Name: calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
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이 작품은 메리 E. Konkle와 마이클 A. Menze 국립 과학 재단 교부 금 체-160944에 의해 부분적으로 투자 되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>인간의 간세포 암 (HepG2) 셀 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 추가 기판 (10 mM 포도 당, 2 mM 글루타민 그리고 1 mM pyruvate)를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 유지 (5% CO 2 , 95% 공기, 습도 100%). 주: DMEM respirometry와 열 량에 대 한 이후 단계에서 참조 되는 경우 위의 DMEM 배합을 사용 합니다.</li>
	<li>1 x 106 세포 격판덮개 세포 100 m m 문화 접시와 subculture 그들 모든 7 일 또는 90 %confluency 도달 하기 전에 고 매체 마다 3-4 일 갱신.</li>
	<li>세포는 60-80% 합칠 때 실험을 수행 합니다.</li>
</ol>2입니다. 준비의 Respirometer 및 열 량 계
<ol><li>Respirometer 챔버로 DMEM의 2.2 mL를 피펫으로 완벽 하 게, 마 개를 삽입 하 고 스 토퍼 공백 도구 보통 공기에서 최적의 산소 보급 수 있도록 조정.</li>
	<li>저 어 지속적으로 37 ° C에서 산소 농도 (블루 추적) 및 산소 유량 (빨간 추적) 안정 될 때까지. Respirometer의 소프트웨어 실험에 사용 된 매체의 산소 용 해도 담당 하도록 프로그래밍 되어 있는지 확인 합니다. 참고: 다른 미디어는 다른 산소 용 해도 계수 (예를 들어, DMEM 0.92 =).</li>
	<li>DMEM 챔버 열기와 산소 농도의 안정화, 후 산소 농도 추적의 안정적인 부분을 선택 하 고 100% 공기 포화에 대 한 그것을 교정.</li>
	<li>0% 산소 산소 챔버에 존재 하는 때 산소 농도 추적의 안정적인 부분을 선택에 대 한 보정 수 있습니다. 20 µ L 적정 230 m m 나트륨 dithionite 또는 모든 산소는 실험의 끝에 생물학 견본에서 사용 후 후이 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>respirometer의 100% 공기 교정 후 마 개를 닫고 챔버에 아무 거품이 있는지 확인. 참고: 산소 유량에 약간의 증가 감지 됩니다 폐쇄 실에서 polarographic 산소 센서로 (POS)는 산소 부분 압력을 측정 하기 위해 산소를 소비 한다.</li>
	<li>폐쇄 되 고 스 토퍼의 ~ 10 분, 후 안정 산소 유량을 관찰 하 여는 respirometer HepG2 세포에 대 한 준비 되는지 확인 합니다. 참고: 여기에 사용 된 열 량 계 스테인리스 ampules 활용 하며 한 용액을 참조로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>열 량 계에의 참조 용액에 H2O (dH2O)의 [샘플 (단계 4)와 같은 볼륨] 2.5 mL를 추가 하 고 필요한 경우 펜을 사용 하 여 모자를 조입니다. 공기 흐름이 봉인된 용액을 청소 하 고 천천히 열 량 계에의 참조 채널 1 위치에 용액을 낮은. 생물학 견본 준비 될 때까지 위치 1에 남아 있다.</li>
