이 프로토콜에 설명된 실험 장비의 일부에 대한 액세스를 제공한 Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC)에 감사드립니다. 이 작품은 포르투갈 과학기술재단(FCT), 리스보아-01-0145-FEDER-007660에 의해 지원되었다. PTDC/NEU-NMC/2459/2014, IF/00697/2014, 라 카이사 HR17-00595 ~ PMD, 호주 연구위원회 미래 펠로우십(FT170100259)이 CKM에 있습니다.

1. 자당 효모 (SY) 다이어트의 준비
<ol><li>다량 영양소 균형과 L3 양육 다이어트에 대한 모든 건조 성분 (한천, 효모, 자당)의 무게. 1L의 식품을 준비하는 데 필요한 각 성분에 대한 그램의 양은 도 1B로표시됩니다. 참고: 60mm 페트리 접시를 채우기 위해서는 약 13mL의 음식이 필요하다는 점을 고려하십시오.</li>
	<li>모든 성분을 멸균 증류수(식품 준비에 필요한 총 물량의 약 50%를 사용)에 녹여 5-10분 동안 배지를 저어줍니다.</li>
	<li>50 분 동안 자동 클라브.</li>
	<li>매체가 식히는 것을 허용한 후에, 규정식에 니파진 과 선전 산 용액을, 3%와 0.3%의 최종 농도 (v/v)에 각각 추가하십시오. 다량 영양소 균형 식단에 1 %의 최종 농도 (v /v)에 파란색 식품 염료를 추가하십시오. 증류수로 총 볼륨을 완성합니다.</li>
	<li>60mm 페트리 접시에 음식 식단을 조심스럽게 붓기 때문에 부어 넣은 음식의 양은 각 접시에 거의 동일합니다. 식단의 P:C 비율로 접시에 라벨을 붙입니다. 참고: 수유 분석 당일 다량 영양소 균형 식단을 준비합니다. 가능하지 않은 경우, 준비된 식단을 밀봉 된 용기에 4 °C에서 최대 3 일 동안 보관하십시오. 저장 기간이 길수록 식단이 너무 건조하고 단단하게 변하며 애벌레는 배지에 잠복할 수 없습니다.</li>
</ol>2. 부모의 라인의 유전 십자가
참고: Gal4/UAS시스템(21)을 사용하여 유전적 십자가를 설정합니다. 본 프로토콜에서, 특정 신경 인구에서 신경 기능을 활성화하기 위해, UAS dTRPA1 선17의 여성 처녀가 사용되고 Janelia Gal4 라인(그림 2A)에서남성에게 교차하였다. 사용된 유전 제어는 dTRPA1 선과 루빈 Gal4 수집을 생성하는 데 사용되는 벡터에 Gal4를 운반하는 "빈 GAL4" 라인 사이의 십자가의 자손이지만 규제 조각이 존재하지 않는 (attP2)22. 신경 억제를 촉진하기 위해, DTRPA1 대신 ShibireTS20을 인코딩하는 UAS 라인을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>L3 양육 다이어트 플레이트와 함께 60mm 배아 수집 케이지를 설치하고 활성 효모 페이스트를 보충합니다.</li>
	<li>성인 UAS dTRPA1 여성 처녀와 Janelia Gal4 남성, 5-8 일 세, 배아 수집 케이지에 24-48 h, 25 °C에서, 60 % 습도 와 12:12 밝은 어두운 주기(그림 2A). 60mm 배아 수집 케이지의 경우, 약 100 처녀 암컷과 십자가 당 30 남성을 사용합니다.</li>
	<li>짝짓기 기간이 끝나면 유전 적 십자가에 사용되는 L3 양육 다이어트 플레이트를 제거하고 폐기하십시오. 계란 평지와 애벌레 준비를 수행하기 위해 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트를 대체합니다.</li>
</ol>3. 제3성 애벌레준비 (L3)
