이 프로토콜은 방사선이 뮤린 유방 지방 패드에 있는 지방 조직의 세포외 매트릭스 속성에 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 탈세포화 모델에 방사선의 추가는 이전에 수행되지 않았습니다. 이 기술은 각각 탈세포화 공정에서 고유한 화학 적 목적을 제공하는 여러 세척 단계를 사용합니다.
이 기술의 특이성은 조직 특성을 더 잘 보존하기 위해 부드러운 화학 적 세서히를 허용합니다. 유방암 재발은 특히 삼중 음성 케이스에서, 치료 다음 에서 생깁니다. 조사된 세포외 매트릭스가 종양 세포 거동을 어떻게 변화시키는지 평가하는 것은 재발 메커니즘에 대한 중요한 발견으로 이어질 것입니다.
견본을 조사한 후에, 세슘 근원을 사용하여, 조사된 MFP의 및 완전한 RPMI 매체를 생물 안전 캐비닛으로 전송합니다. MFP를 잠수하기에 충분한 미디어로 6센티미터 또는 10센티미터의 요리를 채웁니다. 2일 동안 이산화탄소 5%를 기록하며 섭씨 37도에서 배양합니다.
먼저, 트립신-EDTA 솔루션 5밀리리터와 함께 MFP의 6센티미터 요리에 배치합니다. 스프레이와 70%에탄올로 접시를 닦고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 0.7 밀리리터 스트레이너를 사용하여 조직에 물을 세 번 부어 분화물로 MFP의 물을 씻으세요.
집게를 사용하여 세차 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오. 다음으로, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 말리고 무게를 측정합니다. 말린 조직을 적절한 크기의 교반 바를 포함하는 사전 오토클레이브 비커에 넣고 조직의 그램당 3%t-octylphenoxypolyethoxyethanol의 60 밀리리터로 조직을 덮습니다.
실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 그런 다음 비커의 내용을 여과기에 덤프합니다. 비커를 탈온화된 물로 헹구고 조직에 부어 넣습니다.
이 헹기 과정을 두 번 더 반복하여 집게를 사용하여 헹도 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오. 그 후, 섬세한 작업 닦아 무게에 조직을 간단히 건조. 조직과 교반 바를 같은 비커에 다시 넣고 조직 그램당 4%의 데옥시콜산 60밀리리터로 덮습니다.
실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 다음으로 비커의 내용을 메쉬 스트레이너에 버리고 비커를 탈온화된 물로 헹구고 조직에 부어 넣습니다. 이 헹기 과정을 두 번 더 반복하여 집게를 사용하여 헹도 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
간략하게 섬세한 작업 닦아에 헹구는 조직을 건조하고 무게. 말린 조직을 같은 비커에 넣고 신선한 탈이온된 물과 함께 1%페니실린-연쇄 절제술을 보충합니다. 비커를 파라핀 필름으로 단단히 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 둡니다.
다음 날 비커 내용물을 여조로 배출하고, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 말리고 무게를 측정합니다. 그런 다음 MFP를 동일한 비커에 적절한 크기의 스터드 바에 배치합니다. 조직의 그램당 4%에탄올과 0.1%의 peracetic산을 함유한 용액의 60밀리리터로 조직을 덮습니다.
실온에서 2시간 동안 저어줍니다. 비커의 내용을 0.7mm 여조로 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하고 내용물들을 비커에 다시 넣습니다.
조직을 1그램당 1X PBS 60밀리리터로 덮어 조직을 씻으시면 됩니다. 실온에서 15분간 저어줍니다. 이 전체 세탁 과정을 한 번 더 반복하십시오.
다음으로 비커의 내용을 0.7mm 스트레이너로 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하고 내용내용을 비커에 다시 넣습니다. 조직을 1그램당 60밀리리터의 탈온수로 덮어 조직을 씻으시면 됩니다.
실온에서 15분간 저어줍니다. 이 전체 세탁 과정을 한 번 더 반복하십시오. 세척된 조직을 섬세한 작업 닦아내고 무게를 닦으십시오.
조직과 내용기를 여조기에 버리고 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용자를 비커에 다시 넣고 조직 1그램당 100%n-propanol의 60 밀리리터로 조직을 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.
그런 다음, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 건조하고 무게를. 조직과 내용기를 0.7mm 여조로 덤프하고 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용물을 비커에 다시 넣고 조직 1그램당 60밀리리터의 탈온화된 물로 덮어 조직을 씻으시다.
실온에서 15분간 저어줍니다. 이 세척 과정을 세 번 반복하십시오. 그 후, 섬세한 작업 닦아에 조직을 간단히 말리고 무게를 측정합니다.
