이러한 방법은 차세대 시퀀싱 및 유동 세포측정 이미징 분석을 통합합니다. 그것은 흥미로운 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다., 일부 표현 변경 연루 여부, 대신 전사, 특히 오염 물질 노출 환경에서. 이 간단한 방법의 주요 장점은 생물학적으로 중요한 단백질의 지역화를 측정하여 기능적 수준에서 주요 차등 유전자 발현의 결과를 해석하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 의미는 병리학적 및 독성 결과의 진단으로 확장됩니다. 일반적인 심조 접근법으로서, 예측은 유전자 발현을 단백질 기능에 연결하는 능력을 갖는다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 화상 진찰 및 전사 분석의 높은 기술적인 요구 때문에 투쟁할 것입니다.
인간 단세포 유래 수지상 세포 라이브러리를 서열화하기 위해, 먼저 시퀀싱 및 인덱싱 시약 랙에 시퀀싱 및 인덱싱 시약을 각각 로드하고, 모든 얼음이 녹을 때까지 실험실 급수 욕조에 랙을 1시간 동안 배치하고, 시약은 철저히 혼합된다. 시약이 해동하는 동안 시퀀서의 전원을 켜고, 컴퓨터를 네트워크 드라이브에 연결하고, 이젝트 금지 드라이브가 나타날 때 네트워크 드라이브에 연결하고 시퀀서 제어 소프트웨어를 시작합니다. 다음으로, 시퀀싱 생합성 시약 랙의 각 병에 약 100 밀리리터의 유지 보수 세척 솔루션을 추가하고 깔때기 캡을 각 병에 나사로 넣습니다.
인덱싱 시약 랙의 각 15 밀리리터 원모형 튜브에 약 12밀리리터의 유지 보수 세척 솔루션을 추가하고 캡을 폐기합니다. 그런 다음 두 랙을 시퀀서에 로드합니다. 시퀀서 제어 소프트웨어 내에서 유지 보수 세척을 선택하고 시퀀서 유체 시스템을 청소하는 지침을 따릅니다.
손전등을 사용하여 차선을 통과하는 거품의 흐름 셀을 시각적으로 검사하여 누출이 없는지 확인합니다. 세척 순서가 완료되면 시퀀스 탭을 열고 새 실행을 시작하여 출력 데이터를 네트워크 드라이브로 안내합니다. 다중 해제를 위해 샘플 시트를 업로드하고 적절한 시약 정보를 입력합니다.
사용 된 흐름 셀을 사용하여 시퀀싱 시약을 사용하여 시스템을 프라임합니다. 클러스터 생성이 완료되면 흐름 셀을 제거합니다. 그리고 가볍게 물로 세포를 스프레이.
렌즈 종이로 흐르는 셀건조를 닦은 다음 95%에탄올이 있는 가벼운 스프레이를 뿌립니다. 유동 셀을 다시 닦은 후, 유동 셀의 표면을 빛에 대 고 확인 하 고 이물질이나 소금 잔류물 없이 깨끗 한 있는지 확인 합니다. 프라임 단계가 완료되면 클러스터된 유동 셀을 로드하고 시퀀싱을 시작합니다.
시퀀스 분석 뷰어 소프트웨어가 자동으로 시작됩니다. 약 26시간 후, 고시퀀스 제어 소프트웨어를 통해 시퀀싱 데이터 품질을 모니터링하고 분석 뷰 소프트웨어를 시퀀싱하여 데이터 품질을 평가하고 문제 해결을 모니터링합니다. 이어서, 시퀀스가 끝나면, 유동셀 개스킷을 변경하고, 다음 실행을 시작하기 전에 유지 보수 세척을 수행한다.