<ol><li>짝짓기 성인 파리를 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트로 옮기고 25°C(도2B)에서3-4h동안 계란 누워가 발생할 수 있도록 한다. 모든 플레이트가 유전자형, P:C 비율의 식이요법과 달걀 누워서 표시되어 있는지 확인하십시오. 참고: 시간을 절약하려면 계란을 추가로 취급하지 않는 L3 양육 식단에 직접 계란 을 놓습니다. 소규모 유전 적 스크리닝의 경우 사과 주스 천판을 사용하여 계란 누워의 최적화를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>계란 누워 기간의 끝에서, 케이지에서 접시를 제거하고 플라스틱 뚜껑으로 덮습니다. 효모 추출물이 L3 양육 판을 보충하는 데 사용되는 경우, 계란 누워의 끝에 있는 모든 잔류 효모를 제거하십시오. 이것은 애벌레 성장 도중 비 균일한 공급을 피하기 위하여 중요합니다. 참고 : 짝짓기 성인은 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트로 옮길 수 있으므로 더 많은 계란 낳기를 수행하고 더 많은 실험적 애벌레를 얻을 수 있습니다. 연속 계란 평신도는 한 주 동안 같은 성인과 함께 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>접시당 계란 수를 추정하고 접시 당 최대 200 배아에 애벌레 밀도를 유지합니다. 이 추정은 플레이트의 1 분기에 있는 배아의 수를 계산하여 행해질 수 있습니다. 참고: 과밀한 접시는 애벌레 발달을 지연시키고 애벌레 먹이 주기 행동에 영향을 미칩니다.</li>
	<li>L3 양육 플레이트를 18°C(허용 온도), 60% 습도 및 12:12 광어두운 사이클로 배양하고 유충이 9일 동안 성장할 수 있도록합니다(그림 2B).</li>
	<li>계란 누워 후 9 일째에 (AEL), 각 유전자형에서 10 L3의 세 그룹을 수집 (및 복제에 대한) 테스트할 수 있습니다. 또한 "제로 염료 식품"제어를 위해 10 L3그룹을 수집합니다. 애벌레 수집은 계란 누워를 수행하는 데 사용되는 하루의 동등한 기간 동안 수행되도록 (예를 들어, 계란 누워가 오전 10시에서 오후 2시 사이에 발생하는 경우, 같은 기간 동안 애벌레를 수집 9 일 AEL) 가능한 한 부드럽게 수행, 포셉 #5 또는 페더급 포셉을 사용하여. 다음 단계(3.6)에 표시된 대로 애벌레를 직접 이송합니다. 참고 : "제로 염료 식품"제어 동물은 먹이 분석에서 청색 염료없이 음식을 제공하는 애벌레입니다. 이 제어는 th 애벌레 추출물의 배경 흡광도를 제거하는 것이 필수적입니다.</li>
	<li>수집된 실험유충을 1mL의 물을 포함하는 플라스틱 접시 무게 보트로 옮는다. 그림 3에주어진 방향을 따라 L3가 아니라 L2가 아닌 수집되는지 확인합니다. 참고: L3를 물 또는 1x 인산염 완충식식염(PBS)이 함유한 플라스틱 보트에 대한 컬렉션은 먹이 주기 분석이 시작되기 전에 유충을 잘 수분을 유지하는 것이 중요합니다. 이것은 다른 유전자형에서 몇몇 실험 L3 단이 동시에 집합되는 경우에 특히 중요합니다. 각 그룹에 대한 수집 순서를 추적하므로 각 그룹에 대한 음식 박탈 기간의 차이는 최소화됩니다. 이 단계에서 플라스틱 보트를 사용하면 애벌레가 수조에 직접 떠들어갈 수 있으므로 4.3 단계의 선택적 단계를 용이하게합니다.</li>
</ol>4. 열유전학 활성화 및 선택없는 수유 분석
참고: circadian 리듬과 관련된 가능한 변화를 최소화하기 위해 하루 중 거의 같은 시간에 수유 방법을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 항상 제어 실험("빈 Gal4" 선의 자손은 UAS dTRPA1 및 "제로 염료 식품" 애벌레로 넘어간)을 관심 있는 유전자형과 병행하여 실행합니다.
<ol><li>인큐베이터를 30°C(비허용 온도)로 설정하고 높은 수준의 습도(최소 65%)를 유지합니다. 분석 중에 유충 탈수를 피하십시오.</li>
	<li>수유 분석서를 시작하기 전에 30°C에서 30분 동안 따뜻하게 하여 분석 플레이트의 온도를 상량화합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 37° C 수조에서 2분 동안 실험유충을 열쇼크. 일부 물을 포함하는 플라스틱 무게 보트에서 동물과 함께이 단계를 수행합니다. 참고: 이 단계의 목적은 수유 분석의 시작부터 뉴런의 발사를 촉진하여 뉴런 활성화를 강화하는 것입니다.</li>