</ol>3. Respirometry와 열 량에 대 한 HepG2 세포의 준비
<ol><li>Respirometer 고 열 량 계 준비 및 보정을 확인 합니다. 따뜻한 DMEM 그리고 물 욕조에 37 ° C에 트립 신.</li>
	<li>DMEM CO2 와 온도 대 한 매체의 평형 수 있도록 인큐베이터에서 신선한 100 mm 접시를 추가 합니다. 참고:이 매체 주사 실험에 대 한 적절 한 볼륨 ampules 사용 될 수에 따라 달라 집니다 그래서 사용 됩니다.</li>
	<li>세포는 60-80% 합칠, 다음 세척 100 mm 접시 2 x 10 mL 실내 온도 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 거꾸로 가벼운 현미경으로 확인 합니다.</li>
	<li>셀의 100 mm 접시에는 37 ° C trypsin의 3 mL를 추가 하 고 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 7-10 분 동안 그들을 품 어. 37 ° C DMEM의 3 mL와 트립 신을 무력화 하 고 부드럽게 5 mL를 피펫으로와 ~ 20 번 pipetting으로 일시 중단.</li>
	<li>DMEM trypsin resuspended 셀 6 mL 균 15 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 액체를 제거 하는 175 x g.에서 5 분 동안 원심.</li>
	<li>DMEM 피펫으로 철저 하 게 셀 수 있도록 그것은 충분히 다른 해리의 ~ 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>잘 혼합된 샘플의 ~ 100 µ L을 제거 하 고 모든 8 필드 셀의 총 수를 결정 하려면 hemocytometer 이용 하 여 철저 한 세포 수를 수행 합니다. 다음 ~ 50 µ L 당 106 세포 x 2를 생성 하기 위해서는 물의 resuspension의 셀에 대 한 볼륨을 계산 합니다. 참고: 이렇게 하면 2 x 106 세포 최소한의 중간 변위와 respirometer의 각 챔버에 추가 됩니다.</li>
	<li>원심 175 x g. Resuspend에서 5 분에 대 한 셀에 계산 된 DMEM 단계 3.7에서에서 펠 릿.</li>
	<li>상공 회의소 (이 ~ 50 µ L를 해야) respirometer에서 당 2 × 106 셀을 삽입 하는 데 필요한 볼륨을 결정 하는 세포 수를 수행 합니다. 준비까지 얼음에 respirometric 측정에 대 한 셀을 저장 합니다.</li>
	<li>얼음에 집중된 셀 예제를 실행 하는 동안은 주사에 대 한 1 x 105 셀/mL의 농도 생산 하는 데 필요한 희석을 결정 합니다.</li>
	<li>샘플을 잘 혼합 하 고 각 용액에 대 한 1 x 105 셀/mL DMEM에에서 세포의 3 mL를 준비. 참고: 샘플 희석 사용 DMEM equilibrated 중간 단계 3.3에서에서 준비 해야 합니다.</li>
</ol>4입니다. 열 량
<ol><li>µW에서 열 신호는 관찰 가능 하 고 안정적인 열 량 계는 컴퓨터에 연결 되어 확인 하십시오.</li>
	<li>1 x 105 셀/mL (~2.5 x 105 셀)에 각 용액을 추가 하는 셀의 2.5 mL, 충분 한 공기를 보장은 용액의 뚜껑과 가스 보급 수 있도록 매체 사이.</li>
	<li>즉시 뚜껑, 펜을 사용 하 여 필요한 경우 조입니다. 어떤 외부 이물질 제거를 공기를 사용 하 여 봉인된 용액, 깨끗 하 고 천천히 낮은 열 량 계 1를 용액. 용액은 1 위치를 하향 조정 하는 시간을 기록 합니다.</li>
