감사 합니다 멜로디 Neely, 존 앨런, 바젤 Abuaita, 그리고 zebrafish 모델을 개발 하는 데 그들의 노력에 대 한도 나 Runft. 여기에서 보고 된 연구는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 수상 번호 R21AI095520 및 R01AI127390 (제프리 H. Withey) 하에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 웨인 주립 대학에 의해 승인 되었습니다. 이 메서드는 Runft 외 에 처음 설명 했다 12
1입니다. 장 식민지 수준 결정
참고: 창 자 식민지는 zebrafish 모델에서 가장 유용한 통계 다양 한 V. cholerae 긴장의 상대적인 적합성 또는 돌연변이 또는 유전자 녹아웃의 효과 비교 하는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>침수로 zebrafish의 접종 참고:이 즉, 노출의 감염의 자연 과정을 유사합니다.<ol>
<li>V. cholerae의 준비
		<ol>
<li>격리 V. cholerae와 lysogeny 국물 (파운드)의 5 mL을 접종 한 파운드에서 식민지 접시 및 6-8 h (야간 문화)에 대 한 37 ° C (180 rpm)를 흔들어에서 품 어.</li>
			<li>위의 숙박 문화 50 µ L로 250 mL 원뿔 플라스 크에 신선한 압력가 파운드 매체의 25 mL 접종 16-18 h 37 ° C (150 rpm)를 떨고에 대 한 그것을 품 어.</li>
			<li>600에서 광학 밀도 읽고 mL 당 박테리아의 수를 추정 하는 야간 문화의 1/10 희석의 nm (OD600) (OD600 = 1 ~ 109 CFU/mL 이다.)</li>
			<li>피 펫과 미디어 10 분 제거에 대 한 6000 g에서 원심 분리 하 여 셀을 수확 하거나 살 균 제 솔루션으로 그것을 부 어. 1 x 1010 ml PBS의 1 x 107 사이 일반적으로 원하는 농도에 살 균 PBS에 셀 resuspend 참고: 여기, 우리가 압력가 역방향 삼 투 물 살 균 감염 물 60 mg/L 바다 소금 포함를 참조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
접종 및 배양
		<ol>
<li>살 균 감염 물 200 mL를 포함 하는 400 mL 비 커에 4 개 또는 5 개의 zebrafish를 놓습니다.</li>
			<li>감염 물 200 mL에 원하는 감염 농도 (일반적으로 5 x 104 5 x 107 CFU/mL)를 (에서 단계 1.1.1.4.) V. cholerae의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>밖으로 점프에서 물고기를 방지 하기 위해 구멍이 뚫린된 뚜껑으로 비 커를 커버 200 µ L 팁 상자 상단의 이것을 위해 잘 작동합니다.</li>
			<li>각 비 커에 레이블을 고 그들 유리 전면 인큐베이터 28 ° C에 실험의 기간에 대 한 설정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
일시적인 노출에 대 한 절차 참고: inoculating 박테리아의 제거 다음 V. cholerae (일반적으로 6 h)에 일시적인 노출은 전송 공부 및 배설된 박테리아의 더 정확한 정량화에 대 한 유용 합니다.<ol>
<li>노출의 6 h 후 엄마 랑 물고기를 수집을 통해 비 커 물 밖으로 붓는 다. 표 백제는 V. cholerae죽 일 용기에 감염 된 물을 삭제 합니다.</li>
			<li>살 균 감염 물 200 mL의 비 커에 제거 된 물고기를 놓습니다. 물고기에서 표면 박테리아를 제거 하는 5 분이 깨끗 한 물에서 수영 하는 물고기를 허용 합니다.</li>
			<li>Net 절차 (1.2.2 단계)를 반복 하 고 200 살 균 감염 물의 새로운 비 커에 물고기를 놓습니다. 실험의 기간에 대 한이 비 커에서 물고기를 유지.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>안락사
	<ol>
<li>실험은의 원하는 끝점에 도달 하면 감염의 샘플에 물을 받아 (15 mL 보통 충분 한) 수 있도록 배설된 세균 수와 측정 (mucin 분석 결과, 단백질 콘텐츠, 마약 등), 설사의 경우 원하는 (2 절).</li>
		<li>엄마 랑 (물고기를 수집)를 통해 물의 나머지를 붓고 표 백제는 V. cholerae 물에서 죽 일.</li>
		<li>감염 물 플러스 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine)의 336 µ g/mL를 포함 하는 비 커에 생선을 놓고 실시간에 20 분이 tricaine 솔루션에 물고기를 품 어 참고:는 어망 10% 표 백제 솔루션으로 살 균 되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>해 부
	<ol>
<li>물고기의 준비<ol>
<li>일회용 플라스틱 숟가락으로 tricaine 솔루션에서 물고기를 푸 고 해 표면에 놓습니다.</li>
			<li>위치와 그것의 복 부 측에 위쪽으로 직면 핀 물고기 핀의 무뚝뚝한 끝과 아래 턱을 통해 신체의 중심에서 각도입니다. 또 다른 핀 장소 그냥 시체에서 각도 또한 항문 후부.</li>
		</ol>
</li>
		<li>장로의 노출<ol>
<li>70% 에탄올에 보풀 지우기와 물고기의 복 부 표면 면봉.</li>
			<li>70% 에탄올에 담그고와 그들을 불타는 메스와 욕실이 위를 소독.</li>
			<li>비늘을 관통 하 고 메스를 사용 하 여 피부 바로 아래에 세로로 작은 절 개를 확인 합니다. 조심 하지 너무 깊게 잘라 창 자 피부 바로 아래 위치 하 고 있습니다.</li>
			<li>가 위를 사용 하 여 신중 하 게 몸, 피부 수준 보다 더 깊은 절단 및 항문 피하의 길이 따라 절 개를 확장 합니다.</li>
			<li>절 개 개방 수 있도록 생선의 머리 쪽으로 위 두 측면 컷을 확인 합니다.</li>
			<li>본문에서, 핀 낚시 해 표면에 측면 절 개의 각 측에 피부를 고정 합니다. 참고: 핀의 끝은 알코올로 그들을 불타는 의해 이전 멸 균.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
창 자 제거 참고: 창 자는 다른 기관 위에 창백 하 고, 매우 얇은 튜브로 표시 되어야 합니다.<ol>
<li>화 염 소독 된 집게 하 고 전체 장로 (일반적으로 길이 12-15mm)를 제거 하려면 그들을 사용 하 여. 유리 구슬 (단계 1.4.1–1.4.2 참조) 및 PBS 또는 얼음에 파운드 x 1의 1 mL를 포함 하는 균질 관으로 소장을 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>균질
	<ol>
<li>준비 균질 튜브 사전에 따르는 ~1.5 g 1 m m 유리 구슬의 2 mL에 스크류 캡 튜브 (채우려는 약 절반 방법) 하 고 압력가 마로 소독 하 여 그들을 소독.</li>
		<li>살 균 파운드 또는 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>일단 제 브라 내장 추가 (단계 1.3.3.1) 관에, 나사 모자에 매우 긴밀 하 게, 그리고 소용돌이 균질 화기에 튜브 고정.</li>
		<li>1 분 최대 설정에 대 한 샘플을 균질 다음 멋진 ice 1-2 분에 사이클을 반복이 균질 한 번 더 완전 한 균질에 대 한. 참고: 균질에 대 한 여러 가지 대체 방법을 작동 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>장 식민지 수준 측정
	<ol>