	<li>1h 준비된 여러 타이머를 설정합니다. 사용할 타이머수는 테스트 중인 실험 그룹의 수와 애벌레 처리에 대한 실험자의 숙련도 수준에 따라 달라집니다. 참고: 여러 타이머의 사용은 모든 유전자형에 대해 분석 의 지속 시간을 일관되게 유지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>플라스틱 보트에서 물을 조심스럽게 배출하고, 촉촉한 부드러운 브러시를 사용하여, 부드럽게 분석 판의 중심으로 보트에서 L3 그룹을 전송합니다. 플레이트의 뚜껑을 뒤로 하고 정확한 1h 급식 세션을 유지하기 위해 각 플레이트(또는 플레이트 그룹)에 대한 타이머를 시작합니다.</li>
	<li>애벌레가 30°C에서 1시간 동안 먹이를 주도록 허용한다(도2C). 참고: 어둠 속에서 분석의 성능다이어트는 같은 염료 농도를 포함 하더라도 톤이 다를 것이기 때문에 식단 전반에 걸친 시각적 단서의 차이를 제어하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>접시를 얼음 욕조로 옮기면 먹이 주기 분석서를 중지하십시오. 가능한 한 얼음을 눌러 플레이트에 안정적인 표면을 제공합니다. 참고: 추운 온도는 잠복 및 굴착 행동을 억제하여 수유의 끝을 촉진합니다. 애벌레의 대부분은 몇 분 후에 음식 접시를 표면화하고 다음 단계에서 회복을 촉진합니다.</li>
</ol>5. 식품 염료 추출
<ol><li>테스트된 10L3의 각 그룹에 대해 2mL 마이크로튜브를 준비하여 약 0.5mm 유리 구슬(마이크로튜브의 바닥 부분을 채우기에 충분함)과 300 μL의 얼음-차가운 메탄올을 함유하고 있습니다. 벤치 쿨러를 사용하여 마이크로 튜브를 추위에 유지합니다. 주의: 메탄올은 인화성이 높고 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 지역에서 작업하고 니트릴 장갑을 착용하는 등 이 시약을 처리하는 데 권장되는 모든 안전 절차를 따르십시오. 참고: 메탄올의 사용은 애벌레 샘플을 고치고 큐티클에서 멜라늄화 반응을 피하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>#5 또는 페더급 집게를 사용하여, 조심스럽게 먹이 분석 플레이트에서 10 L3의 그룹을 복구하고 일부 물을 포함하는 분석 판의 뚜껑으로 전송. 유충을 헹구고 몸에 있는 음식 파편을 제거하면서 유충을 부드럽게 다루어 부상을 피하십시오. 복제당 각 유전자형에 대해 회수된 애벌레의 수에 대한 기록을 보관하여 애벌레당 평균 양의 음식 섭취량을 정량화할 수 있도록 하십시오. 참고 : 부상당한 애벌레는 피부색을 혼합하여 착색 정량화에 적합하지 않을 수 있기 때문에 버려야합니다.</li>
	<li>L3 그룹을 5.1로 제조된 2mL 마이크로튜브로 전송합니다.</li>
	<li>애벌레 조직을 lyse하여 5.1 단계에서 첨가된 조직 용액 및 유리 구슬을 사용하여 기계적 용해 방법에 의해 용기에서 식품 염료를 추출합니다. (티슈 라이저를 사용할 수 없는 경우 균질화 유봉을 사용하십시오). 우선, 4 °C(도 2D)에서이단계를 수행합니다. 참고: 이 단계의 지속 시간은 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 종래의 조직 용액을 사용하여 1 분 추출이 충분합니다. 시간 수축의 경우 프로토콜은 이 단계가 끝날 때 일시 중지되고 나중에 진행할 수 있습니다. 샘플을 -20°C에 저장합니다.</li>
	<li>추출물을 1.5mL 마이크로튜브를 청소하여 새로운 1.5mL 마이크로튜브에 직접 2mL 마이크로튜브를 반전시음으로써 이송한다. 부드럽게 수행하면 대부분의 유리 구슬은 2 mL 마이크로 튜브의 하단에 유지됩니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 최대 속도로 추출물을 원심분리하여 세포 이물질을 치웁울 수 있습니다.</li>
	<li>1.5 mL 마이크로튜브를 청소하기 위해 초월제를 수집합니다. 셀룰러 파편이 초월제에서 여전히 보이는 경우 5.6 및 5.7 단계를 반복하십시오.</li>