	<li>허용 15 분 동안 1 위치에 앉아 용액. 참고:이 분 동안 respirometer (5 단계)에 주입 하는 세포입니다. 이렇게 하면 CR 비율을 결정 하는 때 동일한 시간 간격 열 생산 및 산소 소비에 대 한 사용.</li>
	<li>위치 1에서 15 분 후 천천히 2 위치로 참조 및 샘플 ampules 낮은. ampules 인하 했다 시간 그리고 30 분 이상 측정 기록.</li>
</ol>5입니다. respirometry
<ol><li>용액은 열 량 계에서 위치 1에 15 분 간격 동안 respirometric 연구를 시작 합니다.</li>
	<li>철저 하 게 균질 성 해결책을 확인 하 고 주사를 pipetting 셀 샘플 혼합 < 50 µ L ~ 2 x 106 셀/챔버의 최종 농도 대 한 respirometer의 각 챔버에 세포 샘플의. 세포는 respirometer에 주입 하는 시간을 기록 합니다.</li>
	<li>주입 후 HepG2 세포는 지속적으로 내면서 37 ° c. 산소 유량과 산소 농도 있는 꾸준한 감소의 두 안정화를 위해 적어도 20-30 분을 기다립니다.</li>
	<li>화면 오른쪽에 V 당 O2 플럭스 탭을 선택 하 고 산소 유량의 안정적인 부분을 강조. 상표, 다음 통계 및 O2 플럭스 V 당에 대 한 기록 데이터를 선택 합니다. 이 녹음은 CR 비율의 계산에 사용 됩니다. 참고: 5.5 및 5.6 단계는 선택적 이다. 누출 호흡과 최대한 uncoupled 호흡 oligomycin FCCP의 titrations에 의해 계시 될 것 이다.</li>
	<li>각 챔버에 4 mg/mL oligomycin의 1 µ L를 주사 하 고 허용 ~ 산소 유량 안정화를 위한 10 분. 다음 단계에 의해 기록 안정적인 누설 호흡 률 5.4 oligomycin 추가 후 산소 유량 추적의 안정적인 부분을 강조 표시 하 여 수행.</li>
	<li>2 µ L 주사 0.2 m m FCCP 각 챔버에 각 주입 후 산소 유량 안정화에 대 한 수의 적정 후속 FCCP 적정에 약간의 감소에 의해 표시 된 최대 유량에 도달할 때까지 titrations 계속. 최대 유량 중 안정 된 호흡 속도 기록 합니다.</li>
</ol>6입니다. Calorespirometric 비율의 계산
<ol><li>샘플에서 최종 셀 수 수행 ~ 1 x 105 셀/mL 용액 (2.5 mL)에 추가 하는 셀의 총 수를 결정 하려면 hemocytometer의 모든 8 분야 활용.</li>
	<li>열 량 계 및 respirometer는 안정적인 신호는 동일한 시간에 모두에서 기록 측정 시간을 결정 합니다. 참조에 용액은 위치 2와는 respirometer로 세포의 주사의 시간으로 낮 췄 다 때 기록입니다.</li>
	<li>µW/백만 셀으로 표현 단계에서 결정 하는 시간에 존경 받는 용액에 대 한 열 출력을 표시 하는 추적 위에 커서를 배치 하 여 열 생산을 기록 합니다. 산소 소비 데이터를 수집 하 고 그것 pmol O2의 -1 백만 셀 x x로 표시 됩니다 확인 합니다.</li>
	<li>CR 비율을 계산 하려면 먼저 kJ/s, µW를 변환 하 고 kJ/mol O2로 CR 비율을 O2/s의 mol에 kJ/s를 나눕니다. 참고: CR 비율 kJ/mol O2에 표시 됩니다. ( <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">보충 파일 1</a>참조)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gnaiger, E., Kemp, R. 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저자는 공개 없다.