<li>각 튜브를 파운드 또는 1 x PBS의 900 µ L을 추가 하 여 (작은 유리 시험관 또는 1.5 mL microcentrifuge 튜브) 튜브는 homogenate의 직렬 희석에 대 한 준비. 각 물고기에 대 한 5-6 튜브를 준비 하 고 첫 번째 튜브에 homogenate의 100 µ L을 추가 하 여 장 homogenate의 10 연속 희석 하 게 vortexing 혼합, 및 다음 두 번째 튜브를 첫 번째 관에서 100 µ L을 추가.</li>
		<li>이 절차를 반복 하 여 모든 희석 준비 되었습니다.</li>
		<li>100-200 µ L 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 스 (스 내성 변종을 사용) 하는 경우의 및 X-걸 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)의 40 µ g/mL에 각 희석의 접시 16-18 h 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>하룻밤 배양 후 플레이트, 자동된 식민지 카운터를 사용 하거나 수동으로 식민지; 계산에 식민지 V. cholerae 계산 마커 팁 계산된 식민지를 표시 하는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>생선 내장 당 CFU 도금 했다 볼륨을 고려, 현 탁 액의 희석 비율 접시 수를 곱하여 결정 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2입니다. 물고기 설사의 측정
참고: 4 개의 서로 다른 통계 물고기 설사를 평가 하기 위해 사용 되었다: 물, 물, 물13물, 그리고는 V. cholerae CFU의 OD600 에서 전반적인 배설된 단백질 수준에서 mucin 수준. 설사는 일반적으로 시각적으로 분명 하 게 된다 V. cholerae 위에서 설명한 대로 하는 제 브라의 노출 후에 대략 6 h.
<ol><li>
Mucin 수준을 결정합니다 참고: Mucin 분 비 V. cholerae 식민 동안 유도 하 고 배설 수준, 특히 초기 감염13의 좋은 측정 이다. Mucin 분석 결과 결정 정기 산 Schiff 분석 결과19에 변형입니다.<ol>
<li>다음 재료 준비: 50% (w/v) 정기 산 재고 솔루션 및 0.1% 주기 산 작업 솔루션 (7% 아세트산 5 mL에 추가 50% 정기 산 주식의 10 µ L-후 즉시 사용), mucin 표준, 96-잘 결정 접시, Schiff의 시 약입니다.<ol>
<li>나트륨 아세테이트 버퍼 (100 m m 나트륨 아세테이트, 5 m m EDTA, pH 5.5와 빙 초 산)에서 (돼지 위 유형 III)에서 mucin의 다음과 같은 금액을 일시 중단 하 여 준비 하는 mucin 표준: 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL, 및 10 µ g/mL. 감염의 100 µ L을 추가 하 여 다음과 같이 분석 결과에 사용 될 각 우물에 물 접시를 준비: 1 x PBS; 공백 위에서 설명한 대로 mucin 표준 또는 물고기 감염에서 물 샘플. 3 중에서 각 샘플을 할.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 잘 멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 혼합 신선한 0.1% 주기 산 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>플라스틱 포장에 접시를 단단히 포장 하 고 그것을 1-1.5 h 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>각 잘, 그리고 그것을 혼합 하는 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 Fuchsin 솔루션 (Schiff의 시 약)의 5-10 분 추가 100 µ L에 대 한 실 온으로 접시를 쿨.</li>
		<li>플라스틱 포장에 접시를 포장 하 고 색상을 개발 했다;까지 락 플랫폼에서 실내 온도에 그것을 품 어 색상은 일반적으로 20 분 560에서 흡 광도 읽고 내 개발 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>플롯 mucin 표준 곡선 (OD560대 µ g/mL mucin 표준). 각 알 수 없의는 OD560 표준 곡선에 내리는 식별 하 고 해당 값에 대 한 해당 mucin 농도 읽고 여 신원 미상의 mucin 레벨을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 수준을 결정합니다 참고: mucin, 외 물에 전체 단백질 수준은 설사 (흐림, 액체의 자)는 물고기에 의해 생산의 수준에 대 한 다른 프록시입니다. 이 절차 표준 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 수준 추정. 단백질 레벨은 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 곡선에 따라 견적 된다.<ol>
<li>혼합 (아래 참고 참조) BSA 기준 중 하나의 100 µ L 또는 감염 물 (감염 된 물고기를 포함 하는 비이 커에서 물) 100 µ L 브래드포드의 900 µ L 일회용 cuvette에 (이것을 위해 잘 작동 하는 피어스 단백질 분석 실험 시 약) 분석 실험 시 약. 2 분 동안 실 온에서 모든 샘플을 품 어. 참고: 다음 BSA 기준 사용 되었다: 1, 800 µ g/mL, 1000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL, 및 25 µ g/mL. BSA 기준 압력가 증류수에 희석 됐다.</li>
		<li>각 표준의 OD660 읽거나는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플.</li>
		<li>플롯 표준 BSA 곡선 (OD660대 µ g/mL). 신원 미상 식별 하 여 각 알 수 없의는 OD660 표준 BSA 곡선에 고 읽고 해당 값에 대 한 해당 mucin 농도의 단백질 수준을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
측정 세600 참고: 여러 h 및 간단한 세600 결정이 척도를 사용할 수 있습니다 후 설사 (흐림, 액체의 자)의 존재 가시 분명 하다.<ol>
<li>균일 하 게 배포 내용을 여러 번 감염 물에 들어 있는 튜브를 반전. 일회용 cuvette을 물 샘플의 1 mL를 추가 합니다. 살 균 감염 물 1 mL를 사용 하 여 부정적인 제어로.</li>
		<li>"빈" 측정 600에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 수행 nm 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여. 600 nm 및 기록에서 각 물 샘플을 읽고 결과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
감염 후 V. cholerae CFU/mL을 배설 참고: 설사는 zebrafish에 의해 생산의 주요 구성 요소는 배설 cholerae 대. CFU/mL의 결정 생선 창 자에 박테리아 복제 전송 실험에서 감염 복용량의 예측 같은 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 이 측정은 최고의 자리를 차지 하는 일시적인 감염 때 이루어집니다. 24 h 감염을 사용 하는이 분석 결과 결합된 inoculum 플러스는 배설 V. cholerae측정할 것 이다.<ol>
<li>원하는 시간 지점에서 물 샘플을 받아 그리고 연속적으로 앞에서 설명한 대로 희석.</li>
		<li>선택적인 매체 (파운드 천 스 또는 다른 적절 한 항생제 또는 DCL 포함)에 직렬 희석 접시 하 고 24 시간 30 ° C에서 그들을 품 어.</li>
		<li>식민지를 계산 합니다. 1.5 단계에서 설명한 대로 물의 mL 당 CFU를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

