시장에 대한 유세포 분석
<ol><li>시드 1-2 x 106 세포 / 항체를 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (총 3 세트)에 설정합니다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 펠릿을 고정가능한 생/사 얼룩을 함유하는 50 μL의 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 얼룩을 준비하십시오.</li>
	<li>세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 펠렛을 5 μg/mL의 항-마우스 CD16/32 항체를 함유하는 25μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 4°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>표 1에 열거된 항체 조합을 함유하는 25 μL의 차가운 FACS 완충액을 세포에 첨가한다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오. 참고: 항체 염색을 위한 FACS 완충액의 총 부피는 50 μL이다. 따라서, 항체의 마스터 믹스를 25 μL로 제조할 때, 항체의 농도는 최종 농도의 두 배가 되어야 한다.</li>
	<li>세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 150 μL의 추가 FAC 완충액을 함유하는 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 옮긴다. 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 즉시 분석하십시오. 참고: 다음 단계를 사용한 셀 고정을 통해 나중에 샘플을 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>단계 6.7.에 이어서, 샘플을 PBS 중의 1% 파라포름알데히드의 100 μL로 재현탁시켰다.</li>
	<li>샘플을 빛으로부터 보호된 15분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 4°C에서 저장하고, 빛으로부터 보호한다. 72 h 이내에 샘플을 분석하십시오.</li>
</ol>7. 사이토카인 및 케모카인 검출을 위한 멀티플렉스 비드 어레이
참고: 상업적으로 입수가능한 전염증성 케모카인 및 염증 멀티플렉스 패널( 표 참조)은 제조자 프로토콜에 따라 tMCAO 유도에 따라 폐에서 케모카인 및 사이토카인의 발현을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는도 13에 상세히 기술되어 있다.
<ol><li>간단히 말해서, 분석물을 얼음 상에서 해동시키면 조직 균질화 후 -80°C에서 보관하였다. 샘플을 사용하기 전에 4°C에서 2분 동안 590 x g 에서 원심분리하여 임의의 잔류 조직을 제거하였다.</li>
	<li>10ng/mL의 알려진 농도에 있는 표준 칵테일(C7)을 7개의 표준(C1-6)으로 연속적으로 희석하여 표준 곡선을 생성하고, 마지막 표준은 분석 버퍼 단독(C0)입니다.</li>
	<li>모든 시약을 실온으로 가온한 후, 각 표준 25μL와 분석 완충액 25μL를 V 하부 96웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>각 샘플 웰에 25 μL의 폐 균질물 (분석물) 및 25 μL의 분석 완충액을 V 하부 96 웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>예비코팅된 비드를 격렬하게 볼텍스한 다음, 25μL의 예비코팅된 비드를 각각의 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.</li>
	<li>플레이트를 밀봉하고 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 110 rpm으로 흔들었다.</li>
	<li>230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 1x에서 세척 완충액 200μL를 첨가한다(원액은 20x, 물로 1x로 희석). 1분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 표준 및 샘플을 25 μL 검출 항체로 재현탁시킨다.</li>
	<li>빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 플레이트를 실온에서 1 h 동안 110 rpm으로 진탕한다.</li>
	<li>25 μL의 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE)을 각 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.</li>
	<li>빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 실온에서 30분 동안 110rpm으로 흔들어 주십시오.</li>
	<li>플레이트를 230 x g 에서 5분 동안 회전시킨다. 표준 및 샘플을 1x 세척 완충액에 재현탁한다.</li>
	<li>웰 라벨링된 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 150 μL의 1x 세척 완충액을 추가로 함유한다.</li>
	<li>유세포 분석기를 사용하여 표준 및 샘플에 대한 PE 신호 형광 강도를 결정한다.</li>
	<li>미리 결정된 농도에 대해 PE의 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인에 대한 표준 곡선을 구성한다.</li>
	<li>각 샘플로부터의 표준 곡선 및 MFI를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인의 농도를 결정한다. 멀티플렉스 패널은 각 분석물의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있는 데이터 분석 소프트웨어를 제공합니다. apical/superior lobe의 무게는 조직의 밀리그램 당 사이토카인 또는 케모카인의 농도를 결정하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lloyd, C. M., Marsland, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+Homeostasis:+Influence+of+Age,+Microbes,+and+the+Immune+System.">Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System.</a> Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).</li><li>Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+Macrophages+in+the+Resolution+of+Inflammation,+Tissue+Repair,+and+Tolerance+to+Infection.">Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).</li><li>Hartl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immunity+of+the+Lung:+From+Basic+Mechanisms+to+Translational+Medicine.">Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine.</a> Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).</li><li>Prass, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke-induced+immunodeficiency+promotes+spontaneous+bacterial+infections+and+is+mediated+by+sympathetic+activation+reversal+by+poststroke+T+helper+cell+type+1-like+immunostimulation.">Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).