우리는 의료 연구 위원회 영국 코어 (U105115237) RRK 자금에 대 한 감사 합니다.

1입니다. 세포와 자료의 준비
<ol><li>설명된23으로 셀 Klebsiella aerogenes, 같은 박테리아와 함께에서 또는 HL5 같은 영양소 매체에 SM 한 천 배지에서 배양. 참고: 성장 하는 박테리아에 macropinocytosis에 결함이 녹아웃 돌연변이 macropinocytosis의 속도 증가 시킬 수 있습니다 이차 돌연변이의 축적을 방지 하기 도움이 됩니다. 최적의 결과 대 한 주식에서 셀 도금 후 4 아래 통로 번호를 유지. 돌연변이 격리 후 즉시 냉동된 주식으로 저장 되어야 합니다.</li>
	<li>SM 한 천 배지에서 세포 배양을 SM 매체에 합류 K. aerogenes 성장. SM 한 천 격판덮개에 박테리아의 200-300 μ를 추가 하 고 확산. (다른 세균성 접시에서 전송) 하는 경우 셀의 메 마른 루프를가지고 고 접시의 한 가장자리에 확산. 주일에 22 ° C에서 품 어.</li>
	<li>50 mg/ml 물에 Tetra-메 틸-rhodamine isothiocyanate (TRITC-) dextran을 분해, 1 mL aliquots로 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 및-20 ° c.에 저장 Aliquots는 무기한으로 보관 될 수 있습니다. 참고: 155 kDa, 대량에서 싸게 구입할 수 있습니다 하지만 작은 dextrans 측정 macropinocytosis Dictyostelium24에 효과적으로이 방법으로 사용 되는 일반적인 크기입니다. 캐스케이드 또는 알 렉 사-647, 같은 다른 비-quenchable dextrans 다른 fluorophores 필요한 경우 대안이 있습니다.</li>
</ol>2. (선택 사항)으로 양적 질적 측정 변환
<ol><li>
현 탁 액 셀을 사용 하 여 액체 이해 분석 결과 수행 합니다.
	<ol>
<li>300 x g 3 분에 axenically 성장 세포를 작은, 삭제는 상쾌한 고 1 x 107 셀/mL 영양소 중에 resuspend. TRITC-dextran 0.5 mg/mL을 추가 하 고 180 rpm, 22 ° c.에 흔들</li>
		<li>희석 0.8 mL 샘플 얼음 주식2 0, 30, 60, 90, 120 분 세척에서 0.7 mL로 한 번 얼음 주식2 버퍼23 벤치탑 원심 분리기에서 1.5 ml, 같은 버퍼에 1 ml resuspend 및 얼음에 저장. 참고: 동일한 결과 생성 즉시 또는 모든 샘플 수집 된 일단 세척.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
액체는 세포에 의해 내 면의 볼륨을 결정 합니다.
	<ol>
<li>574의 544 및 방출 파장의 여기 파장을 사용 하 여 형광을 측정 하기 위해 fluorimeter을 설정 10 nm 슬릿 nm. TRITC-dextran의 희석 일련을 설정 하 고 위해 주어진 형광을 측정 하는 데 사용할 dextran의 볼륨. 보정 곡선을 만듭니다.</li>
		<li>섹션 2.1 세포 현 탁 액의 0.9 mL를 사용 하 여 셀에 의해 내 면 형광을 측정 합니다. 보정 곡선24를 사용 하 여 셀 당 내 액체의 볼륨을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 mL 얼음 차가운 주식2에 별도로 각 시간 지점에서 세포의 나머지를 희석. 5 mL 폴리스 티 렌 흐름 cytometry 튜브 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 각 시간 지점에서 세포는 서로 다릅니다 그리고 그들의 형광을 기록 교류 cytometer 설정 (섹션 3.4와 3.5 참조).</li>
	<li>위의 설정을 사용 하 여 교류 cytometer에서 교정 구슬의 형광을 측정 하 고 그것을 기록 합니다. 참고: 이것은 교류 cytometer에 모든 미래 형광 측정에 대 한 참조: 다시 사용 하기 전에 구슬을 실행 하 고 그래서 그들은 같은 형광 설정을 조정. 이 매우 좁은 정의 된 피크를 줄 것 이다. 주위에 형광 피크 게이트 퍼 팅 수 있습니다 쉽게이.</li>
	<li>세 번을 반복 하 고 2.2 및 2.3 서로 대 한 섹션에서 얻은 세포 형광 데이터. 적합 선 플롯 하 고 방정식을 사용 하 여 양적 단위로 cytometry에서 질적 데이터를 변환.</li>
</ol>3. 측정 유체 통풍 관
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig1.jpg"> 그림 1: macropinocytosis의 높은 처리량 측정의 도식. (A) SM 접시에 성장 Dictyostelium K. aerogenes 박테리아 (노란색)와 시드. 주식2 버퍼의 25 mL로 세포 먹이 앞 (오렌지), 이미 개발 된 셀 피 (녹색), 수확. 소용돌이, 해리를 300 x g에 3 분 원심 분리 하 여 펠 렛 다음 주식2 버퍼, 삭제는 상쾌한 때마다 50 mL에 3 번 세척. 1 x 105 셀/ml HL5 성장 매체에 resuspend 하 고 편평한 바닥 96 잘 접시의 샘플 당 3 개의 우물으로 50 µ L를 추가 합니다. (B) 희석 TRITC-dextran HL5 성장 매체에 1 mg/ml에서 50 mg/mL의 재고 솔루션 24 h. 22 ° C에서 품 어. (0 분 이해 컨트롤 웰 스 제외), 각 샘플에 50 µ L을 추가 하 고는 dextran 0 분 이해 컨트롤에 추가 하는 후 h 1에 대 한 22 ° C에서 품 어. (C)는 언론에 즉시 가만히 따르다, 초과 매체를 제거 하 고 씻어 웰 스 작성 얼음 주식2 버퍼의 목욕에 잠수함을 조직에 접시를 두 드려. 버퍼를 가만히 따르다 하 고 다시 건조 두 드려. 5mm 나트륨 아 지 드 주식2엠씨 셀을 분리 해체의 100 µ L를 추가 합니다. 내 면된 형광 측정 cytometer 흐름을. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>
플랫 96-잘 조직 문화 접시 (그림 1A)를 설정 합니다. 분석 결과; 전에 24 h HL5 매체 (포함 100 µ g/mL의 dihydrostreptomycin, 100 µ g/mL 암 피 실린 및 50 µ g/mL 대)에 그들을 전송 하 고 박테리아에 성장 하는 세포를 사용 하 여 macropinocytosis를 박테리아24에 성장 하는 세포에서 낮은 레벨에서 upregulated 될 수 있습니다. 또는, 다른 밀도에서 희석되 셀 오류를 줄이기 위해 분석 결과 전에 24 h에 대 한 잠복기 axenic 문화에서 직접 셀을 희석.<ol>
<li>25 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에서 주식2 에 먹이 앞에서 베스트 셀. Vortexing와 3 분. 에 대 한 300 x g 에서 펠 릿 세포 분열 삭제는 상쾌한, resuspend 펠 릿 그리고 300 x g 주식2, 박테리아를 제거 하는 상쾌한 때마다 삭제의 50 mL에서 3 분에 3 번 세척.</li>
		<li>(는 hemacytometer 또는 다른 셀 카운트 시스템을 사용 하 여) 셀 밀도 결정 하 고 HL5 포함 항생제 1 x 105 셀/ml로 희석. 각 조건에 대 한 3 개의 우물을 사용 하 여 각 음에 50 μ를 플라스틱. 22 ° C 24 h. 0 분 이해 제어를 설정 하는 기억에서 품 어. 참고:는 대체 매체, 예를 들면 SIH, VL6 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TRITC-dextran (그림 1B)에 포함 된 셀을 로드 합니다.
	<ol>
<li>Dextran 사용 매체에 1 mg/mL를 희석 (이 증가 될 수 있다 2.5-5 m g/mL를 매우 낮은 통풍 관에 포함 된 셀을 평가할 때). 각 잘 (주는 TRITC-dextran 0.5 mg/mL의 최종 농도)을 50 μ를 추가 하 고 이로써 상당한 dextran 축적 하지만 dextran exocytosis 아직 시작 하지는 22 ° C 1 시간에 접시를 반환. 참고: 리피터 피 펫이이 단계 더 빠르게 할 수 오류를 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry (그림 1C)에 대 한 셀을 준비 합니다.
	<ol>
<li>세척, 직전 0 분 이해 컨트롤에 50 μ dextran 포함 된 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>매체를 가만히 따르다와 조직에 건조 두 드려. 얼음 주식2, 플레이트를 잠수 하 여 세척 한 다음 가만히 따르다. 참고: 준수 결함을 가진 일부 변종 예: 중부의 두 homologs의 녹아웃이이 단계 동안 분리 될 수 있습니다 (탈 라-/ talB-)25. 작업 셀 라인을 제대로 연결 하 고 필요한 경우 미디어를 발음을 할 때 주의 사용 합니다.</li>
		<li>얼음 처럼 차가운 5mm 나트륨 아 지 드 주식2MC (주식2 + 2mm MgSO4 및 100 μ M CaCl2)에 용 해의 100 μ를 추가 합니다. 주의: 나트륨 아 지 드는 매우 독성이 있습니다. 먼지가 면 및 안전 유리를 사용 하 여 분말을 작업할 때. 항상 착용 장갑 및 연구실 코트. 열을 방지 하 고 산으로 혼합 하지 마십시오. 참고: 셀 빠르게 분리 하 고 exocytosis 방해24입니다. 이것을 확인 하는 현미경을 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cytometry에 의해 측정 유체 통풍 관
	<ol>
<li>값을 변환 상대적 절대 것 계획, 비즈를 사용 하 여 표준화 흐름 cytometer 설정 (섹션 2 참조). 사용 하 여 셀 (그림 2B) 섹션 2 앞으로 분산형 및 측면 분산형 설정 적절 하 게 셀 (그림 2A), 기계, 차단 되지 않습니다 보장을 dextran 함께 로드 하 고 매개 변수를 조정 하는 또는, (그림 2C) 내 면된 형광을 측정 합니다.</li>
		<li>높은 처리량 샘플링 시스템을 연결 하 고 플레이트를 추가 합니다. (TRITC-dextran 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 자극 582 nm 채널 또는 유사한 측정을)에 대 한 형광을 측정 하는 프로토콜 설정 세포 현 탁 액 및 실행의 최대 65 μ의.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
교류 cytometry 결과 분석
	<ol>
<li>앞으로 분산형 및 사이드 분산형 (그림 2A)를 사용 하 여 셀에 게이트. 통계 옵션을 사용 하 여 셀의 메디아 형광을 계산 합니다. 하나의 샘플을 사용 하 여 이러한 매개 변수를 설정 하 고 모든 샘플에 적용. 참고: 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로필 다른 돌연변이 또는 억제제를 사용 하 여 샘플 사이의 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>각 조건에 대 한 3 개의 우물의 의미를 확인 하 고 빼기 0 분 이해 합니다. 중 2 절에서 결정 하는 수식을 사용 하 여 정량 값으로 변환 또는 컨트롤에 정상화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 유체 이해 시간-과정 수행
