Name: visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

우리는 진심으 그의 실험실 자원의 사용을 제공 하기 위한 닥터 무스타파 Khokha, 예일 대학, 감사 합니다. 우리는 우수한 기술 지원 씨 밍-지 우에 게 감사입니다. EF는 HHMI 탐정입니다. 이 작품은 존 Monsky와 제니퍼 Weis Monsky 라임 병 연구 기금에서 선물에 의해 지원 되었다.

1입니다. DNA 템플렛 준비
<ol><li>다운로드 16S rRNA 순서 특정 세균 장군 각 하는 NCBI 데이터베이스 디자인과 연쇄 반응 (PCR) 호환에서 앞으로 역 앞에서 설명한 대로 속 특정 영역 (200 ~ 250 기본 쌍 롱)를 증폭 뇌관 19. 또한 리소스를 참조 오픈 소스 데이터베이스 실바20,21 , probeBase22 온라인 rRNA 타겟 oligonucleotide 조사 및 뇌관, RNA 프로브 일부 세균 속에 대 한 상업적으로 있을 수 있습니다 사용할 수 있습니다. 참고: 특정 특정 속 유전자 영역을 선택 하 여 설계 된 뇌관 관련된 세균 속을 증폭 하지 않습니다 확인 중요 하다. 이것은 교 잡 유전자/장군 전용 프로브를 중요입니다.</li>
	<li>마우스에 24, 48 또는 72 h 틱 용기를 해 부하 고 RNA와 기술된 이전23으로 틱 용기에서 cDNA 준비 진드기 피드. PCR 템플릿으로 사용 cDNA 증폭 속 특정 amplicons thermocycler는을 사용 하 여. 1.5 %agarose 젤에 PCR-제품/amplicon의 약 수를 실행 하 고는 amplicon 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 자외선 (UV) 빛에서 시각화 하 여 예상 되는 크기에 해당 함을 확인 합니다.</li>
	<li>살 균 소 polymerases (SP6, T7 또는 T3)에 대 한 적합 한 RNA 중 합 효소 발기인을 포함 하는 상용 따 벡터 (자료 테이블)에 박테리아 16S ribosomal RNA amplicon의 클론. 시퀀스는 amplicon의 정체성과 발기인의 각각에 관하여 클론의 방향을 확인 하 클론. 이에 따라, 감각 또는 센스 RNA를 생성 하는 선택의 발기인 프로브 (그림 1)을 결정 합니다.</li>
	<li>1 mg 최대 30 µLfor 제조업체에서 권장 하는 온도에서 2 h 양의 반응에 적절 한 제한 효소로 플라스 미드의 선형화 제한 효소 감 또는 센스 프로브 (그림 1)을 생성 하기 위해 사용 됩니다 발기인에 따라 선택 합니다. 1 %agarose 젤에 다이제스트 반응의 2 µ L의 시각화 하 여 선형화를 확인 합니다.</li>
	<li>상업적으로 이용 가능한 PCR 제품 열 정화 키트를 사용 하 여 소화 DNA의 나머지 28 µ L를 정화 하 고 분 광 광도 계에 의해 DNA 농도 계량. 참고: 일부 감각 프로브 배경 해당 센스 프로브 보다 훨씬 높은 얼룩이 발생할 수 있습니다 그리고 다른 옵션을 탐험 할 수 있습니다. 대체 부정적인 컨트롤 샘플 또는 교 잡의 독특한 패턴을 생성 하는 다른 검색에 나타나지 하는 시퀀스를 인코딩 하는 플라스 미드를 포함 됩니다.</li>
</ol>2. 건설 Digoxygenin UTP RNA의 프로브
<ol><li>100 mM UTP, UTP-10 m m digoxygenin의 25 µ L 및 10 µ L 각 100 m m ATP와 GTP, CTP 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서의 7.5 µ L를 결합 하 여 뉴클레오티드 혼합을 준비 합니다.</li>
	<li>녹음 방송 생체 외에서 수행 상용 T7 또는 Sp6 RNA 중 합 효소 키트를 사용 하 여, 1 µ L의 뉴클레오티드 혼합 (단계 2.1)를 사용 하 여 0.25-1 µ g 템플릿 DNA의. 물으로 20 µ L까지 볼륨을 가져와. 결합 하 고 스핀을 펄스 튜브를 터치 합니다. 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어. 참고: 프로브 건설 소화 플라스 미드 농도 7 ng / µ L, 낮은 하지만 전형적인 농도 15-25 ng / µ L에서이 단계에서 성공 했다. 녹음 방송 반응 또한 37 ° C에서 하룻밤 incubated 수 있습니다 하지만이 RNA 생산량을 크게 증가 하지 않습니다.</li>
	<li>1 µ L의 DNase 추가 (2, 000 단위 / µ L)와 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 10 분을 초과 하지 마십시오 또는 효소 RNA 타락을 시작할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 7.5-8 M 리튬 염화의 30 µ L 냉장 nuclease 무료 물에 RNA 침전을 30 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다. -20 ° c.에 하룻밤 사이 진행 하는 RNA의 강 수를 허용</li>
	<li>4 ° c.에 20 분 동안 17000 x g에서 원심 분리 하 여 RNA를 수집 한번 Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물에서 갓된 75% 에탄올의 1 mL와 펠 릿을 세척 한 다음 원심 분리를 반복 합니다.</li>
	<li>제거 하 고 삭제는 상쾌한, 깨끗 한 종이 타월에 튜브를 반전 10 분 Resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿에 대 한 건조 허용. 쉽게 볼 수 있는 펠 릿 이면 25 µ L에서 resuspend. 펠 릿 매우 작은 또는 표시 되지 않는 경우에 15-20 µ L. resuspend 분 광 광도 계에 의해 RNA 농도의 견적을 얻을. 참고: 일반적인 RNA 농도 범위 200-500 ng / µ L에서.</li>