표시 된 15 밀리 리터 튜브에 조직을 전송 하 고 부정적인에서 동결 80 섭씨 하룻밤. 첫째, 액체 질소로 얕은 용기를 채웁니다. 냉동고에서 샘플을 제거하고 각 lyophilized MFP의 무게를 측정합니다.
박격포에 1개의 샘플을 놓고 극저온 장갑을 사용하여 박격포를 액체 질소에 고정시하십시오. 그런 다음, 휴대용 드릴에 부착된 유봉을 사용하여 샘플을 밀링합니다. 1분 간격으로 밀어 진행 상황을 확인하고 액체 질소에서 장갑을 낀 손을 제거합니다.
모든 샘플에 대해 이 밀링 공정을 반복하여 각 샘플 사이에 에탄올로 박격포와 유봉을 분무하고 닦아주세요. 가루 샘플을 15 밀리리터 튜브에 음수 섭씨 80도에 보관하여 사용할 준비가 될 때까지 보관하십시오. 먼저 냉동실에서 샘플을 제거하고 실온에서 해동합니다.
시료가 해동되는 동안 펩신을 염산에 섞어 펩신-HCL 용액을 형성한다. 다음으로, 샘플 파우더와 펩신-HCL 용액을 15 밀리리터 튜브에 넣고 작은 교반바를 넣고 48시간 동안 저어줍니다. 그 후 튜브를 얼음 위에 5분간 놓습니다.
최종 용액이 1X PBS의 농도를 가지도록 각 샘플에 10X PBS를 추가합니다. 그런 다음 각 솔루션에 10%의 부피/부피, 0.1 어금다 수산화나트륨을 추가하여 pH 7.4에 도달하여 pH 용지를 사용하여 각 솔루션을 개별적으로 테스트합니다. pH 7.4 젤 용액을 사용하여, 겔 용액의 밀리리터 당 500, 000 또는 1, 000, 000 세포의 농도로 4T1 세포로 표지된 펠릿 GFP 및 루시파라제(luciferase)를 재연한다.
16웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 젤 셀 용액 16 마이크로리터를 추가하고 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그 후 각 웰에 100마이크로리터의 완전한 RPMI 미디어를 추가합니다. 48시간 동안 섭씨 37도에서 계속 배양하십시오.
이어서, 형광 현미경을 사용하여 519 나노미터의 발산 파장 및 618 나노미터의 방출 파장에서 세포를 관찰한다. 이 연구에서는 세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상적인 조직 방사선 효과가 연구됩니다. 헤마톡시린과 에신 염색은 핵과 DNA의 다른 흔적의 손실을 통해 탈세포화를 확인하는 데 사용됩니다.
오일 레드 O 염색은 지질 함량을 평가하고 디파사이트 형태의 보존을 확인하는 데 사용됩니다. ECM 하이드로겔의 유변학적 특성은 섭씨 37도에서 평가됩니다. 스토리지 계수는 모든 조건에 대한 손실 계수보다 높으며 안정적인 하이드로겔 형성을 보여줍니다.
GFP 및 루시파라제는 4T1 유방 암종 세포로 표지된 다음 하이드로겔에 캡슐화됩니다. 세포 증식은 형광 현미경 검사, 조명 측정 및 생존 성 염색에 의해, 캡슐화 후 48 시간 검사됩니다. 조사된 하이드로겔은 종양 세포 증식의 증가 추세를 보여줍니다.
Phalloidin 공주게이트는 캡슐화된 세포에서 F-Actin을 시각화하는 데 사용됩니다. 공장 내부에 조직을 배치하기 전에 박격포를 냉각하는 것을 기억, 따뜻한 박격포는 불완전 한 밀링으로 이어질 수 있습니다. n-프로판 및 펩신을 취급할 때주의하십시오, 화학 후드의 밑에 n-propanal 및 그밖 탈세포제 만 열립니다.
가능하면 흡입위험이 있기 때문에 화학 후드 아래에 펩신을 계량합니다. 조사 및 탈세포화 후 ECM 조성변화는 질량 분광법 및 라만 분광법을 사용하여 평가될 수 있다. 또한, ECM 하이드로겔의 섬유 구조는 전자 현미경을 스캔하여 분석될 수 있다.
이 방법은 종양 세포뿐만 아니라 면역 세포뿐만 아니라 치료의 결과로 방사선 손상을 경험하는 조직에 대한 방사선의 효과를 검사하기 위해 확장 될 가능성이 있습니다. 이 탈세포화 기술은 연구원이 대부분의 암에 있는 중요한 처리 선택권인 방사선 다음 조직의 세포외 매트릭스 속성을 평가하는 것을 허용할 것입니다.