<ol><li>섹션 3, 각 시간 점 및 스트레인/조건에 대 한 3 개의 우물에서 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>다른 우물에 dextran 이라는 매체를 순차적으로 추가 합니다. 전형적인 시간 과정 측정 유체 이해 0, 30, 60, 90, 120 및 180 분 180 분 시간 포인트 우물, 120 분 시간 지점에 대 한 우물에 그것을 추가 하 여 다음 60 분에 나중에 대 한 매체 dextran 포함 된 추가 등 (그림 3A).</li>
	<li>0 분 50 μ dextran 포함의 추가 매체 즉시 가만히 따르다와 섹션 3.3에서 접시를 씻어. 3.5 섹션에 설명 된 대로 분석 합니다.</li>
</ol>5. 복용량 응답 곡선
<ol><li>섹션 3, 각 스트레인 및 조건에 대 한 3 개의 우물에에서 설명 된 대로 세포를 설정 합니다.</li>
	<li>포함 하는 화합물의 두 번 원하는 최대 최종 농도 에서 1 mg/mL dextran 매체로 관심의 화합물을 희석. 처음으로 자동차의 동일한 비율으로 dextran와 매체를 포함 하는 두 번째 튜브를 준비 합니다. 소용돌이를 섞어입니다.</li>
	<li>샘플 (그림 4A) 당 매체를 포함 하는 200 μ dextran의 화합물의 희석 시리즈를 만듭니다. 소용돌이를 섞어입니다. 매체의 50 μ 1 h 위해 각 샘플에 추가 합니다.</li>
	<li>세척 및 분석 섹션 3.3 이후에 설명 된 대로.</li>
</ol>6. 식 균 작용 및 막 이해
<ol><li>막 이해 측정, 섹션 3에에서 설명 된 대로 셀을 준비 합니다. 10 μ M의 최종 농도 20 μ M FM 1-43를 포함 하는 매체의 50 μ를 추가 합니다. 후, 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry에 대 한 셀을 준비 합니다. 585 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다. 참고: 막 매매 하는 것은 액체 단계 보다 더 빠른, 10 분 1 h26보다 사용 하기 더 적절 한 시간 포인트입니다. 형광 막에 통합 하는 경우에 대체 염료 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>
붙일 이라는 구슬 또는 박테리아를 사용 하 여 측정 하는 식 균 작용. 그들은 앞으로 하 여 Dictyostelium 에서 사이드24분산형 형광 효 모를 사용할 수 없습니다. 섹션 3에서에서 설명한 대로 셀을 설정 하 고 설명된27분석.<ol>
<li>측정을 먹어서 구슬의 노란-녹색 구슬 세척 하 고 같이 cytometry 준비 하기 전에 1 h 5 x 107 구슬/mL (1.75, 2 μ m) 또는 1 x 108 구슬/mL (1, 1.5 μ m)의 최종 농도에 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 표시 추가 3.3 섹션입니다. 525 nm 채널 또는 유사한, 흥분 시키기 위해 블루 레이저를 사용 하 여 측정 합니다. 참고: 높은 농도 세포 분리 이어질 것입니다.</li>
		<li>박테리아의 식 균 작용을 측정, 텍사스-레드 분류 대장균 bioparticles 세척 하 고 섹션 3.3에서 cytometry 준비 하기 전에 섹션 3.2 ~ 1 x 108 박테리아/mL 1 h에에서 설명 된 대로 추가 합니다. 610 nm 채널 또는 유사한, 자극 하는 노란색-녹색 레이저를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bloomfield, G., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uses+and+abuses+of+macropinocytosis.">Uses and abuses of macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 129 (14), 2697-2705 (2016).</li><li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocompatibility+complex+class+II+compartment:+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products.">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (2), 389-400 (1995).</li><li>Hardt, W. D., Chen, L. M., Schuebel, K. E., Bustelo, X. R., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S.+typhimurium+encodes+an+activator+of+Rho+GTPases+that+induces+membrane+ruffling+and+nuclear+responses+in+host+cells.">S. typhimurium encodes an activator of Rho GTPases that induces membrane ruffling and nuclear responses in host cells.</a> Cell. 93 (5), 815-826 (1998).</li><li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells.">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (9), 3548-3553 (2011).</li><li>Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid-phase+uptake+by+macropinocytosis+in+Dictyostelium.">Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium.</a> Journal of Cell Science. 110, 105-112 (1997).</li><li>Dowrick, P., Kenworthy, P., McCann, B., Warn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+ruffle+formation+and+closure+lead+to+macropinocytosis+in+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor-treated+cells.">Circular ruffle formation and closure lead to macropinocytosis in hepatocyte growth factor/scatter factor-treated cells.</a> European Journal of Cell Biology. 61 (1), 44-53 (1993).</li><li>Buczynski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+two+Dictyostelium+discoideum+genes,+DdPIK1+and+DdPIK2,+encoding+proteins+related+to+mammalian+phosphatidylinositide+3-kinases,+results+in+defects+in+endocytosis,+lysosome+to+postlysosome+transport,+and+actin+cytoskeleton+organization.">Inactivation of two Dictyostelium discoideum genes, DdPIK1 and DdPIK2, encoding proteins related to mammalian phosphatidylinositide 3-kinases, results in defects in endocytosis, lysosome to postlysosome transport, and actin cytoskeleton organization.</a> Journal of Cell Biology. 136, 1271-1286 (1997).</li><li>Araki, N., Johnson, M. T., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+phosphoinositide+3-kinase+in+the+completion+of+macropinocytosis+and+phagocytosis+by+macrophages.">A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages.</a> Journal of Cell Biology. 135 (5), 1249-1260 (1996).</li><li>Araki, N., Egami, Y., Watanabe, Y., Hatae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+metabolism+during+membrane+ruffling+and+macropinosome+formation+in+EGF-stimulated+A431+cells.">Phosphoinositide metabolism during membrane ruffling and macropinosome formation in EGF-stimulated A431 cells.</a> Experimental Cell Research. 313 (7), 1496-1507 (2007).</li><li>Clark, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+uses+ether-linked+inositol+phospholipids+for+intracellular+signalling.">Dictyostelium uses ether-linked inositol phospholipids for intracellular signalling.</a> The EMBO Journal. 33 (19), 2188-2200 (2014).</li><li>Hoeller, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+functions+for+PI3-kinases+in+macropinocytosis.">Two distinct functions for PI3-kinases in macropinocytosis.</a> Journal of Cell Science. 126, 4296-4307 (2013).</li><li>Bar-Sagi, D., Feramisco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+membrane+ruffling+and+fluid-phase+pinocytosis+in+quiescent+fibroblasts+by+ras+proteins.">Induction of membrane ruffling and fluid-phase pinocytosis in quiescent fibroblasts by ras proteins.</a> Science. 233 (4768), 1061-1068 (1986).</li><li>Veltman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane+template+for+macropinocytic+cups.">A plasma membrane template for macropinocytic cups.</a> Elife. 5, e20085 (2016).