Calorespirometry의 목적은 양적 호 기성 및 혐 기성 경로 신진 대사 활동에의 기여를 평가 하 고 세포 에너지 플럭스의 복합 보기를 얻을 것입니다. 이것은 방열 및 산소 유량 상응 이론 oxycaloric와 계산 된 CR 비율의 비교에서 뒤의 동시 측정에 의해 수행 됩니다. 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 데이터에 대 한 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 살 균, 건강 한 세포 배양의 정비는 중요 한 이다. ...

생물 학적 시스템, 물질 대사 도중 열 릴리스 또는 엔 탈피 변화는 일반적으로 중 하나를 직접 모니터링 (통해 직접 열 량) 또는 O2 소비 및 CO2 생산 (respirometry)를 통해 통해 간접적으로. 불행히도,이 기술은 격리에 사용 되는 경우 중요 한 정보 혐 기성 경로 세포질 물질 대사에의 기여 등 손실 됩니다. Calorespirometry 열 분산 및 호흡의 동시 측정에 의존 하는 강력한 기술입니다. 완전히 산소 포유류 세포에 있는 혐 기성 물질 대사를 조사 하 고 호 기성 및 혐 기성 경로 변형된 세포에도 불구 하 고 에너지 항상성의 동시 기여 시연 calorespirometric 작업을 개척 한 완전히 산소 환경1. Calorespirometry 이후 다양 한 생물학 질문에 적용 되었습니다. 몇 가지 예로 동물 너 지론 낮은 산소 수준에서의 연구, bivalves, 지구 생물의 물질 대사 그리고 유기 토양 문제2, 의 미생물 분해의 아가미에 제 초 제와 에스트로겐의 효과 3 , 4 , 5 , 6. 또한, calorespirometry는7세포 동결 전에 계시 어떻게 대사 늘어진 포유류의 cryopreservation 향상. 각 접근, 열 량 및 respirometry는 독립적으로 세포질 organismal 생체의 우리의 지식을 증가. 그러나, calorespirometry를 사용 하 여 응답 될 수 있다 기본적인 생물 학적 질문 상대적으로 미개척 남아 있습니다.
헤스의 법칙 반응의 총 엔 탈피 변화는 초기 및 최종 상태 사이의 통로의 독립을 주장 한다. 예를 들어, 생 화 확 적인 통로 총 엔 탈피 변화 통로 내의 모든 반응의 엔 탈피 변화의 합계입니다. 열 량 둘 다 호 기성 및 혐 기성 경로 감지 하는 무차별 세포 열 생산을 측정 하기 위한 실시간 방식을 제공 합니다. 이것은 에너지가 실험 용액8의 벽을 통해 서를 제외 하 고 시스템에서 교환 되는 재단을 기반으로 합니다. 방열에 변화는 변화는 용액에서 모든 대사 반응에서 발표 하는 엔 탈피와 동일. 따라서, 부정적인 엔 탈피는 시스템에서의 열 손실에 상관 한다. 지난 4 년간 철저 한 연구 놓을 anabolism의 열역학 풍경을 특징 있다. 이것은 꾸준한 상승 검색어 "생물학" 및 "열 량"으로 여는 미국 국립 도서관 의학 (NLM) 건강의 국가 학회 (PubMed)에서 색인 아래 연구 기사에 의해 표시 됩니다. 검색 계시는 1970 년 이전 총 27 간행물 참조 생물학적 주사; 한편, 2016 년 혼자, 546 간행물 기술을 활용.
열 메서드는 열 생산을 결정 하기 위해 설립. 그러나, 더 많은 유연성은 respirometric 값을 확인 하기 위해 부여 됩니다. Respirometric 측정 O2, CO2또는 O2 와 CO2모두 구성할 수 있습니다. 또한, O2 또는 CO2 의 측정 optrodes, 클라크-유형 전극, 가변 다이오드 레이저 흡수 분광학7,,910 등 다양 한 기법에 의해 달성 될 수 있다 11. CO2 생산은 많은 respirometric 연구에 귀중 한 통계, 경작된 한 세포에 대 한 중간 종종 pH 제어12,13bicarbonic 버퍼 시스템을 사용 합니다. 합병증을 피하기 위해 CO2 측정의 중 탄산염 시스템에서 문화에 있는 세포의 calorespirometry에 대 한 다음과 같은 프로토콜 respirometric 매개 변수는 단독으로 O2 를 사용 합니다.
산소 유량을 측정 하 여 동시, 특정 respirometers ( 재료의 표참조)는 미토 콘 드 리아 기능의 상세한 평가 대 한 설계 되었습니다. 기판-uncoupler-억제제-titrations (정장) 프로토콜 잘 설립 하 고 실험 막 잠재적인 또는 반응성 산소 종 (선생님) 형성14를 측정 하도록 설계 되어와 호환 됩니다. 그대로 셀의 calorespirometry에 대 한 제시 프로토콜 카보닐기 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) 등 F0F1-ATP synthase 억제제 oligomycin 화학 uncouplers의 소개와 호환 됩니다. FCCP의 추가 통해 산소 소비 미토 콘 드 리아 성능15에 잠재적인 치료의 영향을 평가 하기 위해 유용한 ATP 생산에서 결합 수 있습니다. 또한, oligomycin의 추가 누출 호흡의 정도 조명 했다. 따라서, calorespirometry 동안 수행 respirometric 측정 더 미토 콘 드리 아 생리학을 명료 하 게 하도록 설계 된 광범위 한 프로토콜와 호환 됩니다.
방열 및 산소 유량의 동시 측정 calorespirometric (CR) 비율의 계산에 대 한 수 있습니다. 이 비율은 손 튼의 상수 또는 이론적인 oxycaloric,-430-480 kJ mol-1 셀 선 또는 관심의 조직에 따라 하 고 보충된 탄소 기판1, 사이 범위에 비해 다음은 16. 따라서, 더 많은 부정적인 CR 비율 전반적인 신진 대사 활동을 증가 기여 혐 기성 경로에서 보여준다. 예를 들어 작업의 활성 성능 없이 일상적인 근육 조직 호흡에 대 한 CR 비율-468 kJ mol-1 범위 내에 이론적인 oxycaloric 동등한17,18의-448에서 배열 한다. 한편, 높은 포도 당에 있는 매체에서 경작 된 포유류 세포 분해를 수행 하는 향상 된 젖 산 발효를 표시 하 고 상대적으로 낮은 미토 콘 드 리아 참여19. -800 kJ mol-1, 더 많은 부정적인 CR 비율1,7에 의해 표시 된 세포질 물질 대사에 혐 기성 경로의 높게 한 참여를 보여주는에-490의 범위에서 CR 비율에서이 표현 형 결과 16,20.