</ol>6. 식품 소비의 색채 정량화
<ol><li>시작 블루 염료 용액의 메탄올에서 직렬 1:2 희석을 수행하여 교정 곡선을 생성하기 위해 표준 솔루션을 준비합니다. 빈 으로 메탄올만 사용하십시오. 표준의 농도는 동물의 음식 섭취량 수준에 따라 달라집니다. 참고: 여기에 제시된 파일럿 스크린의 경우, 애벌레 추출물에 대해 얻어진 염료 농도가 0.02에서 1.93 μL/mL/ mL범위로, 메탄올내 2 μL/mL 청색염 용액의 8개의 직렬 희석의 흡광도를 측정하여 얻어진 표준 곡선을 사용하였다. 필요한 경우 실험 용료의 염료 농도에 따라 이러한 용액의 농도를 증가또는 감소시합니다.</li>
	<li>실험용 시료(5.7단계에서 얻어진) 100μL을 96웰 마이크로플레이트의 우물로 이송하고 플레이트 판독기(도2E)를이용하여 600nm에서 흡광도를 측정한다. 배경 흡광도를 제거하려면 애벌레 추출물("제로 염료 식품 제어)에 대한 "제로"로 청색 염료없이 식품에 공급된 애벌레에서 얻은 추출물의 흡광도를 측정합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 생성하고 각 실험 애벌레 그룹에서 샘플에 대해 얻은 흡수도 값을 음식 섭취량의 양(mL의 부피)과 상관관계를 맺습니다. 5.2 단계에서 각 그룹에 대해 수집된 애벌레수를 고려하여 애벌레당 평균 음식 소비량 찾기</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ol1mpiad:+concordance+of+behavioural+faculties+of+stage+1+and+stage+3+Drosophila+larvae.">The Ol1mpiad: concordance of behavioural faculties of stage 1 and stage 3 Drosophila larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2452-2475 (2017).</li><li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+larvae+make+nutritional+choices+that+minimize+developmental+time.">Drosophila melanogaster larvae make nutritional choices that minimize developmental time.</a> Journal of Insect Physiology. 81, 69-80 (2015).</li><li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+food+intake+in+Drosophila.">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), 6063 (2009).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+foraging+and+social+behavior+by+the+Drosophila+neuropeptide+Y-like+system.">Developmental control of foraging and social behavior by the Drosophila neuropeptide Y-like system.</a> Neuron. 39 (1), 147-161 (2003).</li><li>Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+hunger-driven+behaviors+by+neural+ribosomal+S6+kinase+in+Drosophila.">Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13289-13294 (2005).</li><li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster.">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li></ol>