</li><li>West, M. A., Prescott, A. R., Eskelinen, E. L., Ridley, A. J., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+is+required+for+constitutive+macropinocytosis+by+dendritic+cells+but+does+not+control+its+downregulation.">Rac is required for constitutive macropinocytosis by dendritic cells but does not control its downregulation.</a> Current Biology. 10 (14), 839-848 (2000).</li><li>West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+endocytotic+pathways+in+epidermal+growth+factor-stimulated+human+carcinoma+A431+cells.">Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells.</a> Journal of Cell Biology. 109, 2731-2739 (1989).</li><li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages.">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284 (2016).</li><li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay.">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).</li><li>Clarke, M., Kohler, J., Heuser, J., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+fusion+and+microtubule-based+dynamics+in+the+early+endocytic+pathway+of+Dictyostelium.">Endosome fusion and microtubule-based dynamics in the early endocytic pathway of Dictyostelium.</a> Traffic. 3, 791-800 (2002).</li><li>Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCL12-induced+macropinocytosis+modulates+two+distinct+pathways+to+activate+mTORC1+in+macrophages.">CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).</li><li>Rivero, F., Maniak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+microscopic+methods+for+studying+the+endocytic+pathway.">Quantitative and microscopic methods for studying the endocytic pathway.</a> Methods in Molecular Biology. , 423-438 (2006).</li><li>Bacon, R. A., Cohen, C. J., Lewin, D. A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+mutants+with+temperature-sensitive+defects+in+endocytosis.">Dictyostelium discoideum mutants with temperature-sensitive defects in endocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 127, 387-399 (1994).</li><li>Basu, S., Fey, P., Jimenez-Morales, D., Dodson, R. J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dictyBase+2015:+Expanding+data+and+annotations+in+a+new+software+environment.">dictyBase 2015: Expanding data and annotations in a new software environment.</a> Genesis. 53 (8), 523-534 (2015).</li><li>Williams, T. D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiological+regulation+of+macropinocytosis+during+Dictyostelium+growth+and+development.">The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li><li>Tsujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+functions+of+the+two+talin+homologues+in+Dictyostelium.">Overlapping functions of the two talin homologues in Dictyostelium.</a> Eukaryotic Cell. 7 (5), 906-916 (2008).</li><li>Aguado-Velasco, C., Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulation+of+the+plasma+membrane+in+Dictyostelium.">Circulation of the plasma membrane in Dictyostelium.</a> Molecular Biology of the Cell. 10, 4419-4427 (1999).</li><li>Sattler, N., Monroy, R., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+phagocytosis+and+phagosome+maturation.">Quantitative analysis of phagocytosis and phagosome maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 383-402 (2013).</li><li>Wilkins, A., Chubb, J., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Dictyostelium+RasGEF+is+required+for+normal+endocytosis,+cell+motility+and+multicellular+development.">A novel Dictyostelium RasGEF is required for normal endocytosis, cell motility and multicellular development.</a> Current Biology. 10, 1427-1437 (2000).</li><li>Thomason, P. A., King, J. S., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mroh1,+a+lysosomal+regulator+localized+by+WASH-generated+actin.">Mroh1, a lysosomal regulator localized by WASH-generated actin.</a> Journal of Cell Science. 130 (10), 1785-1795 (2017).</li><li>van Duijn, B., Vogelzang, S. A., Ypey, D. L., van der Molen, L. G., van Haastert, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+chemotaxis+in+Dictyostelium+discoideum+cells+with+a+depolarized+plasma+membrane+potential.">Normal chemotaxis in Dictyostelium discoideum cells with a depolarized plasma membrane potential.</a> Journal of Cell Science. 95, 177-183 (1990).</li><li>Novak, K. D., Peterson, M. D., Reedy, M. C., Titus, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+myosin+I+double+mutants+exhibit+conditional+defects+in+pinocytosis.">Dictyostelium myosin I double mutants exhibit conditional defects in pinocytosis.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1205-1221 (1995).</li><li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+uses+macropinocytosis+and+apoptotic+mimicry+to+enter+host+cells.">Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells.</a> Science. 320 (5875), 531-535 (2008).</li><li>Paschke, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+genetic+engineering+of+both+wild+type+and+axenic+strains+of+Dictyostelium+discoideum.">Rapid and efficient genetic engineering of both wild type and axenic strains of Dictyostelium discoideum.</a> PLoS One. 13 (5), e0196809 (2018).</li><li>Bloomfield, G., Tanaka, Y., Skelton, J., Ivens, A., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+duplications+in+the+genomes+of+laboratory+stocks+of+Dictyostelium+discoideum.">Widespread duplications in the genomes of laboratory stocks of Dictyostelium discoideum.</a> Genome Biology. 9 (4), R75 (2008).</li><li>Fey, P., Dodson, R. J., Basu, S., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+stop+shop+for+everything+Dictyostelium:+dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center+in+2012.">One stop shop for everything Dictyostelium: dictyBase and the Dicty Stock Center in 2012.</a> Methods in Molecular Biology. 983, 59-92 (2013).</li></ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