Zebrafish는 V. cholerae 공부에 대 한 상대적으로 새로운 모델 이지만 cholerae 대 생물학과 병 인11,,1213 의 이전에 알려지지 않은 측면의 미래의 발견에 대 한 많은 약속을 보유 하 고 . 성인 zebrafish 모델은 모두 자연의 장점이 그대로, 성숙한 장 microbiota 및 환경 모델 포함 V. cholerae 호스트. 모델의 두 가지 주요 인?...

비 브리 오 cholerae 산발적 설사1,2뿐만 아니라 인간의 질병 콜레라 발생 한 수생, 그램 음성 박테리아 이다. V. cholerae 종종 다른 해양 유기 체와 관련 된 전 세계의 많은 지역에서 환경에서 발견 된다. 이러한 연결 생물 등 플랑크톤, 곤충 계란 질량, 조개, 척 추가 있는 물고기 종3,,45,6,7. 여러 연구 V. cholerae 다른 지역7,8,,910에 물고기의 창 자 책자에서 고립 있다. V. cholerae의 물고기에 나타냅니다 물고기 환경 저수지로 작동할 수 있습니다. 물고기는 인 간에 게 질병을 전송 및 V. cholerae 긴장6의 지리적 확산에 연루 또한 수 있습니다.
어떻게 V. cholerae 물고기 상호 작용 이해, Danio rerio로 더 잘 알려진 zebrafish, 콜레라 대e11공부를 위한 모델 시스템으로 개발 되었습니다. Zebrafish는 남부 아시아, V. cholerae의초기 저수지 생각 된다 벵골만 지역 포함. 1817 년에 첫 콜레라 유행 성 시작, 이전 콜레라 무엇입니까 지금 인도 그리고 방글라데시 밖에 보고 되지 했다. 따라서, zebrafish, V. cholerae 거의 확실히 연관 서로 진화 시간의 척도에 그 zebrafish는 자연 환경12 V. cholerae 호스트 제안.
V. cholerae를 위한 zebrafish 모델 간단 실행 하 고 병원 성 전체를 공부 하는 데 사용 수 라이프 사이클 cholerae 대 . 물고기는 V. cholerae의알려진된 번호와 주사 된 물에 입욕 하 여 V. cholerae에 노출 됩니다. 몇 시간 장 식민지, 일어난다 뒤에 설사의 생산. 설사는 mucin, 단백질, 배설된 박테리아 및 다른 장 내용으로 이루어져 있다. 몇 가지 간단한 측정13를 사용 하 여 설사의 정도 측정할 수 있습니다. V. cholerae 감염 된 물고기에 의해 배설 되는 갈 수 있습니다 다음 순진한 물고기를 감염 감염 주기를 완료. 따라서, zebrafish 모델 cholerae 대 인간의 질병 과정12,14이.
V. cholerae 가장 자주 사용 되는 동물 모델 생쥐와 토끼14,15,16,,1718역사적으로 있다. 이러한 모델 V. cholerae pathogenesis의 우리의 지식에 추가 하는 수단이 되었습니다. 그러나, 쥐와 토끼 자연 V. cholerae 되지 않습니다 때문에 호스트, V. cholerae 라이프 사이클의 어떤 측면 공부 될 수 있는 제한이 있다. V. cholerae 식민 쥐와 토끼의 일반적으로 항생제 장 microbiota 손상 전처리 나를 장 microbiota를 필요 합니다. 두 모델 모두 gavage 소화를 박테리아를 소개 또는 직접 창 자 박테리아를 주입 하는 수술 조작 필요 합니다. 성인 물고기는 그대로 장 microbiota 쉽게 식민지 화와 감염 과정 조작 필요 없이 자연스럽 게, 발생 Zebrafish 이점을.
현재 작업 V. cholerae 감염에서 모델로 zebrafish의 사용률을 보여 줍니다. 감염, 해 부, 식민지 V. cholerae, 열거 및 V. cholerae 기인한 설사의 정량화 기술된12,13될 것입니다. 이 모델 V. cholerae 질병 프로세스와 cholerae 대 환경 생활에 관심 있는 과학자에 게 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td><td>Auto Flow</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex homogenizer</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Machine</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated colony counter</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml glass beakers</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforated lids</td><td>Microtip holder with holes from tip box</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic spoons</td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>Fish Tank System</td><td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO Water Purifier</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>Fish net</td><td>Marina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fish food</td><td>Tetra fin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp</td><td>Red jungle brand</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>2 ml screw cap tubes</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>1 mm glass beads</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads for spreading</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>Petri plate</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Corning Falcon, Corning, NY</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Test tubes</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipette</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>Micro pipettes</td><td>Sartorius Biohit, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 mL</td><td></td></tr><tr><td>periodic acid</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>Mucin from porcine stomach</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Teast Extract</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