상업 기도 하 고 비영리 세포 및 조직 유통 업체 현재 약 4000 셀 라인 150 종 이상 제공 셀 라인에서에서 파생 된 인간. 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 많은 방해할 수 있습니다 직접 또는 간접적으로 미토 콘 드 리아 기능 잠재적인 치료제의 독성을 평가 하기 위한 편리한 도구입니다. 약물 검사 하는 동안 변환 된 셀을 사용 하 여 있을 수 있습니다 제한 된 예측 값의 부분에 바르 부르 크 효과, 많은 암의 특징 때문에. 종종, 암 기질 수준 인 산화에서 ATP를 생성 하 고 완벽 하 게 호 기성 조건19mitochondrion 종사 하지 않고 젖 산의 생산을 통해 산화 환 원 균형을 유지. 제약 개발 악명 비용이 많이 드는 이며 비효율적 시장 승인21달성에 실패 하는 인간 임상 시험에서 테스트 9 화합물에서 약 8. 잠재적인 치료제는 셀 라인에서 낮은 세포 독성으로 인해 초기 심사를 통과할 수 있습니다, 하는 동안 이러한 화합물 중 일부 mitotoxic는 가능 하다. 어떻게 이러한 독 소는 바르 부르 크 효과 표시 하지 않는 1 차 셀의 에너지 균형을 손상 할 수 있다을 감지 하는 적합 한 메서드, 없이 중요 한 정보는 종종 bottlenecking 초기 단계에 치료 개발-보였다.
Calorespirometry 생물 학적 샘플, 세포와 조직 등의 다양 한 신진 대사 활동을 분석 하는 실용적, 비 침 투 적인 접근 이다. 제시 프로토콜의 핵심 응용 프로그램의 범위와 호환 됩니다. 그러나 한 합병증,, 발견 되었습니다. 불멸 하 게 세포 보충 잠재적인 mitotoxins22, 세포를 민감하게 하기 위하여 에너지 생산을 위한 산화 인 산화 (OXPHOS)의 기여를 증가 시키는 갈 락 토스와 포도 당 자유로운 매체에 자주 교양 23. 이 대사 프로그래밍 샘플15열 량 계 사용 하는 스테인리스 ampules에 놓으면 분석을 보이지 않게 하기 위해 나타납니다. 세포 포도 당 매체에 경작 몇 시간 동안 높은 신진 대사 활동에 종사 계속 합니다. 한편, 갈 락 토스 매체에 경작 된 세포 용액, 초기 실험 시간 포인트를 제한 하는 측정에 그들의 배치의 30 분 이내 열 생산 감소. 이 문제는 불행 하 게도, 그들의 세포질 확산을 평가 하기 위해 기회를 방해. 이 특정 제한에도 불구 하 고 대부분 응용 프로그램은 호환 calorespirometric 분석 하 고이 접근을 통해 상세한 변화 정보를 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HepG2 Cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HB-8065</td><td>Cells used for calorespirometry</td></tr><tr><td>O2k-Respirometer</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>Respirometer</td></tr><tr><td>LKB 2277 thermal activity monitor (TAM)</td><td>Thermometric AB</td><td></td><td>Thermometric was purchased by TA Instruments</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate (100 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>100x solution added to DMEM medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Added to 10% in DMEM medium</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0.25%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td>Cell dissociation reagent</td></tr><tr><td>Oligomycin from &lt;em&gt;Streptomyces diastatochromogenes&lt;/em&gt;</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>O4876</td><td>Mitochondrial Inhibitor</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Mitochondrial Uncoupler</td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td><td>Corning Corporation</td><td>430167</td><td>Tissue culture dish</td></tr><tr><td>Glucose, powder</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>Glucose for DMEM medium</td></tr><tr><td>Galactose, powder</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td><td>Galactose for DMEM medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Glutamine for DMEM medium</td></tr><tr><td>DMEM, no glucose</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11966025</td><td>Cell culture medium</td></tr></tbody></table>