다른 방법으로 유체 통풍 관을 평가 하는 낮은 처리량, macropinocytosis, 막 통풍 관의 높은 처리량 측정을 허용 하는이 방법에서는, 중요 한 단계는 제자리에서 세포와 세포를 분리 하려면 나트륨 아 지 드를 사용 하 여 세척 또는 Dictyostelium에 의해 식 균 작용입니다. 세포 표면에 부착 하 고 매체 아니다, 그들은 그들 주위 매체 처음 던져진 동안 왼쪽 연결 하 고 버퍼에 침수에 의해 변경 고 다시 던져진. 나트륨 아 지 드, 셀룰러 ATP 고갈 시킨다 고 막30depolarizes, 세포를 분리 하는 데 사용 하 고 또한 세포 생존24를 영향을 주지 않고 exocytosis를 방지 합니다.
이유 왜 특정 스트레인 또는 조건 변경 유체 통풍 관을 확립 유체 통풍 관의 매우 정확 하 게 측정을 매우 신속 하 게 준다 cytometry macropinocytosis Dictyostelium 에 의해 측정을 사용 하 여 추가 조사를 사용 하 여 현미경 검사 법은 필요한24. 또한 주목 해야 한다 그 이전에 게시 결과, 경우에 따라 표시 유체 이해에 차이 (이 경우) 처럼 표면에 성장 하는 돌연변이 체 긴장에 의해 또는 서 스 펜 션 (표준 프로토콜)로31떨고. 이 메서드를 사용 하는, 드문 경우에, 명백한 유체 글귀 결함 보고는 의미 합니다. 또한, 식 균 작용을 측정할 때 입자의 낮은 농도 에서만 사용할 수 있습니다. 먹어서가이 기법으로 판별할 수 있는 최대 속도 여전히 긴장과 조건24사이 식 균 작용에 관련 된 차이 측정 가능 하지만 실제 최대 보다 훨씬 이다. 식 균 작용의 최대 속도 확인 하려면 통풍 관 대체 프로토콜27에 의해 정지를 떨고에 측정 해야 합니다. 그래서이 수정 해야 합니다에 따라 교류 cytometer 설정할 때 셀 비즈를 phagocytosed 측면 분산형, 증가 했다.
그러나 Cytometry 포유류 세포32에서 유체 이해를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 그리고 액체의 더 높은 비율 단계 이해 다른 endocytic 경로 의해 Dictyostelium 에서 보다는 관심사. 또한, 세포는 더 내 면된 dextran의 endocytic 진행 수 있도록 37 ° C에서 트립 신을 사용 하 여 분리 일반적으로. 얼음 처럼 차가운 나트륨 아 지 드 표면 (윌리엄스, 관찰 되지 않은),이 기술을 더 최적화 없이 포유류 세포에 적용 되지 않습니다 만들기에서 분리 하는 세포를 발생 하지 않습니다.
Macropinocytosis의 높은 처리량 측정 Dictyostelium 세포에 억제제, 유전자 변이 또는 유전자 최저의 효과 대 한 신속 하 고 저렴 하 게 화면에 사용 될 가능성이 있다. 돌연변이 직접 부모에 비해 항상 한다. 독자는 Dictyostelium 스트레인에 대 한 기본 설정이 없습니다 이전, DdB 등 NC4 비 axenic 긴장 더 "야생-타입" axenic 것 들 보다는 하 고 axenic 긴장33으로 효과적으로 조작할 수 있습니다. 그렇지 않으면, Ax2 긴장 되는 axenic는 적은 게놈 중복34, 동안 a x 4의 많은 변종 중부 A 녹아웃 해야와 긴장 피해 가능 하면23. 이전에 게시 긴장 가장35Dicty 재고 센터 주문할 수 있습니다.
이 기술은 다른 조건, 저 해제 및 Dictyostelium에 의해 macropinocytosis에 돌연변이의 효과로 가능 했던 것 보다 더 큰 조사 가능성을 허용 한다.