</ol>3. 시각화 RNA의 RNA의 순도 평가 하기 위해 포름알데히드 RNA 젤 전기 이동 법에 의해 조사
주의: 포름알데히드 포즈 흡입 위험; 따라서, 증기 두건에서 RNA 젤 분석에 필요한 솔루션을 생성 합니다. Ethidium 평범한 사람은 의심된 발암 물질; 관심을가지고 처리 합니다.
<ol><li>앞서 설명한24 고 캐스팅 RNases의 무료 젤 상자에서 젤 1% 포름알데히드 agarose 젤을 준비 합니다. 일단, 젤 상자를 버퍼 (1 x MOPS pH 7.0, 5% 포름알데히드에서)를 실행 하는 x 1을 채우십시오.</li>
	<li>(5 µ L 400 mg/mL ethidium 평범한 사람, MOPS, 35 µ L 포름알데히드, 및 100 µ L formamide x 20 µ L 10) 샘플 버퍼를 준비 합니다. 샘플 버퍼의 8 µ L에 2 µ L RNA 프로브 (단계 2.6)의 결합. 10 분 동안 70 ° C에서 품 어.</li>
	<li>5 mL 50% 글리세롤, 1 mL 10% 포름알데히드, 40 mg bromophenol 블루, 40 mg 자일 렌 cyanol, 0.5 M EDTA (pH 7.5)의 20 µ L를 결합 하 여 RNA 선적 버퍼를 준비 합니다. 사용 후-20 ° c.에이 버퍼 저장</li>
	<li>3.2 단계에서에서 RNA 샘플을 로딩 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 섞으십시오. 얼음에 샘플 튜브를 유지.</li>
	<li>젤으로 단계 3.4에서 전체 샘플 볼륨을 로드 합니다. RNA의 크기를 확인 하려면 함께 단일 가닥 RNA 사다리의 약 수를 로드 합니다. 100 V에서 젤을 실행 하거나 파란색 염료 마이그레이션합니다 젤 아래에 있는 방법의 약 75% 될 때까지. 자외선 젤 이미징 시스템을 사용 하 여에서 RNA를 시각화 한다. 참고: 좋은 품질 RNA 프로브 프로브 (그림 2, 1 레인)의 예상된 크기에 이동성 이산 대역으로 나타나야 합니다. 경우 조사 무마 하 고 더럽혀진 밴드 (그림 22 차선)이 사용할 수 없는 나타납니다.</li>
</ol>4. 틱 용기 수집 및 고정
<ol><li>관심의 시간 포인트 마우스에 먹이 Ixodes scapularis 님프를 수집 합니다. 참고:이 기술을 위해 틱 먹이 48 또는 72 h 일을 위한 최고의.</li>
	<li>해 부 현미경, 가능 한 한 많은 기관에 손상을 피하는 유리 슬라이드에 MEMFA (표 1)에 틱에서 용기를 해 부. MEMFA의 20-30 µ L에서 깨끗 한 현미경 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 진드기의 시체를 떠나 틱의 연골에서 살 균 높은 탄소 철강 면도기 블레이드 #11 조각 머리 지역의 쌍을 사용 하 여. 부드럽게 용기 diverticula 및 침 샘 몸 표 피 밖으로 시체를 누릅니다. 침 샘 및 용기 고 면도날에 용기를 꺼내서 합니다.</li>
	<li>500 µ L MEMFA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배 짱을 수집 합니다. 부드러운 락을 1 시간으로 실내 온도에 튜브를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤 참고: 진드기 침 샘 수 있습니다 또한 해 부와 마찬가지로 고정 되며 스테인드.</li>
	<li>부드럽게 1 mL 얼음 100% 에탄올으로 3 회 세척 하 여 조직을 탈수. 하자 각 씻어 사이의 튜브의 아래쪽에 자연스럽 게 침 몰 하는 배 짱으로 원심 분리는 조직 손상 될 수 있습니다. 장기 저장에 대 한 샘플에서에서 계속 100% 에탄올-20 ° c.</li>
</ol>5. 건설의 메쉬 샘플 바구니와 24-잘 바구니 홀더
<ol><li>바닥 2 mL 또는 5 mL 메스에 온수는 단일 양 날 면도날을 사용 하 여 스냅인 가기 원심 분리기 튜브를 잘라. 주의: 블레이드의 컷이 완료 되기 전에 여러 번 재가 열 될 필요가 있습니다.</li>
	<li>새로운 튜브 오프닝 보다 약간 더 큰 110 µ m 나일론 메시의 사각형 컷. 눌러 그들 함께 가볍게 뜨거운 접시에 매체 낮은 열에 좋은 물개 때까지 튜브의 하단에 메쉬를 본드. 식, 메쉬 튜브 사이의 틈새가 없는지 확인 하 고 초과 메쉬 가장자리 주위를 잘라.</li>
	<li>잘라 구멍 24-잘 접시의 표지에는 단계 5.2에서 만든 샘플 바구니의 입술은 구멍에 앉아 되지가을 통해, 저조한 때 그들은에 배치 됩니다 샘플 바구니의 바닥 줄곧 우물에서에서 앉을 것 이다 설정 합니다 덮개에 있는 구멍.</li>
	<li>이 장착된 바구니 홀더를 사용 하 여 상대적으로 쉽게에 제자리 교 잡 프로토콜의 전체에 대 한 다른 한 접시에서 바구니를 전송. 2 개의 24-잘 접시를 사용 하 여 한 부 화 수행 하는 동안 다른 접시 다음 세척에 대 한 준비가 되어 있도록.</li>
</ol>6. 제자리에서 교 잡: 하루 1 (타이밍: 4-5 h)
<ol><li>전송 용기를 샘플 바구니를 분류, 실험 조건으로 구분 하며 RNA 프로브. 참고: 조건 복제 중 자연 변화에 대 한 계정 당 최소 5 배 짱 얼룩.</li>
	<li>부드럽게 점차적으로 0.1% 비 이온 계면 활성 제 (PTw;와 인산 염 버퍼 염 분의 비율을 증가 시켜 조직에 기포를 소개 하지 않으려면 샘플 리하이드레이션 표 1) 세척에서의 에탄올 참고: 별도로 명시 하지 않는 한 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 모든 세척 완료. 각 바구니에 용기가 완전히 빠져들 것 같은 소유자의 각 잘으로 세척 솔루션의 aliquot 500-600 µ L. DEPC 처리 물 RNA 저하를 방지 하기 위해 모든 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>500 µ L 100% 에탄올에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오.</li>