calorespirometry: a powerful, noninvasive approach to investigate cellular energy metabolism

기본적인 생물 학적 및 생물 의학 연구에 사용 하는 많은 세포 선 둘 다 호 기성 및 혐 기성 호흡의 결합을 통해 에너지 항상성을 유지 합니다. 그러나,는 두 경로 세포 에너지 생산의 풍경에 기여 하는 정도 지속적으로 간과. 변형 된 세포 포도 당 레벨을 자주 포화에 교양 산화 인 산화 기질 수준 인 산화의 증가 의해 보상 된다 ATP 생산에 감소 종속성을 표시 합니다. 대사 균형에 있는이 교대는 미토 콘 드 리아 독 소의 존재에도 불구 하 고 증식 하는 세포 수 있습니다. 변환 된 셀의 변경 된 대사 균형, 무시에 제약 심사 결과 이후는 잘못 해석 될 수 있는 잠재적으로 mitotoxic 효과 수 있습니다 감지 되지 않을 높은 포도 당 존재 교양된 모델 셀 라인을 사용 하 여 농도입니다. 이 프로토콜은 두 개의 강력한 기술, respirometry 및 세포질 ATP 생산을 둘 다 호 기성 및 혐 기성 공헌의 양적 및 비 침 투 적인 평가 대 한 허용 하는 열 량의 페어링 설명 합니다. 호 기성 및 혐 기성 호흡 모니터링 을 통해 주사 될 수 있는 열을 생성 합니다. 한편, 산소 소비 속도 측정 하는 것은 호 기성 호흡의 정도 평가할 수 있습니다. 열 소비, 산소 소비와 동시에 측정은 때 calorespirometric 비율을 확인할 수 있습니다. 실험적으로 얻은 값 상응 이론 oxycaloric에 비해 다음 수 그리고 혐 기성 호흡의 정도 재판 될 수 있다. 따라서, calorespirometry 다양 한 약물 개발, 미생물 성장, 및 normoxic 및 hypoxic 조건 모두에서 기본적인 생체를 포함 하 여 생물학 질문을 분석 하는 독특한 방법을 제공 합니다.