</li><li>Smith, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+receptor+antagonist+reverses+stroke-associated+peripheral+immune+suppression.">Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression.</a> Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).</li><li>McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic-mediated+loss+of+splenic+marginal+zone+B+cells+contributes+to+infection+susceptibility+after+stroke.">Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke.</a> Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).</li><li>Dames, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+treatment+with+systemic+GM-CSF+augments+pulmonary+immune+responses+and+improves+neurological+outcome+after+experimental+stroke.">Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke.</a> Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).</li><li>Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+CD147+Attenuates+Stroke-Associated+Pneumonia+Through+Modulating+Lung+Immune+Response+in+Mice.">Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice.</a> Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues.">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+intraluminal+MCAO:+cerebral+infarct+evaluation+by+cresyl+violet+staining.">Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).</li><li>Farris, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+alters+immune+cell+niche+and+chemokine+profile+in+mice+independent+of+spontaneous+bacterial+infection.">Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection.</a> Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Cytokine+Profiling+of+Stimulated+Mouse+Splenocytes+Using+a+Cytometric+Bead-based+Immunoassay+Platform.">Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).</li><li>Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+Monocyte-Derived+Antigen-Presenting+Cells+Have+Distinct+Gene+Signatures+in+Experimental+Model+of+Multiple+Sclerosis.">Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).</li><li>Zhai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+to+prepare+a+single+cell+suspension+of+isolated+quiescent+human+hepatic+stellate+cells.">A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells.</a> Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).</li><li>Platzer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-bound+IgE+functions+to+restrain+allergic+inflammation+at+mucosal+sites.">Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy1+IL-7++lymphatic+endothelial+cells+in+iBALT+provide+a+survival+niche+for+memory+T-helper+cells+in+allergic+airway+inflammation.">Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).</li><li>Nakahashi-Oda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+epithelial+cells+control+the+abundance+of+Treg+cells+at+barrier+surfaces.">Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces.</a> Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).</li><li>Barrott, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+synovial+sarcoma+metastasis+in+the+mouse:+PI3'-lipid+signaling+and+inflammation.">Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).</li><li>Bout&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C3HeB/FeJ+mouse+model+recapitulates+the+hallmark+of+bovine+tuberculosis+lung+lesions+following+Mycobacterium+bovis+aerogenous+infection.">The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection.</a> Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).</li><li>Bal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1&#946;,+IL-4+and+IL-12+control+the+fate+of+group+2+innate+lymphoid+cells+in+human+airway+inflammation+in+the+lungs.">IL-1&#946;, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 기술된 프로토콜은 폐 면역 세포 유형의 확인 및 동일한 마우스에서 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 허용한다. 조직병리학 연구가 바람직한 경우, 단일 세포 분리 단계로 진행하기 전에 개별 엽을 제거하고 그 목적을 위해 고정시킬 수 있다. 이 방법의 한 가지 한계는 면역 세포 조성의 변화와 케모카인 및/또는 사이토카인의 발현이 폐의 상이한 엽 사이에 불평등하게 분포될 것으로 ?...

