이 절차는 HIV 감염의 역학의 연구를 위한 인간화된 면역 결핍 마우스의 3개의 모형을 기술합니다. NSG 인간화된 마우스는 인간 면역의 특징을 재구성합니다. 이 경우, 만성의 연구를 허용, 급성, 및 전 임상 설정에서 HIV 감염을 다시 활성화.
세포 준비 절차를 보여주는 산드라 메디나 모레노, 우리 그룹에서 실험실 연구 감독자 될 것입니다. 이 절차를 수행 할 때, 항상 멸균 스크럽, 장갑, 전용 신발, 신발 커버, 마스크, 고글, 머리와 수염 보닛, 멸균 실험실 코트를 포함한 일회용 개인 보호 장비를 사용합니다. 만성 모델의 경우, 인증된 생체 안전 캐비닛 에서 10%의 FBS를 가진 RPMI 1640 매체의 10 밀리리터에서 100만 개의 냉동 CD34+인간 줄기 세포를 재중단하고 멸균 상태를 유지합니다.
현탁액의 마이크로리터 10대를 사용하여 혈종계에서 트리판 블루 제외 염색에 의해 셀 생존 가능성을 계산하고 확인하십시오. 그런 다음 실온에서 15 분 동안 400 배 g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 버리고 필요한 농도에서 감기 1X PBS에서 세포를 다시 중단합니다.
세포가 주입될 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 수반자 새끼의 다른 외국 냄새를 가리기 위해 손 사이에 깨끗한 침구를 문지릅니다. 그런 다음 새끼를 멸균 100 평방 밀리미터 페트리 접시에 넣고 육종가 의 소량의 침구 재료와 함께 놓습니다.
페트리 접시를 깨끗한 수송 케이지에 넣은 다음 케이지를 카보이 수송 케이지에 넣어 새끼를 직접 빛과 소음으로부터 보호합니다. 방사선실로 이동하는 동안 동물이 환경에 노출되는 것을 피하기 위해 커버 패드로 운송 케이지를 덮습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 마취에 따라 간 주사를 통해 이식을 준비합니다.
마우스 구속 시간을 최소화하기 위해, 한 구자가 줄기 세포 현탁액으로 주사기를 적재하고 두 번째 조사관이 새끼를 잡고 주사를 투여하도록 한다. CD34+인간 줄기세포 현탁액의 50마이크로리터를 인증된 생물안전 캐비닛 아래에 부착된 바늘로 주사기에 적재한다. 엄지손가락과 검지 손가락으로 새끼를 억제하고 70 %의 알코올로 주사 부위를 청소하십시오.
얕은 바늘 각도를 사용하여 간을 완전히 관통하지 않도록 50 마이크로 리터의 세포를 간으로 직접 전달하십시오. 20°C의 설치류용 적외선 온난화 패드를 사용하여 접시를 미리 떼어 새끼가 따뜻해지지 않도록 하십시오. 새끼를 멸균 거즈로 덮인 페트리 접시에 1~5분간 올려 놓아 회복을 허용합니다.
새끼를 부모에게 돌려주기 직전에 엄지손가락과 검지 손가락을 사용하여 소량의 멘톨과 유칼립투스 기반 연고를 두 부모의 주둥이에 발라 식인풍이나 새끼의 거부를 피하십시오. 매일 케이지를 확인하여 건조한 피부, 수유, 발진 또는 탈모증과 같은 새끼의 접목 과 숙주 질병의 징후를 찾습니다. 3 주에 새끼를 짜고 다른 새장에 보관하십시오.
14주에 혈류 세포측정에 의한 말초 혈액의 이식을 확인하십시오. 인간 CD45+셀 재구성 및 CD4+및 CD8+T 세포의 백분율평가를 위한 대표적인 게이팅 전략이 표시됩니다. 이식성공률은 80%에서 100%사이이며, 급성 모델또는 재활성화 모델을 위한 항레트로바이러스 요법을 받고 있던 HIV 감염 환자로부터 건강한 기증자로부터 유래한 인간 말초 혈액 단핵 세포를 사용합니다.
멸균 밀도 그라데이션 배지 5밀리리터에서 전혈 15밀리리터를 50밀리리터 원내 튜브로 레이어합니다. 원심분리기는 실온에서 30분 동안 400배g의 원심분리기로 버피 코트가 밀도 그라데이션 매체와 혼합되는 것을 피한다. 밀도 그라데이션 배지와 상체 사이의 단일 핵 세포의 분획을 신중하게 수집합니다.