		<li>75%의 샘플 바구니 당 적어도 500 µ L를 준비, 50% 및 25% 에탄올 PTw. 가장 낮은 가장 높은 에탄올 농도에서 이동 각 에탄올 용액에 5 분 동안 세척 하 여 샘플을 Rehydrate.</li>
		<li>PTw에 4 시간 5 분 대 한 샘플을 씻으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가수분해 k 샘플 permeabilize (10 µ g/mL) 5 분 PTw에.</li>
	<li>RNA 프로브와 교 잡 조직 준비.<ol>
<li>6.2 500 µ L triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0)에서 각 5 분 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 아민 없는 환경에서 샘플을 유지 하기 위해 (표 1)에 설명 된 대로 두 번 샘플을 씻으십시오.</li>
		<li>Triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0) 각, 5 분 동안에 500 µ L 0.25%의 아세트산 무수 물으로 두 번 샘플 처리 후 샘플 PTw 5 분에 두 번 세척. 참고: 아세트산 무수 물 acetylates 프로브를 mRNA의 특정 바인딩 일반적인 정전기 상호 작용을 방지 하는 중요 한 포지티브 차지 무력화 무료 아민.</li>
		<li>PTw에 500 µ L 4 %paraformaldehyde 20 분에 대 한 용기를 수정 후 5 분 동안 PTw에 5 번을 씻어.</li>
		<li>500 µ L 교 잡 버퍼 /in 떨고 물 욕조에 부드러운 동요와 60 ° C에서 1.5-2.5 h 24 잘 플레이트 (표 1)에 24-잘 바구니 홀더에에서 샘플을 배양 하 여 prehybridize. 주 2 프로토콜 (단계 7.1)에 재사용 prehybridization 단계에 사용 되는 교 잡 버퍼를 저장 합니다.</li>
		<li>1 µ g/mL의 최종 농도에 교 잡 버퍼에서 RNA 프로브를 diluting 하 여 프로브 교 잡 솔루션을 준비 합니다.  솔루션과 프로브 교 잡에 60 ° C에서 24-잘 바구니 홀더 떨고 물 목욕 (표 2)에서 하룻밤 부드러운 동요와 함께 샘플을 품 어. 하이브리드 솔루션의 증발을 방지 하기 위해 알루미늄 호 일을 가진 석판 바구니 홀더를 들고 접시 커버.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 제자리에서 교 잡: 하루 2 (타이밍: 4.5-5.5 h)
<ol><li>프로브 교 잡 솔루션에서 샘플을 제거 하 고 전날에서 예약된 교 잡 버퍼에 그들을 배치. 3 분에 대 한 부드러운 동요와 60 ° C에서 품 어. 참고: 프로브 솔루션 저장 될 수 있습니다 다시-20 ° C에서 최대 3 번 교 잡.</li>
	<li>Diluting 20 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) x 2를 준비 DEPC 처리 물 (표 1)에서 x SSC. 샘플 두 번 SSC, x 2와 3 분 후 3 번 2 20 분 동안 씻어 프로브와 교 잡 버퍼의 모든 흔적을 제거 하려면 60 ° C에서 x SSC.</li>
	<li>RNase A (20 µ g/mL)와 RNase T 치료 단일 제거를 37 ° C에서 30 분 동안 SSC 좌초 RNA 프로브 무료 대표 2 x에서1 (10 µ g/mL) 비-때 교배 RNA.</li>
	<li>2와 함께 한 번 세척 실 온에서 10 분 동안 x SSC. 0.2 준비 diluting 2 x SSC x SSC DEPC 처리 물에 다음 0.2로 두 번 씻어 제거 초과 RNases를 60 ° C에서 30 분 동안 x SSC.</li>
	<li>두 번의 maleic 산 버퍼 (MAB; 500 µ L로 씻어 표 1) 10 분 각각에 대 한</li>
	<li>차단 솔루션 (2% 차단 시 약에서 MAB) 1.5-2 h와 함께 샘플을 품 어. 참고: 차단 시 수 분해; 부드러운 난방 해산 에이즈.</li>
	<li>안티 digoxigenin 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 500 µ L 차단 솔루션 1:3,000 희석에 항 체의와 차단 솔루션을 장착 하 고 약 4 시간 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>8. 현장에서 교 잡: 3 일 (타이밍: 하룻밤에 6 h)
<ol><li>5 번 이상 각 500 µ L 초과 항 체를 제거 하는 MAB와 30 분 대 한 샘플을 씻으십시오. 참고: 이러한 세척은 유연 하며 1-2 h, 연장 될 수 있습니다 또는 3-4 세척 효능에 최소한의 영향으로 4 ° C에서 한 하룻밤 세척에 대 한 대체 될 수 있습니다.</li>
	<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼, pH 9.5 (AP 버퍼; 5 분 동안 두 번 씻어 표 1)입니다.</li>
	<li>알칼리 성 인산 가수분해 효소 (자료 테이블)에 대 한 비 기판의 500 µ L를 마지막 세척을 대체 하 여 발 색 반응을 시작 합니다. 알루미늄 호 일 샘플 접시를 커버 하 고 3-5 h 또는 4 ° c.에 하룻밤 실 온에서 진행 하는 얼룩 착 색 반응을 주기적으로 보고 모니터링할 overstaining 피하려고 해 현미경 조직. 참고: 완료 되는 얼룩, 자주색 색조 antisense 조사 샘플, 현미경에서 눈으로 감지 하지만 매우 어두운 될 조직 수 없다는. 얼룩이 4 ° C에서 매우 느리게 진행 하 고 20-24 h까지 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>500 µ L MAB, 5 분 동안 세척 하 여 발 색 반응을 중지 한 후 하룻밤 Bouin의 솔루션에는 조직을 수정. 주의: 처리 연기 후드; Bouin의 솔루션 그것은 부식성 발암 물질입니다.</li>