폐는 외부 환경에 노출되는 장벽 기관이므로 병원균 및 알레르겐1과 같은 면역 학적 도전을 끊임없이 받고 있습니다. 폐 거주 면역 세포의 활성화와 주변부에서 면역 세포의 침윤은 폐 환경에서 병원균을 제거해야합니다. 또한, 폐에 거주하는 면역 세포는 공생 박테리아에 대한 내성을 유지하며, 이는 이들 세포가 병원균 제거 및 항상성 유지에 중요한 역할을한다는 것을 암시합니다1. 폐포 및 간질성 대식세포는 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 감지하고 식균작용에 의해 이러한 병원체를 제거하는 폐 상주 감시자 면역 세포 중하나입니다 2. 폐-상주 수지상 세포는 항원 제시3을 통해 선천적 및 적응성 면역 반응을 연결한다. 또한, 활성화된 국소 선천적 면역 세포는 염증 반응을 증폭시키고 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 폐로의 침윤을 자극하는 사이토카인 및 케모카인을 생성한다1. 허혈성 뇌졸중은 전신 면역을 변형시키고 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 폐 구획을 평가 한 연구는 거의 없지만 일부 연구는 염증 상태 4,5,6,7,8,9 동안이를 조사했습니다. 본원에 기재된 방법의 목표는 폐 병리, 면역 세포 조성물, 폐에서의 사이토카인 및 케모카인 발현의 수준을 동시에 결정하여 폐 구획에 대한 변경을 평가하고 허혈성 발작 후 폐 면역 반응에 대한 잠재적 변화를 평가하는 것이다.
여기에 기재된 것은 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 마우스의 폐로부터 단일 세포 현탁액을 수득하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 자동화된 조직 해리제가 필요 없이 콜라게나제 D를 사용한 조직 소화를 기반으로 합니다. 추가적으로, 우리는 유세포 분석기 기반 멀티플렉스 비드 어레이를 사용하여 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 조직 균질물을 제조하기 위한 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중이 폐 면역에 미치는 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었으며 다른 질병 모델에서도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>B220-APC, clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Beadbug 3 position bead homogenizer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>D1030</td><td>Tissue homogenizer</td></tr><tr><td>CCR2-BV421, clone SA203G11</td><td>Biolegend</td><td>150605</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD103-BV421, clone 2E7</td><td>Biolegend</td><td>121422</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD11b-PE/Cy7, clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>1:400 dilution</td></tr><tr><td>CD11c-PE/Cy7, clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD4-BV421, clone GK1.5</td><td>Biolegend</td><td>100443</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD45-FITC, clone 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103108</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD64-APC, clone X54-5/7.1</td><td>Biolegend</td><td>139306</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD8-PE, clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100708</td><td>1:800 dilution</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td>Component in the dissociation buffer</td></tr><tr><td>Conical screw cap tube</td><td>ThermoFisher</td><td>02-681-344</td><td>Tube for tissue homogenization</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td>Component in the dissociation buffer</td></tr><tr><td>Fc block CD16/32 antibody</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>genlteMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator</td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator</td></tr><tr><td>Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial</td><td>ThermoFisher</td><td>78442</td><td>Component in the homogenization buffer</td></tr><tr><td>Laser doppler monitor</td><td>Moor</td><td>MOORVMS-LDF</td><td>Blood flow monitoring during tMCAO</td></tr><tr><td>LEGENDplex proinflammatory chemokine panel</td><td>Biolegend</td><td>740451</td><td>Multiplex bead array</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable near-IR stain</td><td>ThermoFisher</td><td>L34976</td><td>Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis</td></tr><tr><td>Ly6C-PE, clone HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128008</td><td>1:800 dilution</td></tr><tr><td>Ly6G-BV510, clone 1A8</td><td>Biolegend</td><td>127633</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>MCAO suture L56 reusable 6-0 medium</td><td>Doccol</td><td>602356PK10Re</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>MHC II-BV510, clone M5/114.15.2</td><td>Biolegend</td><td>107636</td><td>1:800 dilution</td></tr><tr><td>NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108728</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Siglec F-PE, clone E50-2440</td><td>BD Biosciences</td><td>552126</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Silk suture thread, size 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>SomnoSuite anesthesia system</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Mouse anaesthetization for tMCAO</td></tr><tr><td>TCRb-BV510, clone H57-897</td><td>Biolegend</td><td>109234</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Zirconia/silica beads, 2.3 mm</td><td>Biospec</td><td>11079125z</td><td>Beads for tissue homogenization</td></tr></tbody></table>