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이 프로토콜을 사용하면 특정 신경 인구의 열유전학 활성화하에서 유충의 능력을 테스트하여 단백질과 탄수화물의 섭취 수준을 조절할 수 있으며, 두 가지 주요 다량 영양소가 다른 P:C 조성물의 식단에 노출될 수 있습니다. 이 방법은 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 걸쳐 음식 섭취량의 제어와 관련된 신경 인구를 식별하는 것을 목표로 애벌레 예비 검진의 맥락에서 테스트되었다. 이 작품?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
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Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
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Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

모든 동물은 생존, 성장 및번식을위해 필요한 양의 영양소를 얻기 위해 균형 잡힌 식단에 의존합니다. 무엇을 얼마나 먹을지의 선택은 포만 수준과 같은 동물의 내부 상태와 관련된 다양한 상호 작용 요인및 식품 품질2,3,4,5와같은 환경 조건에 의해 영향을 받습니다. 단백질과 탄수화물은 두 가지 주요 다량 영양소이며 균형 잡힌 섭취는 동물의 생리적 과정을 유지하는 데 필수적입니다. 따라서, 먹이 행동을 통제하고 이러한 다량 영양소의 균형 잡힌 섭취를 유지하는 신경 메커니즘의 이해는 매우 관련이 있다. 이는 수명, 대변, 대사 건강 과 같은 생명력 특성이단백질 섭취량6,7,8,9,10의수준에 직접적으로 영향을 받고 있기 때문이다.
포유류를 포함한 복잡한 동물과 함께 진화적으로 보존된 먹이 습관을 나타내는 더 간단한 더 많은 기관 유기체의 사용은 이러한 유형의 연구에 필수적입니다. 중요한 것은, 이러한 간단한 동물 모델은 비용이 많이 드는, 윤리적, 기술적으로 더 효과적인 맥락에서 복잡한 생물학적 질문을 해부 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 지난 수십 년 동안, Drosophila는강력한 유전 도구 키트, 복잡하고 고정관적인 행동 및 포유류와 말초 및 영양 감지 메커니즘의 보존 된 아키텍처를 통해 행동 신경 생물학자11을위한유익한 모델이되었습니다. 궁극적으로, 희망은 음식 섭취가 이 동물에서 어떻게 규제되는지 이해함으로써, 더 간단한 신경계로, 우리는 인간 섭식 장애의 근본적인 신경 오작동을 풀어 놓기 시작할 수 있다는 것입니다.
먹이 행동에 대 한 신경 기판의 연구는 그들의 신경 활동을 조작 하는 동안 동시에 동물의 음식 섭취를 측정 할 수 있는에 깊이 의존. 섭취하는 음식의 최소한의 양으로 인해 파리가 먹는 음식의 양을 정량화하는 것은 매우 어렵고 현재 사용 가능한 모든 방법은 상당한 한계를 제시합니다. 따라서, 금본위제는 상호 보완적인방법론(12)의조합을 사용하는 것입니다. 성인 파리는 역사적으로 유전 및 행동 모델로 선호되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, Drosophila 애벌레, 또한 먹이 행동을 코딩 하는 신경 기판을 조사 하는 기회를 제공. 약 12,000개의 뉴런을 가진 애벌레 중추 신경계 (CNS)는 대략 150,000개의 뉴런을 포함하는 성인의 그것 보다는 현저하게 더 적게 복잡합니다. 이 낮은 복잡성은 수치뿐만 아니라 기능적입니다, 유라 행동은 간단한 기관차 기능과 감각 시스템에 의존하기 때문에. 그들의 신경계의 명백한 단순성에도 불구하고, 애벌레는 아직도 완전한 먹이 행동을 전시하고, Drosophila 애벌레에 있는 음식 섭취를 정량화하는 몇몇 방법은5,13,14,15를기술되었습니다. 신경 활동의 조작과 짝을 이면, Drosophila 애벌레는 음식 섭취의 신경 조절을 이해하기 위한 고도의 기관모형을 구성할 수 있습니다.
여기에 제공 된 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 노출 된 애벌레의 음식 섭취량을 정량화하는 상세한 프로토콜이 있습니다. 이른바 다량영양소 균형 식단은 단백질과 탄수화물 함량이 다르며, 특히 탄수화물(P:C) 비율에 대한 단백질과 관련하여 1:1(단백질이 풍부한 식단), 1:4(중간 식단), 1:16(단백질 가난한 식단)에 대해 도 1A에나타낸 바와 같이. 간단히 말해서, 청색 식품 염료로 염색한 이 3개의 동종 자당 효모(SY)를 사용하여 정량적 무선택 수유 분석이 설립되었습니다. 효모 추출물과 자당은 단백질 및 탄수화물 공급원으로 사용되었고, 둘 다 탄수화물을 함유하고 있기 때문에, P:C 비율의 변이는 이전에 설명된 바와 같이, 이 두 성분의 균형을 변경하여 얻어졌다16 및 도 1B에나타난 바와 같이. 주요 실험 단계를 보여주는 프로토콜의 회로도 개요는 그림 2에서사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 P:C 비율의 규정식에 있는 애벌레 공급 수준의 규칙에 특정 신경 인구의 역할을 조사하고 열유전학 신경 스크린의 맥락에서 설치되었습니다. 잘 특징적인 신경유전학 적 도구는 과도 수용체 전위 (TRP) 제품군에서 사용되었다: 드로소필라 과도 수용체 잠재적 채널 (dTRPA1), 이는 온도 및 전압 게이트 양이온 채널입니다, 주변 온도가 25 ° C17이상 상승 할 때 행동 잠재력의 발사를 허용. dTRPA1 트랜스진을 표현하기 위해, 우리는 Janelia 연구 캠퍼스18,19에서플라이 라이트 프로젝트의 맥락에서 루빈 실험실에 설립 된 드로소필라 게놈에서 시스- 규제 영역을 기반으로 Gal4 라인을 이용했다.