2세포 면역에 의해 항 원 샘플링을 포함 하 여, 병원 체 항목 호스트 셀3, 암 세포 확산4 macropinocytosis에 의해 대규모 일반적인 유체 통풍 관은 여러 생물 학적 상황1, 중요 한과 프리온 질병5의 확산. 포유류 및 Dictyostelium 세포, 말라6,7, 파이 (3,4,5) P38,,910 (비록는 지질의 정확한 본질은 두11다릅니다) 활성화 Ras12,13, 그리고 활성화 된 Rac14,15 macropinocytosis에 의해 효율적인 유동성 통풍 관에 대 한 중요 하다 macropinocytic 패치는 어떻게 하는 것에 대 한 많은 의문점이 남아 있지만 형성, 조직 되 고 결국 내 면. Macropinocytosis의 보다 포괄적인 이해를의 개발을 허용 하도록 더 많은 단백질 macropinocytosis, 그리고 어떻게 그들은 다양 한 생물학 문맥에서 중요 하다의 후속 결정에 대 한 중요 한 발견 다양 한 조건에 대 한 치료 대상.
Dictyostelium macropinocytosis을 공부에 대 한 이상적인 모델 시스템입니다. 표준 실험실 긴장에 제정 macropinocytosis의 높은 수준을 의미 그 유체 통풍 관 이상 90% macropinocytosis6인. Macropinocytosis를 전적으로 macropinocytosis 때문에 유체 통풍 관의 비율은 훨씬 낮은 포유류 세포와는 달리 액체 통풍 관을 결정 하 여 측정 될 수 있습니다. Macropinocytosis는 너무 잘 정의 하 고이 시스템에 쉽게 시각된12 마찬가지로 조사에 대 한 뚜렷한 장점을 핵심 보존된 구성 요소는 macropinosome의 다른 시스템에 제공 여러 규제 신호 될 수 있습니다 16 , 17.
포유류 세포에 의해 macropinocytosis를 측정 하는 데 사용 표준 기법 dextran 긍정적인 소포18차지 하는 셀의 영역을 결정 하는 현미경 뒤 짧은 기간 동안 dextran와 펄스 후 세포를 고정 한다. 그러나이 기술은 macropinosomes Dictyostelium19에 보고 되었습니다 하 고 내 면 볼륨을 의미 하는 셀의 단일 평면 고려만 셀을 입력 시 축소의 가능성에 대 한 고려 하지 않습니다. 명확 하지 않습니다. Macropinosomes는 주어진된 시간에, 내 면의 수를 계산의 대체 기술,20같은 단점이 있다. Dictyostelium 를 사용 하 여 이러한 문제를 피할 수 그러나, Dictyostelium 에 의해 유체 통풍 관 측정에 대 한 기존 기술을 상대적으로 노동 집약, 대형을 사용 하 여 셀 및 dextran21양의 있습니다. 셀은 형광 dextran 및 예제는 fluorimeter를 사용 하 여 내 면된 형광의 결정에 대 한 다양 한 시간 지점에서 제거에 높은 밀도에서 동요. 이 낮은 처리량 남아 있지만 cytometry 얻을 인구 수준, 해상도22, 보다는 오히려 단일 셀에 의해 셀이 방법이으로 준비를 분석할 수 있습니다.
여기, 형광 dextran 레이블로 사용 하 여 내 면된 유체 측정 표준 기술을 96 잘 접시 형식에 적응 cytometry 높은 처리량 샘플링 (HTS) 첨부 파일을 사용 하 여 분석 하는 샘플입니다. 셀 시간, 얼음 처럼 차가운 버퍼에 침수에 의해 세척 하 고 5mm 나트륨 아 지 드, exocytosis 중지를 사용 하 여 분리의 미리 정해진 길이 아닌 quenchable 형광 dextran은 먹인 다. 각 잘에서 셀 다음 cytometry에 의해 분석 된다. 이 방법은 위의 방법의 한계를 극복 하 고 적은 리소스를 사용 하 여 관련된 노동 감소 하는 동안 긴장/조건 다 수의 유체 통풍 관의 동시 비교를 허용 하도록 설계 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>LSR_II flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td>Other Flow cytometers can also do this role, e.g. the LSRFortessa by BD</td></tr><tr><td>TRITC-dextran (155 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287</td><td>Other non-quenchable dextrans, and other sizes are also fine</td></tr><tr><td>HL5 medium</td><td>Formedium</td><td>HLGCFG</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Any flat-bottom tissue culture treated 96-well plate will work</td></tr><tr><td>Dihydrostreptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1517</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium</td><td>Formdium</td><td>AMP50</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin monosulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>VWR</td><td>103694M</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate hydrate</td><td>VWR</td><td>25169.295</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>VWR</td><td>1.02382.0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phopshate</td><td>VWR</td><td>1.04877.1000</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>1.05104.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter</td><td>Perkin-Elmer</td><td>LS 50 B</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Thermofisher</td><td>T35356</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.00 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.50 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>09719-10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 1.75 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>17687-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG-carboxy microspheres 2.00 &amp;micro;m</td><td>Polysciences</td><td>09847-5</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; bioparticles</td><td>Thermofisher</td><td>E2863</td><td></td></tr><tr><td>Flow-set fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607007</td><td>Calibration Beads</td></tr><tr><td>SM agar</td><td>Formedium</td><td>SMACFG</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Elkay Laboratory Products</td><td>E25-PS22-50S</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom polystyrene tubes</td><td>Corning</td><td>352058</td><td>Use a tube that will fit onto your flow cytometer.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Repeating pipette</td><td>Eppendorf</td><td>M4-SK</td><td></td></tr><tr><td>5 mL repeating pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>30089650</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>70920</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput measurement of dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry

Macropinocytosis에 의해 대규모 일반적인 유체 통풍 관은 특정 암 세포, 항 샘플링, 호스트 세포 내 습 및 신경 퇴행 성 질환의 확산의 확산에 대 한 중요 하다. Dictyostelium discoideum 아메바의 일반적으로 사용 되는 실험실 긴장 매우 높은 유체 흡수 속도 영양소 매체, 90% 이상의 이다 macropinocytosis 때문에 성장 하는 때 있다. 또한, 많은 포유류 macropinocytosis의 알려진된 핵심 구성 요소 macropinocytosis를 공부 하는 우수한 모델 시스템을 만드는 존재도 있습니다. 여기, 형광 dextran 레이블로 사용 하 여 내 면된 유체 측정 표준 기술을 96 잘 접시 형식에 적응 cytometry 높은 처리량 샘플링 (HTS) 첨부 파일을 사용 하 여 분석 하는 샘플입니다.
셀 시간, 얼음 처럼 차가운 버퍼에 침수에 의해 세척 하 고 5mm 나트륨 아 지 드, exocytosis 중지를 사용 하 여 분리의 미리 정해진 길이 아닌 quenchable 형광 dextran은 먹인 다. 각 잘에서 셀 다음 cytometry에 의해 분석 된다. 메서드 또한 막 통풍 관 및 형광 구슬 또는 박테리아의 먹어서 측정 적용할 수 있습니다.
이 메서드는 높은 처리량, 노동 및 리소스 효율적인 방식으로 Dictyostelium 에 의해 유체 통풍 관의 측정을 허용 하도록 설계 되었습니다. 그것은 여러 변종 (예: 녹아웃 유전자의 돌연변이)의 동시 비교를 허용 한다 (예: 다른 미디어에서 세포 또는 억제제의 다른 농도로 처리) 병렬에서 시간 과정을 단순화.