버피 코트를 1X PBS 10밀리리터가 들어있는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 원심분리기는 실온에서 10분 동안 300배 g로 원심분리기. 상체를 버리고 펠릿 세포에 추가 된 ACK 리시스 버퍼의 5 밀리리터로 lysing하여 나머지 적혈구를 제거합니다.
실온에서 4분간 배양하세요. 원심 분리 후 이전과 같이, 상체를 폐기하고 1X PBS 또는 RPMI 1640 매체의 10 밀리리터에서 재중단. 세포 현탁액의 10 마이크로리터를 사용하여 세포를 계산하고 혈종계에서 Trypan Blue 제외 얼룩에 의해 생존 가능성을 확인하십시오.
전형적으로, 1~2백만 개의 세포는 95% 이상의 생존력을 가진 혈액의 각 1밀리리터에 대해 얻어집니다. 이전과 마찬가지로 원심 분리에 따라, 상신체를 버리고 셀 수를 필요한 농도로 조정한다. 1X PBS 의 200 마이크로리터에 350만 개의 말초 혈액 단핵 세포를 공인 된 생물 안전 캐비닛 아래에 부착 된 바늘로 주사기에 적재합니다.
케이지에서 마우스를 제거하고 꼬리에 잡혀 부드러운 견인력을 뒤로 가고 있는 메시를 잡을 수 있습니다. 그런 다음 동물의 어깨에 검지 손가락과 엄지 손가락을 놓고 목의 느슨한 피부를 잡고 가운데 손가락을 사용하여 허리를 안정시합니다. 마우스 머리를 뒤로 밀어 머리 위에 있습니다.
이것은 복강에 있는 내장이 뒤로 변위될 수 있고 주입 도중 내부 기관을 구멍을 뚫기의 리스크를 감소시킵니다. 70 %의 알코올로 주사 부위를 청소하십시오. 세포를 주입하기 전에 복벽을 통해 준비 된 주사기를 관통하고 흡인.
재질이 흡인된 경우 주사기를 제거하고 폐기합니다. 그렇지 않으면 주사기를 제거하고 폐기하기 전에 복막 내 구멍에 천천히 세포를 주입하십시오. 동물을 케이지로 돌려보내3주 후 세포측정을 통해 말초 혈액에 이식하는 것을 확인하십시오.
귀 태그로 마우스를 식별합니다. 이러한 실험에 사용되는 마우스를 관찰하여, 요난의 임상 징후를 위해 각 시술 후 하루에 두 번 관찰하십시오. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 HIV 주입을 진행합니다.
HIV 주입에 이어, 재발성 모델에서 유사한 운동과 만성 및 급성 모델 모두에서 2 ~ 3 주 후 일반적으로 검출되는 플라즈마 바이러스 부하의 급속한 증가가있다. 바이러스 부하의 증가는 CD4:CD8 비율의 감소와 일치합니다. 이러한 변화는 대조군 마우스에서 관찰되지 않습니다.
참고로, 인간화된 PBMC NSG 성인 마우스 모델에서는 모니터링 시간에 따라 CD4:CD8 비율의 초기 반전이 관찰되고 재구성됩니다. 항레트로바이러스 요법이 HIV 감염 마우스에 투여될 때, CD4:CD8 비에서 바이러스 부하의 억제뿐만 아니라 회복은 감염되지 않은 대조군과 유사한 수준에 도달할 것으로 예상되는 것으로 나타났다. 전형적으로, 2~3주 간의 치료 후, 만성, 급성 및 재활성화 모델에서 바이러스 부하감소 및 CD4:CD8 비율의 증가가 관찰된다.
치명적인 과다 복용 또는 이식 된 세포의 거부를 피하기 위해 권장된 조사 복용량을 사용. 주입 하는 동안 간을 완전히 관통 하 고 댐이 외국으로 인식 됩니다 냄새를 마스크 침구를 사용 하지 마십시오. 이 세 가지 모델은 항 바이러스 화합물, 항 HIV 항체 또는 바이러스 복제에 영향을 미치는 다른 생물학적 물질의 테스트를 허용합니다.
또한, 그들은 HIV 면역 요법에 대한 적응 전달 실험을 허용합니다. NSG 인간화된 마우스는 인간 면역 계통의 복잡성을 모방하여 병원체 또는 약물에 반응하기 위하여 인간 세포로 부분적으로 또는 가득 차있게 재구성될 수 있습니다. 모든 기본적인 생물학적 측정은 NSG 인간화 마우스가 뮤린과 인간 병원균 모두에 감염될 수 있기 때문에 엄격하게 따라야 하며, 특히 HIV 바이러스 조작을 사용하는 이 경우.