여기서 설명된 프로토콜은 활성화 화면의 맥락에서 확립되었지만, dTRPA1의 대안으로, 온도에 민감한 뉴런 소음기 ShibireTS20을사용하여 억제 스크린을 수행하기 위해, 즉 다른 특정 요구 또는 관심사에 실험자가 쉽게 적응할 수 있다. 이 및 기타 적응은 프로토콜 및 토론 섹션에서 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtubes</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co.</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>10xPBS</td><td>Nytech</td><td>MB18201</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL microtubes</td><td>Sarstedt AG &amp;amp; Co.</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>60 mm petri dishes</td><td>Greiner Bio-one, Austria</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplates</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-204453</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pr&amp;oacute;-vida, Portugal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench cooler</td><td>Nalgene, USA</td><td>Labtop Cooler 5115-0032</td><td></td></tr><tr><td>Blue food dye</td><td>Rayner, Billingshurst, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell disruption media</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>888-850-6208</td><td>(0.5 mm glass beads)</td></tr><tr><td>Dish weight boats</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-201606</td><td></td></tr><tr><td>Embryo collection cage for 60 mm petri dishes</td><td>Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK</td><td>FLY1212 (59-100)</td><td></td></tr><tr><td>Featherweight forceps</td><td>BioQuip Products, USA</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>Fly food for stocks maintenance</td><td></td><td></td><td>1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid</td></tr><tr><td>Forceps #5</td><td>Dumont</td><td>0108-5-PS</td><td>Standard tips, INOX, 11cm</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>LMS Ltd, UK</td><td>Series 2, Model 230</td><td>For thermogenetic feeding assay (30?C)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Percival Scientific, USA</td><td>DR36NL</td><td>To stage larvae (19?C)</td></tr><tr><td>Janelia lines</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>Detailed information in Table 2</td></tr><tr><td>Macronutrient balancing diets</td><td></td><td></td><td>Composition and nutritional information in Figure 1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>CAS number: 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td>VWR, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5804 R / Serial number: 5805CI364293</td><td></td></tr><tr><td>Rubin Gal4 ines</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center</td></tr><tr><td>ShibireTS UAS line</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC number: 66600</td><td>Provided by Carlos Ribeiro Group</td></tr><tr><td>Soft brushes</td><td></td><td></td><td>For sorting anaesthetised fruit flies</td></tr><tr><td>Spectrophotometer plate reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan Go 51119300</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon</td><td>1016625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sidul, Portugal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Third-instar larvae (L3) rearing diet</td><td></td><td></td><td>Composition and nutritional information in Figure 1</td></tr><tr><td>Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue lyzer / bead beater</td><td>MP Biomedicals, USA</td><td>FastPrep-24 6004500</td><td></td></tr><tr><td>TRPA1 UAS line</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC number: 26264</td><td>Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ?C</td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Sheldon Manufacturing Inc., USA</td><td>W20M-2 / 03068308 / 9021195</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Pr&amp;oacute;-vida, Portugal</td><td></td><td>51% Protein, 15% Carbohydrate</td></tr></tbody></table>