비 브리 오 cholerae 는 최고의 인간 질병 콜레라를 일으키는 전염 성 대리인 으로입니다. 인간 숙주 밖에 V. cholerae 주로 존재 수생 환경, 높은 수생 종의 다양 한 상호 작용 하는 곳에. 척 추가 있는 물고기 환경 호스트에 알려져 있습니다 그리고 자연에서 잠재적인 cholerae 대 저수지. V. cholerae와 모두 zebrafish로 일반적으로 알려진 teleost 물고기 종 Danio rerio, 인도 아 대륙에서 발생 한 수생 환경에 오랜 상호 작용을 제안. Zebrafish는 공부 하는 생물학, 전염 성 질환 등의 여러 측면에 대 한 이상적인 모델 유기 체. Zebrafish 수 있을 쉽고 빠르게 식민지 V. cholerae로 물에 노출 후. V. cholerae 여 장 식민지 설사의 생산 및 복제 cholerae V.배설 이끌어 낸다. 이러한 박테리아 수를 배설 후 새로운 물고기 호스트를 식민지로 이동. 여기, V. cholerae평가 하는 방법을 보여 줍니다-장 식민지 zebrafish에 V. cholerae계량 하는 방법-zebrafish 설사 유발. 식민 모델은 관심사의 유전자 또는 환경 생존을 위한 호스트 식민지에 대 한 중요 한 있을 수 있습니다 여부를 공부 하는 연구원에 게 유용 해야 한다. Zebrafish 설사의 정량화 zebrafish 모델 시스템으로 탐험에 관심이 어떤 장 병원 체를 공부 하는 연구자에 유용 해야 한다.