characterization of immune cells and proinflammatory mediators in the pulmonary environment

면역 세포 확장, 활성화 및 여러 사이토카인 및 케모카인의 발현에 의해 조절되는 폐로의 밀매는 심각한 뇌 손상에 의해 변경될 수 있다. 이것은 폐렴이 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자의 주요 사망 원인이라는 사실에 의해 입증됩니다. 이 프로토콜의 목표는 폐포 대식세포, 간질성 대식세포, CD103+ 또는 CD11b+ 수지상 세포(DCs), 혈장 세포질 DCs, 호산구, 단핵구/단핵구 유래 세포, 호중구, 림프구 유래 T 및 B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 마우스의 폐에서 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 다색 유세포 분석의 사용을 설명하는 것이며, 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색에 의한 허혈성 뇌졸중 유도에 이른다. 더욱이, 우리는 비드 균질화 방법을 사용하여 폐 균질액의 제조를 기술하고, 유세포 분석과 결합된 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 동시에 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정한다. 이 프로토콜은 또한 감염성 폐 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 다른 질병 설정에서 폐 면역 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

우리는 최근에 마우스에서 허혈성 뇌졸중 유도가 폐11의 면역 세포 조성을 변화시킨다고보고했다. 구체적으로, 일과성 뇌 허혈은 폐포 대식세포, 호중구 및 CD11b+ DC의 백분율을 증가시켰고, 폐 구획에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 호산구의 백분율을 감소시켰다. 또한, 세포 변화는 폐에서 여러 케모카인의 상당히 감소된 수준에 상응했다. 여기에 기재된 것은 폐 구?...

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Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

characterization-immune-cells-proinflammatory-mediators-pulmonary

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.2K 조회수.  West Virginia University. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

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Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

연구

면역학 및 감염병학

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models of ALI are key in enhancing our understanding of disease pathogenesis. Lipopolysaccharide (LPS) derived from gram positive bacteria induces neutrophilic inflammation in the airways and lung parenchyma of mice. Efficient pulmonary delivery of compounds such as LPS is, however, difficult to achieve. In the approach described here, pulmonary delivery in mice is achieved by challenge to aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS. Dissolved LPS was aerosolized by a nebulizer connected to compressed air. Mice were exposed to a continuous flow of LPS aerosol in a Plexiglas box for 10 min, followed by 2 min conditioning after the aerosol was discontinued. Tracheal intubation and subsequent bronchoalveolar lavage, followed by formalin perfusion was next performed, which allows for characterization of the sterile pulmonary inflammation. Aerosolized LPS generates a pulmonary inflammation characterized by alveolar neutrophilia, detected in bronchoalveolar lavage and by histological assessment. This technique can be set up at a small cost with few appliances, and requires minimal training and expertise. The exposure system can thus be routinely performed at any laboratory, with the potential to enhance our understanding of lung pathology.

We describe a method for inducing neutrophilic pulmonary inflammation by challenge to aerosolized lipopolysaccharide by nebulization, to model acute lung injury. In addition, basic surgical techniques for lung isolation, tracheal intubation and bronchoalveolar lavage are also described.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses and microbial substances that induce innate immune responses. These allergen-associated microbial components play an important role in regulating the development of type 2 inflammatory conditions such as allergic asthma. However, the underlying mechanisms remain largely undefined. The protocol presented here determines the structural characteristics and in vivo activity of allergen-associated immunostimulatory RNA. Specifically, common allergens are examined for the presence of double-stranded RNA (dsRNA) species that can stimulate IFN responses in lungs and restrain&#160;the development of severe lung eosinophilia in a mouse model of HDM-induced allergic asthma. Here, we have included the following three assays: Dot blot to show the dsRNA structures in total RNA isolated from allergens including HDM species, RT-qPCR to measure the activities of HDM RNA in interferon stimulating genes (ISGs) expression in mouse lungs and FACS analysis to determine the effects of HDM RNA on the number of eosinophils in BAL and lung, respectively.

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) often contain microbial substances that activate innate immune responses to regulate allergic inflammation. The protocol presented here demonstrates the identification of dsRNA species in HDM allergens and characterization of their immunogenic activities in modulating eosinophilic lung inflammation.

호산성 폐 염증을 조절하는 HDM 알레르겐의 면역원성 RNA 종의 식별 및 특성화

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

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Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

의학

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...