</ol>9. 현장에서 교 잡: 하루 4 (타이밍: 3-3.5 h)
<ol><li>적어도 7 mL 당 1의 샘플 바구니 준비 diluting 20 x SSC x SSC DEPC 처리 물에. 1에서 4 ~ 6 배 70% 에탄올과 샘플을 세척 하 여 제거 하는 Bouin의 솔루션 x SSC 조직 노란색 이상 될 때까지.</li>
	<li>준비 하는 1에서 75%, 50% 및 25% 에탄올 솔루션의 샘플 바구니 당 500 µ L x SSC. 높은 에탄올 농도에서 낮은 조직 rehydrate 하 이동 각 솔루션에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오. 5 분 동안 두 번 씻어 각에 1 x SSC.</li>
	<li>증기 두건에서 라이트 박스에 90 분 동안 표 백제 해결책 (표 1)에서 샘플을 품 어. 참고:이 단계 샘플 또는 제거할 Bouins 솔루션에서 채색에 어떤 염색을 허용 하 고 명확한 시각화에 대 한 프로브 신호를 향상 시킵니다.</li>
	<li>샘플 1의 500 µ L 두 번 씻어 5 분 x SSC.</li>
	<li>새로운 24-잘 접시의 우물에 샘플 바구니를 반전 하 여 최소한의 피해와 배 짱을 재배치 하 고 전송 피 펫을 사용 하 여 메쉬 바닥을 통해 70% 에탄올으로 씻어. 필요한 경우에-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	<li>그림 3, 와 같이 여러 샘플의 얼룩 패턴에 대 한 개요를 어떤 밝은 분야 현미경으로 24 잘 플레이트 및 보기에 70% 에탄올에 용기를 유지. 그림 4, 그림 5와 같이 개별 내장 밝은 분야 현미경 검사를, 및 그림 6, coverslips에서 100% 글리세롤에 배 짱을 탑재. 플라스틱 주걱을 사용 하 여 부드럽게 조작 하는 최소한의 손상으로 조직. 참고: 글리세롤의 높은 점도 압축에 의해 조직 손상 으로부터 보호 하 고 있습니다 조직 더 높은 배율에서 최적으로 볼 수 있습니다 그런 diverticula의 주의 위치.</li>
	<li>현미경 현미경 특정 이미지 캡처 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 Tiff 이미지는 일반 이미지 편집 소프트웨어를 수출 합니다. 실험적 치료 상대 얼룩 차이 척도를 일반 이미지 분석 소프트웨어 (자료 테이블)를 다운로드 합니다. 분석 소프트웨어 내에서 이미지를 열고 소프트웨어 지침을 사용 하 여 픽셀은 얼룩의 강도 측정 하는 얼룩의 히스토그램 플롯을 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission:+Translational+Aspects.">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).</li><li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut.">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li><li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worlds+within+worlds:+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota.">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li><li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick+microbiome:+the+force+within.">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li><li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence.">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li><li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+microbiome+of+arthropods.">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).</li><li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+ticks,+mice+and+men:+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes.">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li><li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks.">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li><li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphofunctional+changes+in+the+midgut+of+Ixodid+ticks+during+the+life+cycle.">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li><li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conducting+a+microbiome+study.">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li><li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses.">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87 (2014).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li><li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae.">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li><li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization:+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos.">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li><li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections.">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of ticks. , (1991).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete.">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li><li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies.">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li><li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces.">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li><li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project:+improved+data+processing+and+web-based+tools.">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li><li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SILVA+and+&amp;#34;All-species+Living+Tree+Project+(LTP)&amp;#34;+taxonomic+frameworks.">The SILVA and &amp;#34;All-species Living Tree Project (LTP)&amp;#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li><li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers:+new+features+2016.">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li><li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization.">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).</li><li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA.">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li><li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback.">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li><li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis.">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).</li><li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development.">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li><li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+straightforward+DOPE+(double+labeling+of+oligonucleotide+probes)-FISH+(fluorescence+in+situ+hybridization)+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations.">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li><li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner.">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li><li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos.">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057 (2013).</li></ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이것은 병원 체의 arthropod 벡터의 microbiota 공부를 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH) 기술 처음으로 사용. 우리의 프로토콜 개발 개구리 배아25,26와 초파리 에서 공부 하는 데 사용 하나에서 적응 시켰다. 공간적 유전자 성적표를 지역화 하 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡 일상적으로 사용 하 고 밝은 필드 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 일...