Calorespirometric 측정의 재현성은 적절 하 고 일관 된 샘플 준비에 따라 달라 집니다. 샘플에서 세포 배양 준비 해야 사용할 수 없습니다 경우 접시는 자란 셀 카운트 응집으로 인해 정확 하지 않은 될 수 있습니다. 또한, 감소 된 열 흐름 이멀전의 셀에 제한 된 기판 확산으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 부착 셀을 사용 하 여, 60-80% 사이 confluency와 접시를 선택 하 고 매체 실험 전에 24 h 변경 긴?...

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Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

이 프로토콜 calorespirometry, 방열 및 에너지 대사를 평가 하는 비 침범 성 접근을 제공 하는 호흡의 직접 및 동시 측정에 설명 합니다. 이 기술은 총 세포 에너지 흐름을 모니터링 하 여 호 기성 및 혐 기성 경로 에너지 사용률에의 기여를 평가 하는 데 사용 됩니다.

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

calorespirometry-powerful-noninvasive-approach-to-investigate

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K 조회수.  University of Louisville. 이 프로토콜 calorespirometry, 방열 및 에너지 대사를 평가 하는 비 침범 성 접근을 제공 하는 호흡의 직접 및 동시 측정에 설명 합니다. 이 기술은 총 세포 에너지 흐름을 모니터링 하 여 호 기성 및 혐 기성 경로 에너지 사용률에의 기여를 평가 하는 데 사용 됩니다.

비디오: Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

연구

발생학

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in understanding the role of mitochondrial function in obesity, diabetes, aging, cancer, cardiovascular function and safety toxicity.
Cellular metabolism is the process of substrate uptake, such as oxygen, glucose, fatty acids, and glutamine, and subsequent energy conversion through a series of enzymatically controlled oxidation and reduction reactions. These intracellular biochemical reactions result in the production of ATP, the release of heat and chemical byproducts, such as lactate and CO2 into the extracellular environment.
Valuable insight into the physiological state of cells, and the alteration of the state of those cells, can be gained through measuring the rate of oxygen consumed by the cells, an indicator of mitochondrial respiration - the Oxygen Consumption Rate - or OCR. Cells also generate ATP through glycolysis, i.e.: the conversion of glucose to lactate, independent of oxygen. In cultured wells, lactate is the primary source of protons. Measuring the lactic acid produced indirectly via protons released into the extracellular medium surrounding the cells, which causes acidification of the medium provides the Extra-Cellular Acidification Rate - or ECAR.
In this experiment, C2C12 myoblast cells are seeded at a given density in Seahorse cell culture plates. The basal oxygen consumption (OCR) and extracellular acidification (ECAR) rates are measured to establish baseline rates. The cells are then metabolically perturbed by three additions of different compounds (in succession) that shift the bioenergetic profile of the cell.
This assay is derived from a classic experiment to assess mitochondria and serves as a framework with which to build more complex experiments aimed at understanding both physiologic and pathophysiologic function of mitochondria and to predict the ability of cells to respond to stress and/or insults.

A description of a method for profiling mitochondrial function in cells is provided. The mitochondrial profile generated provides four parameters of mitochondrial function that can be measured in one experiment: basal respiration rate, ATP-linked respiration, proton leak, and reserve capacity.

C2C12 Myoblast 세포를 사용하여 Bioenergetic 프로필 실험

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

생물학

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

면역학 및 감염병학

<meta charset="utf8"></head><body>에탄올은 글루타민 의존 호흡으로 전환하여 AM 생체 에너지를 손상시킵니다.

