이 방법은 다른 성장 조건 과 스트레스 상황에서 글로벌 레귤레이터 ppGpp의 수준을 측정합니다. PpGpp는 엽록소에서뿐만 아니라 그램 양성 및 부정적인 박테리아에서 찾을 수 있습니다. PpGpp는 몇 초 만에 빠른 발병을 가지고 있으며, 스트레스가 생성되면 빠른 두 번째 관계로 이어집니다.
동시에, 그것은 짧은 반감기, 최대 30 초있다. 따라서 응력 전환을 포함하여 10초에서 시간까지 다를 수 있는 시간 간격으로 많은 배양을 모니터링할 필요가 있습니다. 우리는 또한 마이크로 티터 접시에 있는 방사선 라벨 세균 성 배양은 다중 기술및 생물학 복제를 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다.
방사성 물질로 작업할 때 적절한 안전 조치를 따라야 합니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어를 준비합니다. 3 밀리머 나트륨 인산염으로 MOPS 미디어에서 하룻밤 문화를 성장.
MOPS 매체의 550 마이크로리터를 추가하여 0.2 마이크로몰라 나트륨 인산염 캐리어와 24웰 플레이트의 우물에 각 세균 성 무접종30 마이크로리터를 연속합니다. 이렇게 하면 OD600이 0.1의 초기 접종을 받게 됩니다. 멸균 제어뿐만 아니라 신선한 미디어를 하나에 추가합니다.
흔들리는 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도에 놓고 900 RPM에서 30 분 동안 흔들어 놓습니다. 동일한 조건에서 배양하는 동안 플레이트 리더기를 사용하여 p32가 부족한 미디어에서 복제 플레이트를 병렬로 복제한 플레이트 판독기를 사용하여 성장을 모니터링할 수 있습니다. 다음으로, 접시의 각 웰에 p32 orthphosphate의 100 마이크로 큐리를 추가합니다.
외부 라벨이 세포 간 뉴클레오티드 풀과 크게 평형화할 수 있도록 1~2배의 이중배로 흔들리는 인큐베이터에서 배양을 성장시키게 한다. 적절한 시각화를 위해 이 비디오에서 활성 재질이 사용되지 않았습니다. 실제 실험에서는 적절한 차폐뿐만 아니라 측량 계측기의 오염에 대한 지속적인 모니터링이 필요합니다.
먼저, 연구된 스트레스의 종류에 적합한 방법을 사용하여 스트레스를 유도한다. 다음으로, 각 표지된 세포 샘플의 마이크로리터 20개를 별도의 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 추가하여 20마이크로리터의 얼음 냉간 6개의 어금산이 함유되어 있습니다. 즉시 드라이 아이스에 샘플을 배치합니다.
동결 및 해동의 세 주기에 의해 세포 추출 효율을 향상시킵니다. PEI 셀룰로오스 얇은 층 크로마토그램을 발견하기 직전에, 원심 분리는 펠릿 세포 파편에 최대 속도로 1 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 먼저, 20% 20센티미터 PEI 셀룰로오스 TLC 플레이트를 설정합니다.
가위를 사용하여 상위 5센티미터를 제거합니다. 그리고 부드러운 연필을 사용하여 가장자리에서 1 센티미터 떨어진 원점 선을 표시합니다. 각 샘플의 5개의 마이크로리터 액자를 PEI 표면에 적용합니다.
반점이 건조되기 전에, 원산지 시점을 만지지 않을 정도로 얕은 1.5 개의 어금반 모노칼타슘 인산염층을 포함하는 탱크로 플레이트를 옮기. 밀폐 씰로 탱크를 덮고 15센티미터 트리밍 시트의 상단으로 액체 상승을 허용합니다. 그 후, 완전히 발달 된 크로마토그램을 제거하고 실온에서 공기 건조.
무료 P32를 함유한 크로마토그램의 상부 부분을 방사성 폐기물로 잘라버리고 버립니다. 인광 화면을 사용하여 밤새 오디오 라디오 필름을 노출하십시오. 다음 날, 필름을 개발하고 인광의 녹색 신호를 캡처하고 양을 양화하기 위해 인광기 이미지를 사용합니다.
그런 다음 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 방사성 반점을 양량화합니다. ppGpp 축적을 허용하기에 충분한 시간 동안 스트레스 나 기아를 자극 한 후 적절한 방법을 사용하여 스트레스를 반전시면 됩니다. 20~30초마다 샘플을 최대 2분 동안 채취하고 이전에 설명한 대로 샘플을 처리합니다.
TLC가 개발되고 시간 과정에서 ppGpp의 수준을 얻으면 잔여 ppGpp 콘텐츠를 반로개반성 플롯에 플롯합니다. 이 연구에서는, ILV를 제외한 모든 아미노산을 함유하는 MOPS에서 자란 세포는 P32로 표시된다. 일단 라벨이 붙으면 L valine이 첨가되어 이솔루신 기아를 생성합니다.
5 분 후, 구아노신의 테트라 와 펜타 포스 페이트의 수준에 있는 2 그리고 2 반 오래된 증가가 일어났습니다. 세포 무표지 샘플의 부정적인 제어는 P32 소스에서 직교하지 않는 가능한 화합물을 검출하는 데 사용됩니다. 이솔루신 기아의 반전은 단백질 합성 억제제인 클로람페니콜(chloramphenicol)에 의해 달성될 수 있으며, 이는 충전된 이솔루신 tRNA의 소비를 감소시키고, 차례로 충전되지 않은 tRNA에 대한 높은 비율을 회복시킨다.
강력한 레라 매개 ppGpp synthetase의 활성화는 폐지되며, 이는 잔류 합성에 의해 흔들리지 않는 ppGpp 분해의 측정을 허용한다. 이 경우 ppGpp는 약 64 초의 반감기로 부패합니다. 어떤 긴장 또는 기아를 유도 하기 전에 균일 한 라벨을 달성 하기 위해 세포의 몇 세대에 대 한 성장 하는 것이 중요 하다.
ppGpp는 박테리아 중 널리 퍼져 있기 때문에,이 방법은 다른 유기체에 적용 될 수있다. TLC 개발 방법의 수정은 ppApp와 같은 모든 규제 뉴클레오티드의 적절한 분리를 허용할 수 있었다. P52는 더 나은 방사제 동위 원소이므로 적절한 차폐를 사용하고 잔류물을 올바르게 폐기하는 것이 중요합니다.