Arthropod 벡터에 의해 전송 하는 인간과 가축 병원 체 전세계 발견 된다1, 하지만 효과적인 세계적으로 전염 성 질환의 약 20% 차지 하 고이 병원 균의 대부분에 대 한 안전한 백신은 사용할 수 없습니다. 공생, 공생 그리고 병원 성 미생물, 미생물2, 변조 및 형성 하는 거의 모든 metazoans3 의 상태에서 통칭의 중요 한 역할에 대 한 우리의 이해를 확대 하고있다. 그것은 이제 분명 병원 체의 arthropod 벡터는 또한 본질적인 microbiota 항구 및 이러한 벡터 관련 microbiota 다양 한 벡터 매개로 병원 균4,5에 영향을 보여왔다. Arthropod 미생물 eubacteria, archaea, 바이러스 및 원생 동물, 선 충, 곰 팡이6등 진 핵 미생물의 구성 됩니다. 그러나, 주된 연구 초점에 왔다 eubacteria 인해, 부분적으로, 마커 유전자와 특정 세균 회원을 식별 하기 위해 참조 데이터베이스의 가용성에.
Ixodes scapularis, 보렐 리아 burgdorferi7, 을 포함 한 여러 인간 병원 체의 진드기 벡터에 초점을 맞춘 Lyme 질병의 원인이 되는 대리인의 미생물 시각화 기술 최적화 겨냥 했다 벡터-병원 체 상호 작용의 맥락에서 틱 본질적인 microbiota의 우리의 이해를 향상. 틱 미생물 분야에 답변을 몇 가지 질문에 남아 있다. 용기는 진드기와 가로 옮겨진된 병원 체;의 맥락에서 들어오는 병원 체 사이 첫 번째 확장된 발생의 사이트 따라서, 벡터 본질적인 microbiota 변조 벡터-병원 체 상호 작용에서의 역할을 이해 하는 것은 의미 있는 통찰력 발표할 예정 이다. 진드기는 혈액 식사 소화, 혈액 식사 구성 요소 소요의 처리 장소8침의 독특한 모드. 창 자 루멘 겉보기 틱 피드로 혈액 식사를 포함 하는 그릇 역할 및 영양소 소화 및 동화 먹이의 몇 일 내내 찾다 후 반복 계속. 수 유 기간 동안 틱 인수 병원 균은 bloodmeal 함께 창 자 루멘을 입력 하 고 따라서 루멘 틱, 병원 체, 주민 microbiota 간의 상호 작용의 주 사이트 된다. 소화는 투입 및 Ixodid 틱 탈피를 통해 진행, 용기 구조 및 기능 변경9를 겪 습. 구성과 창 자가 박테리아의 공간 조직 변화 창 환경 콘서트에 다 것입니다. 그것은, 그러므로, 진드기, 병원 체, 본질적인 microbiota의 상호 작용을 완전히 이해 하 틱 용기에 있는 박테리아의 아키텍처를 이해 하는 것이 중요.
정기적으로 호스트 관련 microbiota를 설명 하기 위해 분자 기술을 높은 처리량 병렬 시퀀싱 전략10 증폭 하 고 세균의 16S ribosomal DNA (rDNA) 시퀀스를 사용 합니다. 이 시퀀싱 전략 포위 axenic 문화 특정 박테리아의 샘플에 표시 하는 모든 세균성 회원에 대 한 깊이 있는 설명을 제공 하는 필요. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 전략은 진실 fide 주민에서 환경 오염을 구별 하는 무 능력에 의해 혼동 됩니다. 또한, 수익률 샘플 크기가 작은 고 따라서 낮은 microbiota 특정 DNA를 포함 하는 틱 같은 평가 때 환경 오염 물질의 확대의 가능성 증가11 이며의 모호한 해석 결과 미생물 구성입니다. 특정 실행 가능한 박테리아의 시각화와 함께에서 기능적 특성, 따라서 것입니다 정의 하 고 일시적으로 그리고 공간에 진드기의 미생물을 분별 하는 중요 한. 이 목표를 향해 우리는 교 잡 제자리에 전체 산 RNA의 이용을 했다. 이 기술은 정기적으로 기관과 배아12,,1314 유전자 표현 패턴을 평가 하는 데 사용 되 고 관심의 전체 샘플에 식의 semiquantitative 분석을 허용 한다. 이 전통적인 제자리에서 교 잡 기술을 조직 단면도 활용 하 고 종종 전체 기관15식 예측 계산 어셈블리와 sectioned 물자의 광범위 한 분석을 필요로에서 다릅니다. 전체-마운트는 일반적으로 전체 유기 체12말합니다, 여기 전체 마운트 전체 용기 또는 장기를 말합니다. 틱 본질적인 microbiota의 아키텍처를 평가 하기 위해 교 잡 접근 제자리에 전체 산 RNA를 사용 하 여 장점은 가지각색입니다. 틱 용기 diverticula의 7 쌍 각 쌍 크기16에 다양 한 구성 되어 있습니다. 기능적 차이 하나이 diverticula 중 틱 생물학의 맥락에서 이해 되지 않는다 경우 틱 microbiota 또는 틱-병원 체 상호 작용. 용기 diverticula 파열 용기의 조작 microbiota 창 자 루멘 또는 느슨하게와 관련 된 본질적인 microbiota 공간 지 방화의 오해에 결과 치환 것 이다. 형광 표시 된 RNA 제자리에서 하이브리드는 이전 틱 용기 증명서17 고정 하 고 개별 용기 diverticula 프로브 교 잡 보장 B. burgdorferi 지역화 하 고 개방 하 여 검사 이용 되어 단면 전체 틱 파라핀 포함18녹취 록. 이러한 두 방법 모두 본질적인 microbiota 아키텍처에 영향을 미칠 것 이라고 교 잡 이전 틱 조직의 조작이 필요로 합니다.
이 보고서에서 우리가 자세히 설명 가능한 틱 본질적인 microbiota 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH)를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡의 사용 존재의 세계 이해 및 소화 관의 다른 지역에서 특정 창 자가 박테리아의 풍부 및 틱 용기 생물학 병원 체 식민의 맥락에서 새로운 통찰력을 박차 수 있습니다. 그리고 전송입니다. 또한, RNA 프로브 특정 세균 RNA에 대 한 감독의 사용 틱 용기에 실행 가능한 박테리아의 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&amp;nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(RNAse-free)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 RNA synthesis kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Water, RNase-free, DEPC-treated</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde, 37%</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA from torula yeast</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Heparin, sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt&#039;s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Blocking reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Levamisol hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chromogenic substrate for alkaline phosphatase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&#039;s solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Single stranded RNA ladder</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;#11 High-Carbon steel blades&amp;nbsp;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>ThermoScientific&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>VWR</td><td>DS-500E Digital Orbital shaker</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&amp;nbsp; documentation system</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Gel documentation system</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Bright-field Microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Light box</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Image capture software</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Image editing software&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr><tr><td>Automation compatible instrumentation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&amp;nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of microbiota in tick guts by whole-mount in situ hybridization