오염물질-노출된 수지상 세포의 유동 세포 측정 영상 후, ImageJ 피지를 열고, 치료군에 따라 비노출 및 오염물질-오염물질-노출된 인간 수지상 세포 샘플 그룹에 대해 저장된 100개의 세포 이미지를 병합한다. 두 집단 내에서 CD1d 및 Lamp1 colocalization을 분석하려면 오염 물질 에 노출된 100개의 병합된 셀 이미지를 열고 이미지, 색상 및 분할 채널을 선택하여 채널을 당 단일 플루오로포어로 두 개의 개별 이미지로 이미지를 분할합니다. 공동화된 픽셀의 분산 플롯을 만들려면 분석, 공동 현지화 및 공동 화 임계값을 선택하고 인쇄 화면을 눌러 분산 플롯을 저장합니다.
각 단일 셀룰러 이미지에 대한 Mander의 지역화 계수를 계산하려면 타원형 선택 도구를 사용하여 분할 채널이 있는 이미지 파일의 단일 셀 이미지를 선택하고 분석, Colocalization 및 Colocalization 임계값을 다시 선택합니다. 그런 다음 관심 영역의 대화 상자에서 채널 1을 선택하고 확인을 클릭합니다. 계수가 모든 100개의 셀 이미지에 대해 계산된 경우 결과를 적절한 스프레드시트로 가져오고, 비노출된 셀 샘플 제어를 위한 분석을 반복한다. RNA 염기서열 분석 및 전사 데이터 분석을 사용하여 지질 대사 및 내세포 기능을 포함한 여러 가지 주요 변경 된 유전자 클러스터가 오염 물질 노출 DC에서 확인되었습니다.
개별 세포 영상 수준에서 HLADR 양성 CD11c 양성 수지상 세포는 CD1d 및 Lamp1 공동발현에 따라 게이트될 수 있다. 제어 비 노출 수지상 세포는 최소한의 CD1d 및 Lamp1 단백질 colocalization화를 나타내며, 이는 CD1d 내막 인신 매매의 기저 수준을 나타내고, 생리적 조건 하에서 높은 수준의 표면 발현을 나타낸다. CD1d는 오염 물질 노출 수지상 세포의 늦은 내세포 구획에서 유지되는 반면, 이 실험적인 세포 집단에 있는 변경한 내낭성 유전자 단면도를 확인합니다.
개별 셀룰러 이미지를 단일 이미지 파일로 병합한 후, 개별 이미지는 형광식에 따라 분할될 수 있으며, 두 채널 간의 픽셀 강도의 공존화는 분산 플롯에서 시각화될 수 있다. 두 치료 군에서 CD1d와 Lamp1 단백질 사이의 코현지화 정도는 Mander의 계수를 사용하여 정량화 될 수 있습니다. 단백질 강도가 지역화 영역과 비지역화된 영역 간의 이질적인 경우, 지역화된 강도는 지역화 부위와 평행하지 않으므로 픽셀 강도에 기초하여 두 단백질의 공동 현지화를 더욱 평가하는 것도 중요하다.
일단 마스터되면, 각 기술이 제대로 수행되는 경우, 2시간 안에 화상 분석을 완료할 수 있고, RNA 시퀀싱 설정을 3시간 안에 완료할 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 시약이 올바른 위치에 올바르게 로드되고 시퀀서에 누출이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 마이크로 RNA, 엑소메 또는 마스트 세포 염기서열분석과 같은 다른 방법은 각각 글로벌 마이크로 RNA 발현, 유전자 돌연변이 또는 DNA 메틸화에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.
그래서 개발 후, 이 기술은 세포 화상 진찰 분석의 필드에 있는 연구원을 도울 것입니다, 그리고 차세대 순서는 유전자 발현 및 단백질 기능에 환경 오염 물질의 효력을 탐구하기 위하여. 이 비디오를 시청한 후에는 차세대 시퀀싱을 설정하는 방법과 단백질 합리화의 이미저 분석을 잘 이해해야 합니다. 인간의 혈액 샘플에서 독성 오염 물질 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있음을 잊지 마십시오.
화학 연기 후드 및 개인 보호 장비를 사용하는 것과 같은 예방 조치는 이러한 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.