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

Alveolar macrophages (AMs) are the first line of cellular defense in the lower airway against pathogens. However, chronic and excessive alcohol use impairs the ability of AMs to phagocytize and clear pathogens from the alveolar space, in part through dysregulated fuel metabolism and bioenergetics. Our prior work has shown that chronic ethanol (EtOH) consumption impairs mitochondrial bioenergetics and increases lactate levels in AMs. Further, we recently demonstrated that EtOH increases glutamine dependency and glutamine-dependent maximal respiration while decreasing flexibility, shifting away from pyruvate-dependent respiration and towards glutamine-dependent respiration. Glutaminolysis is an important compensatory pathway for mitochondrial respiration when pyruvate is used for lactic acid production or when other fuel sources are insufficient. Using a mouse AM cell line, MH-S cells, exposed to either no EtOH or EtOH (0.08%) for 72 h, we determined the dependency of mitochondrial respiration and bioenergetics on glutamine as a fuel source using an extracellular flux bioanalyzer. Real-time measures were done in response to bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) ethyl sulfide (BPTES), an inhibitor of glutaminase 1, which prevents the enzymatic conversion of glutamine to glutamate, in media vehicle or in response to vehicle alone, followed by testing mitochondrial stress. The step-by-step protocol provided herein describes our methods and calculations for analyzing average levels of glutamine-dependent basal mitochondrial respiration, mitochondrial ATP-linked respiration, maximal mitochondrial respiration, and mitochondrial spare respiratory capacity across multiple biological and experimental replicates.

<meta charset="utf8"></head><body>Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

Alcohol misuse impairs alveolar macrophage (AM) immunity due to suppressed mitochondrial respiration and bioenergetics. We recently demonstrated that ethanol (EtOH) exposure increases glutamine dependency for mitochondrial respiration in AMs. Herein, methods are provided to determine the usage of glutamine for mitochondrial respiration in EtOH-treated AMs using an extracellular flux bioanalyzer.

Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

Alveolar macrophages (AMs) are the first line of cellular defense in the lower airway against pathogens. However, chronic and excessive alcohol use ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Development of a Mobile Mitochondrial Physiology Laboratory for Measuring Mitochondrial Energetics in the Field

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to investigate metabolic capability. To obtain the measures of mitochondrial respiration, fresh biological samples must be used, and the entire laboratory procedure must be completed within approximately 2 h. Furthermore, multiple pieces of specialized equipment are required to perform these laboratory assays. This creates a challenge for measuring mitochondrial respiration in the tissues of wild animals living far from physiology laboratories as live tissue cannot be preserved for very long after collection in the field. Moreover, transporting live animals over long distances induces stress, which can alter mitochondrial energetics.
This manuscript introduces the Auburn University (AU) MitoMobile, a mobile mitochondrial physiology laboratory that can be taken into the field and used on-site to measure mitochondrial metabolism in tissues collected from wild animals. The basic features of the mobile laboratory and the step-by-step methods for measuring isolated mitochondrial respiration rates are presented. Additionally, the data presented validate the success of outfitting the mobile mitochondrial physiology laboratory and making mitochondrial respiration measurements. The novelty of the mobile laboratory lies in the ability to drive to the field and perform mitochondrial measurements on the tissues of animals captured on site.

We designed and constructed a mobile laboratory to measure respiration rates in isolated mitochondria of wild animals captured at field locations. Here, we describe the design and outfitting of a mobile mitochondrial laboratory and the associated laboratory protocols.

현장에서 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위한 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실 개발

Mitochondrial energetics is a central theme in animal biochemistry and physiology, with researchers using mitochondrial respiration as a metric to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.

Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

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호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

고해상도 호흡율은 투과성이 그대로 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

현장에서 미토콘드리아 에너지를 측정하기 위한 이동식 미토콘드리아 생리학 실험실 개발

챔버 및 플레이트 기반 호흡계를 사용하여 세포 및 조직의 생물 에너지를 평가하기위한 고해상도 호흡 측정법