Arthropod 벡터 전송한 전염병 전세계 인간의 건강에 중요 한 위협 계속. 그들은 벡터; 식민지 때 이러한 질병을 일으키는 병원 균 격리에 존재 하지 않는 오히려, 그들은 가능성이 창 자 루멘에 상주 미생물과 상호 작용에 관여. 벡터 microbiota 여러 벡터 품 어진 질병을 위한 병원 체 전송에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 보렐 리아 burgdorferi 를 포함 하 여 여러 가지 인간 병원 체의 벡터 Ixodes scapularis 진드기의 용기에 거주 박테리아 틱 전송 병원 체의 영향 여부는 결정 되지 않습니다. 특성화 틱 용기에 잠재적인 interspecies 상호 작용의 더 나은 이해를 촉진 하기 위하여 틱 용기와 관련 된 박테리아의 구성에 대 한 방법을 요구 합니다. 제자리에 전체-마운트를 사용 하 여 특정 세균 종족과 관련 된 RNA 사본 시각화 하 교 잡 풍부에 관한 질적 데이터의 수집과 microbiota 그대로 조직에의 분포에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 틱 먹이의 과정을 통해 본질적인 microbiota 환경에 변화를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 틱 유전자의 표현 분석에 적용 될 수 있습니다. 3 차원 개조를 위한 필요 없이 조직에 대상 RNA의 총 공간 분포에 대 한 수익률 정보를 내장 전체 눈금의 얼룩이 지 고 덜 자주 confounds 시퀀싱 기반 환경 오염에 의해 영향을 자주 복잡 한 미생물 지역 사회를 공부 하는 데 사용 하는 방법. 전반적으로,이 기술은 벡터-병원 체-microbiota 상호 작용 및 질병 전송에 있는 그들의 역할을 이해 하는 더 나은 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다.