일단 기술 수행을 셀 dextran 로드 되며 분석 (그림 1)에 대 한 준비 흐름 cytometer는 차단 되지 않습니다 확인 하 고 그림 2A에 표시 된 셀 처럼 앞으로 분산형/사이드 분산형 프로 파일을 조정. 컴퓨터 차단 되 면 그림 2B에 표시 하는 것을 볼 것 이다 하 고 계속 하기 전에 차단 해야. 매개 변수 표시 제어 axenic 세포는 긴 시간 지점에서 높은 내 면된 dextran 형광 및 짧은 것 들에서 낮은 내 면된 형광을 확인 (그림 2C).
돌연변이 차이점을 찾고, 그것은 가능성이 있을 것 세 가지 고기 중 하나입니다. 돌연변이 정상적인 유체 이해를 할 수 있습니다., 그들은 부분적인 결함을 가질 수 있습니다. 또는 유체 통풍 관을 완전히 폐지 될 수 있습니다. 표준 실험실 긴장 Ax2, 돌연변이 50% 감소 유체 글귀 (Ax2 rasG-14)이 경우 그림 2D 표시 정상적인 유체 글귀와 스트레인 고 하나 폐지 유체 글귀 (Ax3 gefB-28). 평균 평균 유체 통풍 관 (섹션 3.5)를 가져오고 ( 그림 3B)와 같이 내 면 액체의 볼륨을 계산 하거나 컨트롤에 데이터를 비교 하 여 그것을 사용 하 여 ( 그림 4B 에서 것과 같이 그리고 4 C).
그림 3A와 같이 유체 이해 시간 과정을 수행할 때 내 면된 형광 60-90 분, 후는 dextran exocytosed 될 시작 증가 한다 고 고원 (그림 3B)에 도달 하면. 표준 시간 포인트 60 분 사용 하는 좋은 신호를 얻을 수 있습니다 따라서 다른 돌연변이/조건에서 macropinocytosis를 비교 하 고 신호가 손실 exocytosis. 뮤턴트 exocytosis 방해 심각 고원29를 도달 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.
대부분의 경우에 높은 억제 물 농도에 거의 아무것도에 아래로 갈 것 이다 때 치료 세포 Dictyostelium ( 그림 4A에서최대 설정)에서 macropinocytosis에 대 한 효과적인 억제제로 1 시간에 내 면 dextran (그림 4B)입니다. 그러나 일부 억제제 100% 효과가 되지 않을 수 있습니다,, 예를 들면 nocodazole만 심하게 추가 될 때 macropinocytosis에 의해 유체 통풍 관의 50%까지를 억제 (그림 4C). 억제제는 효과가 있다면, 셀 컨트롤로, dextran의 비슷한 금액을 internalize 것입니다 그리고 형광 감소 표시 되지 않습니다. 이 기술은 억제제 치료를 최적화 소요 된 시간을 줄이고 다른 억제제와 억제 물 농도 매우 신속 하 게, macropinocytosis에 의해 유체 통풍 관에 영향에 대 한 상영 될의 큰 범위 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig2.jpg"> 그림 2: 흐름 cytometer 및 대표 데이터의 설정. (A) 셀을 쉽게 구분할 수 있도록 앞으로 산포 (FSC) 및 셀 측면 살포 (SSC) 프로 파일을 설정 해야 합니다. Ax2 셀 모양을의 예가 표시 됩니다. (B) 교류 cytometer 차단 된 경우,이 예제와 같이 셀 매우 낮은 측면 분산형이 있다. 레이저는 fluorophores을 제대로 자극 하지 것입니다 그리고 기계 되어야 하지 차단 된 계속 하기 전에. 기계를 차단 하는 동안 얻은 모든 데이터를 폐기 해야한다. (C) 형광 설정 해야 0 분 이해 예제는 셀에 대 한 인 큐베이 팅 되었습니다 때 낮은 형광 형광 매체에 더 이상 201824윌리엄스 및 케이에서 가져온이 예제와 같이. (D) 예 정상 macropinocytosis (Ax2, 녹색)으로 1 시간에 대 한 TRITC dextran와 인 큐베이 팅 하는 셀의 macropinocytosis (Ax2 rasG-, HM172614, 오렌지)을 감소 하 고 macropinocytosis (Ax3 gefB-폐지 HM177628, 블루)입니다. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig3.jpg"> 그림 3: 96 잘 접시에서 액체 이해 시간-과정을 수행. (A) Dextran 추가 해야 샘플의 각 집합에 순차적으로, 동일한 끝 시간. 다음 우물을 세척, 분리 하 고, cytometry에 의해 내 면된 형광을 측정. 예 배는 dextran을 추가 하려면 여기에 표시 됩니다. (B) 유체 이해 시간-과정 Ax2 셀의 96 잘 접시에서 수행합니다. 윌리엄스 & 케이에서 가져온 201824, 오차 막대 표시 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58434/58434fig4.jpg"> 그림 4: 유체 글귀 복용량 응답 곡선. (A) 의,이 경우는 PI3K 억제제 LY294002, HL5 1 mg/mL TRITC-dextran 이중 원하는 최종 최대 농도에서 포함 된 화합물을 추가. HL5 성장 매체 + 1 mg/mL dextran 차량 조건 당 200 µ L 매체의 희석 시리즈를 생성 하기 위해 다양 한 비율에서 혼자 포함 믹스. 세척 하 고 내 면된 형광을 측정 하기 전에 웰 스 1 h에 정상적으로 추가 합니다. ((B)) Ax2 세포 A에서 LY294002 포함 된 매체와 인 큐베이 팅에 대 한 유체 글귀 복용량 응답 곡선. 윌리엄스 & 케이 201824에서 적응. 유체 통풍 치료 컨트롤에 정규화 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차를 표시. ((C)) Ax2 세포는 nocodazole와 인 큐베이 팅에 대 한 유체 글귀 복용량 응답 곡선. 윌리엄스 & 케이 201824에서 적응. 유체 통풍 치료 컨트롤에 정규화 됩니다. 오차 막대는 3 개의 독립적인 실험의 표준 오차를 표시. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/58434/58434fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, 대규모 일반적인 유체 이해, 임상 생물학 면역학, 감염, 암, 및 신경 퇴행 성 질환 등의 많은 분야에서 중요 하다. 여기, 기존 기술을 높은 처리량, 단일 셀 해상도 macropinocytosis 모델 유기 체 Dictyostelium discoideum 를 사용 하 여 macropinocytosis의 측정 cytometry 흐름 수 있도록 적응 되었습니다.

Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

7.7K 조회수.  MRC-Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK. Macropinocytosis, 대규모 일반적인 유체 이해, 임상 생물학 면역학, 감염, 암, 및 신경 퇴행 성 질환 등의 많은 분야에서 중요 하다. 여기, 기존 기술을 높은 처리량, 단일 셀 해상도 macropinocytosis 모델 유기 체 Dictyostelium discoideum 를 사용 하 여 macropinocytosis의 측정 cytometry 흐름 수 있도록 적응 되었습니다.

비디오: High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

생물학

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.

이중 불소공포증 비율 현미경 검사를 사용하여 매크로피노좀의 pH, 레독스 화학 및 분해 능력 측정

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in neurological diseases including neurodegeneration and stroke. CNS-MPs are involved in phagocytic clearance of pathological proteins, debris and neuronal synapses, each with distinct underlying molecular pathways. Characterizing these phagocytic properties can provide a functional readout that compliments molecular profiling of microglia using traditional flow cytometry, transcriptomics and proteomics approaches. Phagocytic profiling of microglia has relied on microscopic visualization and in vitro cultures of mouse neonatal microglia. The former approach suffers from limited sampling while the latter approach is inherently poorly reflective of the true in vivo state of adult CNS-MPs. This paper describes optimized protocols to phenotype phagocytic properties of acutely-isolated mouse CNS-MPs by flow cytometry. CNS-MPs are acutely isolated from adult mouse brain using mechanical dissociation followed by density gradient centrifugation, incubated with fluorescent microspheres or fluorescent A&#946; fibrils, washed, and then labeled with panels of antibodies against surface markers (CD11b, CD45). Using this approach, it is possible to compare phagocytic properties of brain-resident microglia with CNS-infiltrating macrophages and then assess the effect of aging and disease pathology on these phagocytic phenotypes. This rapid method also holds potential to functionally phenotype acutely-isolated human CNS-MPs from post-mortem or surgical brain specimens. Additionally, specific mechanisms of phagocytosis by CNS-MP subsets can be investigated by inhibiting select phagocytic pathways.

Assessment of phagocytic properties of microglia and brain macrophages can provide a valuable functional dimension to molecular profiling studies. We describe a validated protocol that uses flow cytometry to rapidly and reliably quantify phagocytosis of fluorescent microspheres and amyloid beta fibrils by acutely-isolated microglia and brain macrophages from mouse models.

Microglia and central nervous system (CNS)-infiltrating macrophages, collectively called CNS mononuclear phagocytes (CNS-MPs), play central roles in ...

신경과학

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴을 위한 유세포분석 기반 분석

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

저자 스포트라이트: 정신신경면역학의 기술 혁신을 통한 이해 증진

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Quantitative Assessment of Macropinocytosis in mTORC1-Hyperactive Cells using Flow Cytometry

Macropinocytosis is a highly conserved, actin-dependent endocytic process that allows the uptake of extracellular material, including proteins and lipids. In proliferating cells, macropinocytosis can deliver extracellular nutrients to the lysosome, processed into critical macromolecule building blocks. Recent studies have highlighted the dependence of multiple cancers on macropinocytosis, including breast, colorectal and pancreatic cancer. Ras mutations are thought to be the driver events behind macropinocytosis initiation, leading to the activation of cellular anabolic processes via the mTORC1 signaling pathway. Interestingly, mTORC1 can also be activated by macropinocytosis independently of Ras. Therefore, macropinocytosis represents a metabolic vulnerability that can be leveraged to target macropinocytic tumors by limiting their access to nutrients therapeutically.
In Tuberous Sclerosis Complex (TSC) and Lymphangioleiomyomatosis (LAM), mTORC1-hyperactivation leads to enhanced macropinocytosis and metabolic reprogramming. Here, we describe a flow cytometry-based protocol to assess macropinocytosis in mammalian cells quantitatively. TSC2-deficient MEFs are employed, which exhibit aberrant activation of mTORC1 and have been shown to have increased macropinocytosis compared to TSC2-expressing cells. Cells treated with pharmacologic inhibitors of macropinocytosis are incubated with fluorescently labeled, lysine-fixable, 70 kDa dextran, or fluorescently labeled bovine serum albumin (BSA) assayed by flow cytometry. To date, robust image-based techniques have been developed to quantitatively assess macropinocytosis in tumor cells in vitro and in vivo. This analysis provides a quantitative assessment of macropinocytosis in multiple experimental conditions and complements existing image-based techniques.

This protocol provides experimental tools to evaluate macropinocytic uptake of nutrients (carbohydrate and protein) by mTORC1-hyperactive cells. Detailed steps to quantify the uptake of fluorescently labeled dextran and bovine serum albumin (BSA) are described.

Macropinocytosis is a highly conserved, actin-dependent endocytic process that allows the uptake of extracellular material, including proteins and lipids. ...

Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

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대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

이중 불소공포증 비율 현미경 검사를 사용하여 매크로피노좀의 pH, 레독스 화학 및 분해 능력 측정

Flow Cytometry Approach to Characterize Phagocytic Properties of Acutely-Isolated Adult Microglia and Brain Macrophages In Vitro

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Dictyostelium discoideum 응답 심각한 기계적인 자극의 평가

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

Quantitative Assessment of Macropinocytosis in mTORC1-Hyperactive Cells using Flow Cytometry