V. cholerae zebrafish 장 책자의 식민
우리가 관찰 하는 전형적인 식민 레벨의 예를 제공 하려면 우리 5 x 106 CFU 유행 성 엘 토르 V. cholerae 긴장의 N16961 여러 zebrafish를 포함 하는 비 커에 물 200 mL에 접종. 감염의 6 h 후 생선 신선한 물에 씻 겨 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 압력가 감염 물 200 mL의 비 커에 전송. 18 h...

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish는 자연 비 브리 오 cholerae 호스트 하 고 정리 하 고 전송 식민지 로부터 전체 감염 주기를 연구 하는 데 사용 수 있습니다. 여기, V. cholerae 식민 수준을 평가 하 고 계량 zebrafish에 설사 하는 방법을 보여 줍니다.

비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K 조회수.  Wayne State University School of Medicine. Zebrafish는 자연 비 브리 오 cholerae 호스트 하 고 정리 하 고 전송 식민지 로부터 전체 감염 주기를 연구 하는 데 사용 수 있습니다. 여기, V. cholerae 식민 수준을 평가 하 고 계량 zebrafish에 설사 하는 방법을 보여 줍니다.

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Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Swimbladder 주입에 의해 애벌레 Zebrafish의 점막 칸디다증 모델링

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

연구

면역학 및 감염병학

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

발생학

GF 제브라피시 모델 최적화: 생성, 유지 관리 및 미생물 연구

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

저자 스포트라이트: 미생물군-숙주 관계 연구를 위한 무균 제브라피시 확립

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

DNA 기반 백신의 임상 검사에 대 한 성인 Zebrafish의 예방접종

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정

요약

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진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

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Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여