측정 및 RNA 프로브의 품질의 평가 얼룩이 지기 전에 중요 하다. 생체 외에서 전사 효율 높은 양과 DNA 템플렛의 품질에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 RNA 프로브 프로브 녹음 방송 반응에 의해 생성 된의 양과 순도 확인 하는 포름알데히드 젤에 시각. 프로브는 밝은, 개별 밴드 (그림 2)으로 표시 되어야 합니다. RNA 농도의 spectrophotometric 측...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization at JoVE.com

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

9.5K 조회수.  Yale University School of Medicine. 여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

비디오: Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

연구

유전학

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (mFISH) 및 방사선 조사 마우스의 스펙트럼 핵형 분석 (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

면역학 및 감염병학

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on mammalian hosts. In nature, this zoonotic bacterial pathogen may use a variety of reservoir hosts, but the white-footed mouse (Peromyscus leucopus) is the primary reservoir for larval and nymphal ticks in North America. Humans are incidental hosts most frequently infected with B. burgdorferi by the bite of ticks in the nymphal stage. B. burgdorferi adapts to its hosts throughout the enzootic cycle, so the ability to explore the functions of these spirochetes and their effects on mammalian hosts requires the use of tick feeding. In addition, the technique of xenodiagnosis (using the natural vector for detection and recovery of an infectious agent) has been useful in studies of cryptic infection. In order to obtain nymphal ticks that harbor B. burgdorferi, ticks are fed live spirochetes in culture through capillary tubes. Two animal models, mice and nonhuman primates, are most commonly used for Lyme disease studies involving tick feeding. We demonstrate the methods by which these ticks can be fed upon, and recovered from animals for either infection or xenodiagnosis.

Lyme disease is the most commonly-reported vector-borne disease in North America. The causative agent, Borrelia burgdorferi is a spirochete bacterium transmitted by Ixodid ticks. Transmission and detection of infection in animal models is optimized by the use of tick feeding, which we describe here.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Fluorescent Reporter 정량화를 통한 전체 장기 병원체 추적

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

저자 스포트라이트: Unraveling Bacterial Responses to Antibiotics and Immune System in Tissues(조직의 항생제 및 면역 체계에 대한 박테리아 반응 규명)

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에듀 염색에 의한 초파리 성인 난소에서 미토콘드리아 DNA 복제의 제자리 라벨에

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발

여러 형광에 의한 간 염색체 안정 수차의 검출

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)