quantification of macronutrients intake in a thermogenetic neuronal screen using drosophila larvae

먹이를 주고 먹이를 주는 행동을 통해 동물은 개발, 건강 및 피트니스에 필수적인 에너지와 영양소의 원천에 접근할 수 있습니다. 이러한 행동의 신경 조절을 조사하는 것은 영양 항상성의 근본적인 생리적 및 분자 메커니즘의 이해를 위해 필수적입니다. 벌레, 파리 및 물고기와 같은 유전적 인 동물 모델의 사용은 이러한 유형의 연구를 크게 용이하게합니다. 지난 10 년 동안, 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터는 먹이와 위조 행동의 신경 제어를 조사하는 신경 생물학자에 의해 강력한 동물 모델로 사용되었습니다. 의심 할 여지없이 가치가 있지만, 대부분의 연구는 성인 파리를 검사합니다. 여기서, 우리는 애벌레가 그들의 단백질과 탄수화물 함량이 다른 규정식에 드러날 때 먹이 행동을 통제하는 신경 기질을 조사하기 위하여 간단한 애벌레 신경계를 이용하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 방법은 뉴런 열유전학 활성화 스크린의 맥락에서 수행되는 정량적 색색 무선택 공급 분석법을 기반으로 합니다. 판독으로, 1 시간 간격을 통해 애벌레에 의해 먹는 음식의 양은 탄수화물 (P:C) 비율에 그들의 단백질에서 다른 3개의 염료 표지 규정식 의 한에 드러낼 때 이용되었습니다. 이 프로토콜의 효능은 다른 다량 영양소 품질의 식단에서 먹는 음식의 양을 조절하는 후보 신경 인구를 식별함으로써, 애벌레 Drosophila에서신경 유전학 화면의 맥락에서 입증된다. 우리는 또한 표현형으로 시험된 유전자형을 분류하고 그룹화할 수 있었습니다. 문헌에서 현재 사용 가능한 방법에 대한 간략한 검토 외에도 이러한 방법의 장점과 제한 사항이 논의되고 이 프로토콜이 다른 특정 실험에 어떻게 적응할 수 있는지에 대한 몇 가지 제안이 제공됩니다.

Drosophila 애벌레는 과잉 탄수화물을 섭취하는 비용으로 단백질 섭취량을 조절23 (그림 2E의회로도 플롯). 실제로, 단백질 섭취량의 이러한 우선 순위는 다른 많은 동물에서 관찰되었으며24,25를활용하는 단백질이라고 불린다.
이 강력한 먹이 행동 반응을 활용, 행동 기반 화면 다량 영양?...

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Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

3.6K 조회수.  Monash University. 여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

연구

유전학

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

신경과학

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

행동분석학

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

드로소필라의 신속한 식품 선호 분석

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

FRET 센서를 사용한 초파리 의 뇌 대사체 수송 모니터링

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

저자 스포트라이트: 초파리 모델을 사용한 뇌 에너지 대사 연구의 발전

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

요약

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이 비디오의 챕터

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

드로소필라의 신속한 식품 선호 분석

유전적으로 인코딩된 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌에서 모노카르복실레이트 및 기타 관련 대사 산물 시각화